1-Introdução
A cultura in vitro de plantas iniciou-se, de forma sistemática com os trabalhos de Haberland e sofreu um grande impulso com a descoberta das auxinas. Por cultura in vitro entende-se o estabelecimento e manutenção, em condições laboratoriais e assépticas de células, tecidos, órgãos vegetais, plantas, ou massas de células designadas de calli. Estas culturas são mantidas em condições de assepsia de forma a evitar a contaminação por microrganismos e podem ser utilizadas para diversas finalidades, como por exemplo, a clonagem de plantas, a produção de metabolitos secundários, transformação genética, a fusão de protoplastos e ainda a obtenção de plantas haploides (Canhoto, 2010).
No decurso da autogénese e edificação dos diferentes tecidos implica um aumento do número e dimensões das células mas também uma especialização devido ao funcionamento de determinados genes e ao silenciamento de outros. Assim sendo, nas plantas algumas células especializam-se no transporte, outras na fotossíntese e outras no revestimento. No entanto, se precedermos à cultura de um fragmento de uma folha ou de outro tipo de órgão vegetal num meio de cultura e se as condições foram as mais adequadas, pode verificar-se que a estrutura organizada da folha é modificada, devido ao fato de determinadas células sofrerem um processo de certa forma inverso da diferenciação e poderem reverter a um estado meristemático sofrendo mitoses sucessivas. Este processo conduz à formação de células relativamente uniformes em termos morfológicos dividindo-se mais ou menos ativamente. Este processo é designado de desdiferenciação. Se as condições forem as ideais, a partir desta massa celular poder-se-ão formar embriões ou rebentos caulinares que, uma vez germinados ou enraizados originam uma nova planta (Canhoto, 2010).
A capacidade que as células vegetais possuem de, quando em cultura darem origem a novas plantas sem a intervenção de um processo de reprodução sexuada é designado de totipotência e constitui a base da reprodução assexuada nas plantas. Assim sendo, tecidos já diferenciados podem desdiferenciar-se ou seja, recuperar um potencial genético e comportar- se como um zigoto (célula totipotente) (Canhoto, 2010).
As técnicas de micropropagação têm um papel muito importante a nível da conservação das espécies, especialmente das plantas medicinais, bem como, na melhoria a nível genético para aplicação em produtos farmacêuticos (Karalija et al., 2011).
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A micropropagação de plantas representa uma alternativa para a propagação comercial de espécies de interesse económico, entre as quais as medicinais com valor farmacológico reconhecido tal como o Thymus. Qualquer organismo vegetal representa uma fonte de células para cultura in vitro. A possibilidade de clonar as plantas faz com que seja possível manipular a variação fenotípica ou a concentração de compostos dos óleos essenciais presentes no momento da colheita (Lucchesini et al., 2010).
Alguns fatores podem comprometer o uso das plantas medicinais para fins farmacêuticos, como a heterogeneidade dos indivíduos, devido à variabilidade genética e bioquímica, a cultura in vitro surge como uma ferramenta para ultrapassar estas barreiras.
É muito difícil recolher matéria-prima quimicamente homogénea e padronizada de espécies de Thymus no ambiente natural, devido ao elevado polimorfismo químico característico destas espécies. A composição química dos óleos essenciais do tomilho é influenciada pelo solo, clima e fatores ecológicos, levando a uma variabilidade química. Isto impõe muitas desvantagens, nomeadamente, heterogeneidade do material vegetal. Além disso, a recolha de plantas medicinais numa escala em massa no seu habitat natural, está a levar a um esgotamento dos recursos biológicos. Neste sentido existe uma necessidade emergente em arranjar alternativas de produção, para garantir materiais vegetais a uma grande escala e que apresentem qualidade para satisfazer a procura crescente (Aicha et al., 2013).
A multiplicação por cultura in vitro, é uma metodologia muito importante para a obtenção de um grande número de plantas homogéneas num período de tempo curto. Muitas vezes a propagação convencional é um processo lento, durante o qual doenças e problemas com microrganismos podem diminuir a produção. A cultura in vitro é uma metodologia importante no sentido de otimizar e aumentar a produção de metabolitos secundários (Leal et
al., 2012).
O sucesso com as células vegetais ou cultura de órgãos vegetais tem dependido do uso dos meios de cultura adequados. Ao fornecer compostos necessários e formas apropriadas, foi possível estabelecer cultura in vitro de praticamente todas as partes da planta. Na cultura in
vitro é possível reproduzir indivíduos adultos a partir de culturas de protoplastos, gomos,
anteras e micrósporos, embriões e meristemas, ver anexo II (Huang e Murashige, 1976). Para se poder estabelecer cultura in vitro de tecidos vegetais é necessário induzir o seu desenvolvimento, passando por diferentes estádios: a diferenciação (desenvolvimento do tecido com função específica); competência (capacidade de responder a estímulos específicos)
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e totipotência (os tecidos quando expostos a certas condições são capazes de originar a planta inteira) (Saad e Elshahed, 2012).
As culturas de tecidos podem iniciar-se a partir de qualquer parte da planta mãe. Esses pequenos órgãos ou porções de tecido são normalmente chamados de explantes. A parte da planta (planta mãe ou fonte de explantes) a partir da qual são obtidos os explantes depende: do objetivo da cultura; do tipo de cultura a ser iniciada e da espécie de planta que vai ser utilizada. Como o objetivo da micropropagação é obter plantas idênticas à planta mãe, os explantes comummente utilizados são, geralmente, meristemas e gomos apicais ou axilares, pois já possuem a informação genética necessária à obtenção dos rebentos e plântulas (George
et al., 2008).
Plantas que crescem num ambiente externo são contaminadas com microrganismos e pragas. Estes contaminantes estão confinados à superfície externa da planta. Contudo, alguns microrganismos podem ser sistémicos aos tecidos porque estes se iniciam a partir de pequenos explantes e devem crescer num meio nutritivo que também é favorável ao crescimento de microrganismos, pelo que as culturas de tecidos vegetais devem ser estabelecidas e mantidas em condições assépticas. Para tal, é conveniente que o crescimento da planta mãe ocorra num ambiente o mais abrigado das condições de campo, se possível, de forma a minimizar infeções. Depois, o material vegetal é desinfetado superficialmente, de maneira a eliminar microrganismos superficiais, manipulado com instrumentos adequados e previamente esterilizados, sendo então inoculado nos meios de cultura também esterilizados (George et al., 2008).
Murashide (1974) foi um dos pioneiros da cultura in vitro de células vegetais, sendo o primeiro a propor que a micropropagação podia ser dividida em várias fases distintas. De uma forma muito sucinta as diferentes fases passam por: seleção e preparação da planta mãe, estas devem estar isentas de qualquer doença; estabelecimento da cultura asséptica para evitar o crescimento de microrganismos, esta fase é considerada com sucesso se um número considerável de explantes sobreviver e crescer sem contaminantes. A fase de multiplicação de propágulos (células merismáticas) é a fase mais importante de qualquer sistema de micropropagação; seguidamente vem a fase de alongamento dos rebentos e enraizamento de forma a atingirem um tamanho adequado para a fase seguinte que é a transferência das plântulas para o seu meio natural. Para evitar a perda de material vegetal, uma vez que os rebentos obtidos se desenvolveram em culturas com elevada humidade e baixa intensidade de luz, as plântulas são transplantadas para um meio adequado de enraizamento (turfa) e
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mantidas inicialmente num ambiente de elevada humidade e reduzida intensidade de luz (George et al., 2008).
A taxa de micropropagação melhora gradualmente com o número de subculturas, tendo uma adaptação dependente do tempo dos explants e das condições in vitro (Rout et al., 2000).
As subculturas tornam-se frequentemente imperativas quando a densidade de células, tecidos ou órgãos se torna excessiva. Uma outra razão para a realização de subculturas é que o crescimento do material vegetal num recipiente fechado, eventualmente, leva à acumulação de metabolitos tóxicos e à exaustão do meio de cultura. Assim, mesmo para manter a cultura, a totalidade ou parte dela tem de ser transferido para um meio fresco. A repicagem (transferência para meio de cultura novo) é feita normalmente a cada 4-6 semanas. As culturas que são infetadas por microrganismos não devem ser utilizadas para repicagem (George et al., 2008).
O número de rebentos obtidos durante a micropropagação é influenciado pela densidade inicial de explantes. Em Thymus broussoneti o maior número de rebentos (9,19) foi conseguido com uma densidade de 6 explantes por frasco. Além disso, os rebentos micropropagados com esta densidade eram saudáveis e morfologicamente superiores em comparação com outras. Quando a densidade aumenta para 8, 10 e 12 de explantes por frasco, o número médio de rebentos foi diminuindo e os rebentos regenerados apresentam caules finos e folhas pequenas. Com o aumento da densidade também ocorre o escurecimento dos tecidos vegetais a partir da segunda semana de cultura. Isto acontece devido à competição de nutrientes e à presença de compostos secundários que se difundem a partir dos explantes (Aicha et al., 2014a).
Bajaj (1988) sit in (Rout et al., 2000) conseguiu obter 2200 plântulas de Thymus
vulgaris a partir de um único explante cultivado in vitro num período de 5 meses.
Vários estudos com Salvia fruticosa demonstraram que o teor dos óleos essenciais de plantas cultivados in vitro é superior quando comparado com plantas cultivadas ex vitro. Em condições in vitro os rebentos são mais jovens, portanto, os compostos químicos que são formados nos tricomas acumulam-se na parte aérea numa quantidade mais concentrada. Além disso, o aumento do rendimento do óleo essencial in vitro pode ser relacionado com a influência marcada pela adição ao meio de cultura de citoquininas, nomeadamente o BAP. O rendimento do óleo essencial obtido num meio de cultura com adição de BAP foi aumentado em 150% quando comparado com o controlo, meio de cultura MS sem reguladores de crescimento (Arikat et al., 2004).
37 1.1-Meios de cultura
O material vegetal apenas evidencia uma resposta favorável in vitro se lhe for fornecido um meio de cultura adequado. Este consiste numa solução aquosa contendo diversos nutrientes essenciais ao desenvolvimento da cultura vegetal (George et al., 2008).
Um meio de cultura é normalmente constituído por uma solução de sais minerais que fornecem os elementos principais e secundários necessários para o crescimento das plantas, em conjunto com uma fonte de carbono, a sacarose. O crescimento e desenvolvimento das plantas normalmente dependem também da adição de reguladores de crescimento. Estes são compostos que em concentrações muito baixas são capazes de estimular, ou inibir, o crescimento ou morfogénese das plantas. Este é um método muito inflexível, os reguladores de crescimento frequentemente precisam de ser alterados de acordo com a variedade da planta, ou em diferentes estágios da cultura, quanto ao meio de cultura base pode permanecer inalterado (George et al., 2008).
O material vegetal pode ser cultivado num meio líquido ou num meio que tenha sido parcialmente solidificado com um agente gelificante. O método utilizado dependerá do tipo e objetivo da cultura (George et al., 2008).
O meio sólido é amplamente utilizado para o estabelecimento dos explantes, manutenção a longo prazo das culturas quer de órgãos ou tecidos, ou desenvolvimento de
calli. As culturas em meio sólido exigem pouco espaço, são colocados em simples frascos de
vidro ou plástico. Apenas a parte inferior do explante, órgão ou tecido é que está em contacto com o meio de cultura (George et al., 2008).
Os meios líquidos são essenciais para as culturas em suspensão, e são preferencialmente utilizados para o crescimento e formação de calli. Órgãos de maiores dimensões, como rebentos também podem muitas vezes ser cultivados de forma satisfatória, colocados numa camada superficial do líquido, estando parte do órgão projetada acima da superfície do líquido, sendo necessário um método de suporte para os pequenos órgãos ou tecidos, recorre- se à agitação para que seja garantido arejamento suficiente. A agitação do meio também permite que as células em suspensão não se desloquem para o fundo dos frascos, bem como, uma distribuição de nutrientes mais eficiente. Existem várias técnicas alternativas. A suspensão de células vegetais pode ser cultivada de forma bastante satisfatória quando estas ficam totalmente imersas no meio de cultura líquido, desde que seja agitado para garantir o
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arejamento adequado. Este método pode ser utilizado não apenas para as células em suspensão mas também para a cultura de órgãos (George et al., 2008).
Existem mais de 50 formulações de meios de cultura in vitro, mas o mais comum é o meio de Murashige e Skoog – MS – desenvolvido em 1962 para plantas de tabaco (Rout et
al., 2000). No anexo III pode ser visualizada uma tabela com a composição do meio de
cultura MS.
Os meios de cultura dos tecidos vegetais geralmente contêm os seguintes compostos: macronutrientes (> 0.5 mM/L como o N, P, Ca e Mg), micronutrientes (< 0.5 mM/L como o Fe, Mn, Zn, B, Cu, Cl, Mo e Ni), vitaminas, aminoácidos, suplementos de azoto, fonte de carbono, reguladores de crescimento e agentes gelificantes. O ferro é geralmente adicionado na forma quelatada de EDTA para evitar a sua precipitação e facilitar a absorção (Rout et al., 2000).
Segundo Saad e Elshahed (2012) nos meios de cultura de células vegetais, para além da sacarose com uma concentração que pode variar de 2-5% existem outras fontes de carbono, como a lactose, galactose, maltose, amido, frutose e glucose. Estas fontes, para a maior parte das espécies continuam a ser menos eficientes quando comparadas com a sacarose. Esta é conhecida por atuar na formação de rebentos axilares e ramificações de raízes adventícias.
A experiência efetuada por Aicha e colaboradores (2013a) trabalhando com Thymus
hyemalis mostraram que a concentração de 30 g/L de sacarose no meio MS proporciona um
maior número de rebentos. Níveis mais elevados de sacarose levam a uma diminuição do número e do comprimento dos rebentos. Níveis elevados de sacarose podem resultar num maior potencial osmótico inibindo a absorção dos nutrientes pelos explantes e levando ao aumento da concentração de dióxido de carbono, que pode ser bastante prejudicial. De acordo com este trabalho, a sacarose é quase universalmente utilizada como fonte de energia mais adequada para a micropropagação de plantas.
Contudo, existem outros estudos que demonstram que o sorbitol é a fonte de carbono mais eficiente para o crescimento in vitro de várias espécies de plantas aromáticas e medicinais (Aicha et al., 2013a).
Algumas vitaminas são necessárias para o desenvolvimento da planta, e são obrigatórias como catalisadores em vários processos metabólicos. Estas podem também funcionar como fatores limitadores da diferenciação celular, quando os tecidos ou células são cultivados in
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(ácido piridoxina) apesar das próprias plantas produzirem as suas próprias vitaminas (Saad e Elshahed, 2012).
Os aminoácidos necessários para o crescimento ótimo da planta são normalmente sintetizados pela maioria das plantas, podendo também ser adicionado, se estes necessitarem em maiores quantidades. Os aminoácidos como a glicina, asparagina, L-arginina, cisteína e tirosina proporcionam uma fonte de azoto orgânico, em meios de cultura (Saad e Elshahed, 2012). Segundo Huang (1976) os aminoácidos como a arginina, ácido glutâmico, L-glutamina e L-serina desempenham um papel importante na iniciação da embriogénese a partir de anteras em culturas. A L-tirosina parece também ser crucial na formação de rebentos e na formação de calli (Dakah et al., 2013).
A alguns meios de cultura ainda podem ser adicionados suplementos orgânicos como extratos hidrolisados de proteína, leite de coco, extrato de levedura, banana, extrato de malte, sumo de laranja, terra e carvão ativado (inibe os compostos fenólicos do meio evitando o seu escurecimento e aumenta a hidrólise da sacarose durante a autoclavagem) (Saad e Elshahed, 2012).
Segundo os estudos de Fraternale e colaboradores (2003) a adição de triacontanol (estimulador de crescimento das plantas, pode ser encontrado nas ceras das cutículas das folhas e ceras de abelhas) provocou um efeito positivo sobre o crescimento de plântulas micropropagadas de Thymus mastichina, utilizando diferentes condições. Este efeito é válido para os meios de cultura sem reguladores de crescimento, se o meio apresentar reguladores de crescimento como BAP, IBA (ácido indol butírico), e Triacontanol, já não se vai observar esse efeito positivo no rendimento nos óleos essenciais.
A rigidez do meio de cultura influencia significativamente o crescimento dos tecidos vegetais. Existem vários agentes de solidificação como agar, gelrite ou phytagel. O agar é um polissacárido obtido a partir de algas e é de uso universal. Este misturado com água funde facilmente numa gama de temperaturas de 60º-100ºC e solidifica a 45ºC formando um gel estável a todas as temperaturas de incubação. O gel de agar não reage com os componentes do meio de cultura e não é digerido pelas enzimas das plantas (Saad e Elshahed, 2012).
1.2-Reguladores de crescimento
Os reguladores de crescimento das plantas são importantes na cultura de tecidos vegetais, uma vez que, desempenham papéis vitais no alongamento do caule, tropismo e
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dominância apical, entre outros. A qualidade e a quantidade de regulares de crescimento aplicados nas culturas de plantas medicinais apresentam um efeito significativo sobre o metabolismo dos metabolitos secundários. Foi referido por exemplo, que citoquininas em combinação com baixos níveis de auxinas pode aumentar a produção de compostos fenólicos em Thymus vulgaris (Karalija e Paric, 2011).
Os reguladores de crescimento são geralmente classificados nos seguintes grupos: auxinas, citoquininas, giberelinas, ácido abscísico e etileno. A razão auxina/citoquininas determina o tipo de extensão da organogénese nas culturas de células vegetais. As principais auxinas utilizadas nos meios de cultura de tecidos vegetais incluem o IAA (ácido indolocético – auxina natural), IBA, 2,4D e NAA. As auxinas são utilizadas para estimular a produção de
calli; o crescimento celular; para iniciar a formação de rebentos; enraizamento; induzir a
embriogénese somática e estimular o crescimento de ápices (Saad e Elshahed, 2012).
As citoquininas comummente utilizadas nos meios de cultura incluem o BAP, KIN, Z (zeatina), 2-IP (2-isoperteniladenina) e TDZ (tidiazurão). Estas promovem e estimulam a divisão celular; induzem a formação axilar; proliferação de ramos e retardam a formação de raízes. As citoquininas são compostos estáveis em meios de cultura e podem ser armazenadas e desidratadas a -20ºC (Saad e Elshahed, 2012).
Relativamente às giberelinas compreendem mais de vinte compostos, dos quais GA3 (ácido giberélico) é a mais utlizada. Estes compostos aumentam o crescimento de calli e ajudam no crescimento das pequenas plântulas, ou seja, empilhamento de nós. As giberelinas podem interferir sobre o teor de auxinas. Também têm um papel importante na quebra da dormência das sementes, facilitando a sua germinação (Saad e Elshahed, 2012).
Devido ao seu papel em promover a dormência de gemas, e sementes e a abcisão foliar o ácido abscísico (ABA) foi inicialmente visto como uma hormona com efeitos inibitórios. O ABA está presente em todos os órgãos da planta e é sintetizado em todas as células que apresentam cloroplastos e amiloplastos processando-se o seu transporte no sistema vascular. Esta hormona é essencial para o funcionamento dos estomas, tendo influência no estado de turgescência das células do estoma. Este composto intervém no desenvolvimento correto dos embriões. A utilização de ABA em cultura in vitro ainda é bastante restrita (Canhoto, 2010).
O etileno está envolvido em alguns processos de desenvolvimento da planta, pode quebrar a dormência em algumas espécies de plantas. Em algumas espécies este composto pode induzir a formação de calli (Canhoto, 2010).
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Stafford e colaboradores (1986) sit in (Rout et al., 2000) referiram que a acumulação de metabolitos secundários em culturas de células ou tecidos vegetais depende da composição do meio de cultura, incluindo os tipos e quantidades de sais minerais; reguladores de crescimento; fonte de carbono utilizada e as condições ambientais incluindo a temperatura.
O carvão ativado pode ser adicionado para eliminar compostos fenólicos que são excretados pelas pequenas plantas, no entanto, este pode inibir o crescimento dos tecidos e induzir necroses, mas favorece o crescimento de raízes.
A luz, temperatura e humidade relativa são parâmetros importantes no crescimento da cultura. A atividade fotossintética não é muito importante durante as fases iniciais de cultura
in vitro, mas nos estádios posteriores é induzido um certo grau de autotrofismo. A luz é
essencial aos processos morfogenéticos, como iniciação de caules, raízes e embriogénese somática. Tanto a qualidade e intensidade da luz, bem como o fotoperíodo é muito crítico para o sucesso da cultura in vitro. A exposição à luz recomendada é de 12-16h por dia sob 35- 112µmol/m2/s fornecido por lâmpadas fluorescentes frias, preferencialmente de cor branca. A luz azul promove a formação de rebentos, enquanto que, a luz vermelha induz o enraizamento em muitas espécies. A temperatura utilizada na câmara de crescimento geralmente é da ordem dos 25ºC, com exceção das plantas tropicais que necessitam de uma temperatura superior (Rout et al., 2000).
Para a elaboração de meios de cultura é frequente utilizar-se soluções stock pois permitem reduzir erros; têm maior facilidade de manuseamento; são mais económicas; menos trabalhosas e evitam a precipitação de determinados elementos (Dakah et al., 2013).
O microambiente dos fracos de cultura in vitro parece ser um ambiente homogéneo, mas na verdade é o responsável pela variabilidade no comportamento das culturas, uma vez que, os fatores determinantes para a qualidade do microambiente são o tipo de frascos; tipo de vedação e a quantidade de meio de cultura presente. A forma de vedação utilizada interfere nas trocas gasosas entre o microambiente dentro dos frascos e o ar atmosférico, ocasionando o