Assim como a presença ou ausência de fungos filamentosos, com potencial toxigênico em meio aos grãos, não determina a contaminação por micotoxinas, a presença de aflatoxinas não pode ser diagnosticada visualmente. Isto ocorre porque estas toxinas são incolores, inodoras e não modificam o sabor dos alimentos, sendo comumente encontradas em grãos de milho assintomáticos aparentemente de boa qualidade, por isso são necessárias análises para detecção e quantificação.
Tais análises requerem o uso de metodologias sensíveis, exatas e reprodutíveis. Desde a descoberta e caracterização das principais micotoxinas: aflatoxinas, fumonisinas, ocratoxina, zearalenona, desoxinivalenol e patulina tem havido um progresso significativo no desenvolvimento e aprimoramento de métodos analíticos de detecção (LINO; SILVA; PENA, 2006). A escolha do método a ser empregado deve considerar propriedades químicas e físicas da toxina, matriz alimentar, aplicabilidade, custo e eficiência. O grau de confiabilidade é caracterizado pela precisão, exatidão, sensibilidade, estabilidade e especificidade do método utilizado (SOARES, 2006; ONO et al., 2007).
As aflatoxinas podem ser detectadas por métodos físico-químicos e biológicos. Os físico-químicos incluem cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia gasosa (CG), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS) e cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS). As técnicas biológicas incluem os imunoensaios, ensaio imunoenzimático (ELISA) e colunas de imunoafinidade (CIA) para a limpeza e concentração de extratos alimentares (AMARAL; MACHINSKI JUNIOR, 2006; HAYASHI, 2007).
A metodologia analítica é composta por algumas etapas: amostragem, preparo das amostras (homogeneização, moagem, extração e limpeza), detecção e quantificação. Para Ono et al. (2007), a amostragem é a etapa mais importante do processo, pois se a amostra não representar o total dos grãos, o resultado obtido não poderá ser assumido como válido. Cruz (2010) descreve que na contaminação de produtos agrícolas por aflatoxinas nem sempre a ocorrência da toxina é uniforme em todo lote de grãos.
Em teoria, o preparo ideal da amostra elimina todos os interferentes, deixando somente os componentes de interesse para serem analisados, porém, na prática sempre ocorre uma perda de analíto, a grande questão é tornar essa perda mínima. Quando a amostra é seca, como é o caso do milho a primeira coisa a ser realizada é a moagem, cujo tamanho final das partículas deve estar entre 0,5-1,0mm. Em seguida, para extração do componente de interesse da amostra, são utilizadas soluções-aquosas derivadas da mistura de solventes polares. As mais utilizadas são: metanol:água (70:30), metanol:água (6,5:3,5),
metanol:água (80:20), acetonitrila:água (9:1); celite:água:clorofórmio (25:10:250), metanol: cloreto de potássio (9:1) e clorofórmio:água (30:1).
Como a granulometria das partículas da amostra tem influência na eficiência da extração, ao término do processo deve-se filtrar o extrato bruto, contudo, permanecem ainda muitas impurezas, por isso é realizado um processo de purificação. Para isso, existem vários mecanismos: colunas de extração em fase sólida (SPE), colunas de fase reversa, cartuchos de troca iônica forte (SAX), colunas de imunoafinidade (CIA) ou o uso de clarificantes (sulfato de cobre ou sulfato de amônio) (AMARAL; MACHINSKI JUNIOR, 2006). Muitas pesquisas que avaliam a contaminação por aflatoxinas em matrizes milho, rações e outros subprodutos do milho vem utilizando as CIA na etapa de purificação dos extratos (HAYASHI, 2007; CRUZ, 2010; ROSSI, 2011; FERREIRA et al., 2013; MULUNDA
et al., 2013). As CIA possuem anticorpos específicos à micotoxina a ser analisada e que se
ligam ao analíto, fazendo a retenção seletiva da micotoxina na coluna. A posteriori faz-se a lavagem com água ultra-purificada e a eluição com solvente para o rompimento da ligação antígeno-anticorpo. Os solventes mais recomendados para a etapa de eluição das aflatoxinas da CIA são metanol ou acetonitrila. A desvantagem destas colunas é o alto custo comercial.
Em geral, os métodos cromatográficos e de espectrometria de massa são mais sensíveis e específicos, apesar de onerosos, complexos, demorados e exigirem qualificação técnica na realização das análises. Os métodos imunológicos como os kits ELISA são mais simples, rápidos, específicos e portáteis, entretanto, são mais utilizados em análises de triagem e têm como inconveniente o custo elevado (ROSSI, 2011). Além dos resultados falso-positivos e falso-negativos, baixa reprodutividade e grande variabilidade dos resultados não possibilitam diferenciar resíduos múltiplos (LINO; SILVA; PENA, 2006).
Dentre os métodos já utilizados, a CLAE com detector de fluorescência vem ocupando lugar de destaque nas últimas pesquisas (HAYASHI, 2007; ECKERT, 2011; CRUZ, 2010; ROSSI, 2011; BENTO et al., 2012; VEIT, 2013; FERREIRA et al., 2013). A cromatografia, seja ela CCD, CG ou CLAE, compreende um método físico-químico de separação de compostos de uma mistura por migração diferencial. Os componentes da mistura são distribuídos entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária, alternada e rapidamente um número incontável de vezes, de modo que a velocidade de migração dos compostos da mistura se torna diferente entre estes, conforme a afinidade com cada fase, ocorrendo uma separação ao fim do processo (SOARES, 2006).
Na CLAE, a fase móvel é um líquido e as fases estacionárias podem ser líquidas ou sólidas. Para Cechi (2003), a CLAE possui vantagens e desvantagens em relação às demais técnicas, dentre as quais se destacam maior resolução, reprodutibilidade,
sensibilidade, automação e rapidez por empregar pressão na realização das análises, permite a análise de amostras com grande variabilidade de massa molecular, voláteis e termicamente instáveis. Entretanto, a técnica requer extensivo processo de limpeza e derivatização, além de o equipamento ser caríssimo, os custos de manutenção e operação são onerosos.
Contudo, a cromatografia faz a separação dos compostos da amostra, mas não os identifica, para isso são utilizados: padrões analíticos conhecidos, reações químicas, espectro de massas, testes de imunoafinidade, características do espectro ultravioleta, infravermelho ou fluorescente (SOARES, 2006). Na detecção de aflatoxinas, o mais usual para identificação são os padrões analíticos, com os quais são obtidas as curvas de calibração e, por meio de regressão linear, são feitas as quantificações.