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Estudo da variabilidade genética de plantas de Thymus
micropropagadas por diferentes processos
Dissertação de Mestrado em Biologia
Natália do Céu Pires Afonso
Orientadora: Professora Doutora Fernanda Maria Madaleno Rei Tomás Leal Santos Co-Orientadora: Professora Doutora Maria Manuela do Outeiro Correia de Matos
Dissertação de Mestrado em Biologia
Natália do Céu Pires Afonso
Orientadora: Professora Doutora Fernanda Maria Madaleno Rei Tomás Leal Santos Co-Orientadora: : Professora Doutora Maria Manuela do Outeiro Correia de Matos
Composição do Júri:
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Dissertação de mestrado apresentada à UTAD, elaborada com vista à obtenção do grau de Mestre em Biologia (em conformidade com o DR 2ª Série - 149, 4 de Agosto de 2011 regulamento dos mestrados)
v
Ao Professor Catedrático António Fontainhas Fernandes, Magnífico Reitor da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, agradeço a possibilidade de realizar este Mestrado nesta instituição.
O meu muito obrigado à Professora Doutora Fernanda Maria Madaleno Rei Tomás Leal Santos por ter aceitado ser minha orientadora. Agradeço os conhecimentos transmitidos, a paciência e a recetividade, a confiança depositada ao longo deste percurso, a motivação e todo o seu apoio e amizade.
Agradeço também à Professora Doutora Maria Manuela Do Outeiro Correia Matos pelo esclarecimento de dúvidas na elaboração desta dissertação, por todos os conhecimentos transmitidos e pela dedicação demonstrada.
À coordenação do Mestrado de Biologia e a todos os professores pelos ensinamentos concedidos.
A todos os funcionários do Departamento de Genética e Biotecnologia, em especial, à D. Alexandrina Aguiar e à D. Teresa Morais pelo apoio e ajuda prestados.
Agradeço também à Patrícia Silva do Departamento de Genética e Biotecnologia pela ajuda na realização dos protocolos de extração e amplificação dos fragmentos de DNA das amostras de Thymus.
Aos meus pais por todo o apoio e força que me deram, e principalmente pela confiança incondicional que depositam em mim.
À Silvina Estevinho Afonso por todo o apoio na elaboração desta dissertação e principalmente pela amizade e amor demonstrado ao longo da minha vida, uma pessoa que sempre esteve presente na minha vida e estará, a irmã que nunca tive.
Ao António Faria, o meu muito obrigada pelo carinho, paciência e compreensão, pela preocupação demonstrada ao longo deste percurso e principalmente pela confiança que sempre depositou em mim.
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Thymus é o género bem representado na família das Lamiaceae. Este género inclui mais
de 300 espécies em todo o mundo e é amplamente distribuído em zonas temperadas. São pequenos arbustos de 20-50 cm de altura, com flores pequenas, de cor roxo pálido ou branco.
Numa população de Thymus, podemos observar a existência de indivíduos femininos e hermafroditas, sendo a planta designada de ginodióica.
Tomilho é o nome vulgar para designar as espécies de Thymus, este é cultivado em quase todos os países, como planta aromática essencialmente para fins culinários. Tem sido demonstrado que apresenta propriedades benéficas, tais como: anti-inflamatória, antibacteriano, antifúngico, antiviral, antitumoral, antiprotozoário, antitússico, inseticida, antisséptico e antioxidante.
Os óleos essenciais de Thymus vulgaris são muito ricos em fenóis. A quantidade dos óleos essenciais varia consoante o estado vegetativo da planta. Nestas espécies existe muito polimorfismo químico, espécies geograficamente distantes apresentam grande variação na composição química dos seus óleos essenciais.
Atualmente existe uma procura excessiva de Thymus na Natureza, perturbando assim os ecossistemas e naturalmente incitando a diminuição de genes, podendo levar a extinção de algumas espécies de Thymus. Para colmatar este problema, surge a aplicação da técnica de micropropagação, esta permite a produção rápida e a grande escala de plantas, livres de microrganismos, podendo assim, selecionar e micropropagar os genótipos mais vantajosos.
Neste trabalho foi efetuada a avaliação da variabilidade genética de várias gerações de
Thymus vulgaris micropropragados por diferentes metodologias. Os segmentos nodais desta
planta foram colocados em meio de cultura MS (Murashige e Skoog) sólido com adição de várias concentrações de BAP (6-benzilaminopurina). O meio MS sem reguladores de crescimento foi considerado como controlo.
Os explantes responderam melhor quando colocados em meio MS com 1mg/L de BAP. Relativamente ao enraizamento, só se observou no meio MS sólido livre de reguladores de crescimento.
Também foram colocados explantes em meio de cultura MS líquido com 1mg/L BAP, que responderam muito bem, com um elevado número de rebentos mas sem formação de tecido caloso.
viii apropriado para a indução de calli.
Foi avaliada a variabilidade genética de 13 amostras de tecidos, formados pelos diferentes métodos de micropropagação incluindo o tecido caloso, utilizando 8 primers ISSRs (Inter Simple Sequence Repeat).
Esta técnica, baseia-se em PCR (reação em cadeia pela polimerase), envolve amplificações de segmentos de DNA (ácido desoxirribonucleico) entre duas regiões idênticas repetidas de microssatélites, a uma distância amplificável, orientadas em direções opostas.
Das 13 amostras avaliadas observamos um polimorfismo de 1,60%. Num total de 74 bandas amplificadas apenas uma banda foi polimórfica. Esta banda corresponde ao fragmento de DNA de tamanho 1200 pb, amplificado pelo primer UBC873. Esta banda está presente somente nas amostras de calli. Não se verificou variabilidade genética nas amostras referentes às quatro gerações micropropagadas, incluindo a planta mãe, cultivadas em meio sólido, também não se verificou polimorfismo nas amostras provenientes da micropropagação em meio líquido. Assim, tal como esperamos a micropropagação permitiu a formação de clones com a mesma informação genética.
Palavras-chave: Thymus vulgaris; micropropagação; reguladores de crescimento; variabilidade genética; ISSRs.
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Thymus is the best represented genus in the Lamiaceae family. This genus includes more than 300 species worldwide, and is widely distributed in temperate zones. We are talking about small shrubs 20-30 cm tall, with small pale purple or white flowers.
In a Thymus’ population, we can observe the existence of female and hermaphrodite individuals, designated gynodioecious plant.
Thyme is the common name for the species of Thymus, it growths in almost all countries as an aromatic plant for culinary purposes. It has been demonstrated that produces beneficial properties, such as antibacterial, antifungal, antiviral, antitumor, antiprotozoal, antitussive, insecticide, antiseptic and antioxidant.
The essential oils of Thymus vulgaris are very rich in phenolics. The amount of essential oils varies depending on the vegetative state of the plant. During the growth period, there is a large production of sheets consequently greater production of glandular trichomes, structures where essential oils are formed and accumulated. In these species there is a lot of chemical polymorphism, geographically distant species show great variation in the chemical composition of their essential oils.
These days there is an excessive demand of Thymus in nature, disturbing ecosystems, naturally urging the reduction of genes and may lead to extinction some species of Thymus. To address this problem, there is the application of micropropagation technique, this allows rapid and large-scale production of plants free of microorganisms. We can select the most advantageous and micropropagate genotypes.
This work assesses the genetic variability of several generations of Thymus vulgaris micropropagated by different methodologies. Nodal segments of this plant were placed in solid MS medium (Murashige e Skoog) with addition of various concentrations of BAP (6-benzyladenine). The MS medium without growth regulators was considered as control. Explants responded better when placed on MS medium with 1mg / L BAP. In what concerns rooting, it was observed only in my free MS solid growth regulators.
Explants were also placed in liquid MS culture medium, with addition 1mg/L BAP, those responded very well, with a high number of shoots, but without formation of callus tissue.
The callus tissue was observed only when explants were placed on solid medium with addition of 2 mg/L 2,4-D (2,4 dichlorophenoxyacetic acid), this medium is suitable for
x Repeat).
The technique of molecular markers based on PCR (Polymerase Chain Reaction) involves amplification of DNA segments between two identical microsatellite repeated regions, an amplifiable distance oriented in opposite directions.
Of the 13 samples evaluated we observed a polymorphism of 1,60%. In an amount of 74 amplified bands only one was polymorphic. This band corresponds to the DNA fragment, size 1200 bp, amplified by the primer UBC873. This band is present only in the samples represented by callus tissue. Thus, as expected, micropropagation allowed the formation of clones with the same genetic information.
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Agradecimentos ... v
Resumo ... vii
Abstract ... ix
Índice de figuras ... xiii
Índice de tabelas ... xv
Índice de gráficos ... xvii
Lista de abreviaturas ... xix
Introdução Geral ... 1
Capítulo I Enquadramento teórico ... 5
1-Género Thymus ... 5
2-Aspetos da ecologia do género Thymus ... 11
3-Importância económica do género Thymus ... 14
4 Espécies de Thymus que ocorrem em Portugal ... 15
5-Polimorfismo químico do género Thymus em Portugal ... 18
6-Propriedades do género Thymus ... 20
7-Aplicações de plantas aromáticas e medicinais ... 29
Capítulo II - Micropropagação - Cultura in vitro ... 33
1-Introdução ... 33
1.1-Meios de cultura ... 37
1.2-Reguladores de crescimento ... 39
1.3-Vantagens da cultura in vitro – micropropagação ... 42
2 – Material e métodos ... 42
3 - Resultados ... 45
4 - Discussão ... 56
xii
Capítulo III - Variabilidade Genética ... 63
1-Introdução ... 63
1.1-Marcadores genéticos ... 64
1.2-Métodos de Extração DNA ... 67
1.3-Utilização dos marcadores moleculares nas plantas medicinais ... 70
2-Material e métodos ... 73
2.1-Extração de DNA - NucleoSpin® Plant II – Macherey – Nagel ... 74
2.2-Leitura da concentração de DNA extraído ... 75
2.3-ISSRs (Inter Simple Sequence Repeat) ... 75
2.4-Resolução dos produtos de amplificação em gel de agarose ... 76
3-Resultados e Discussão ... 77
3.1-Resultados da análise com os marcadores ISSRs ... 77
3.2-Discussão da análise com os marcadores ISSRs ... 79
Conclusão ... 83
Bibliografia ... 85
ANEXO I - PRÍNCIPAIS MÉTODOS DE MICROPROPAGAÇÃO... 96
ANEXO II – DIFERENTES MÉTODOS DE MICROPROPAGAÇÃO ... 99
ANEXO III – COMPOSIÇÃO MEIO CULTURA MS M0 222.00.25 ... 101
ANEXO IV – MARCADORES MOLECULARES MAIS UTILIZADOS EM TECIDOS VEGETAIS ... 103
ANEXO V – PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO DE DNA ... 105
ANEXO VI – VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE DNA E RAZÃO DE PURZA ... 107
ANEXO VII – MATRIZES REFERENTES AOS MARCADORES OBTIDOS (POR PRIMER) E RESPETIVO PESO MOLECULAR ... 109
xiii
Figura 0-1 - Esquema geral da metodologia de estudo. Micropropagação de Thymus vulgaris
e avaliação da variabilidade genética por amplificação de DNA com primers ISSRs. ... 3
Figura II-1 - Explantes de Thymus vulgaris colocados em cultura. ... 43 Figura II-2 – Tecido caloso (calli) desenvolvido sobre explantes caulinares em meio de
cultura MS com 2,0 mg/L de 2,4-D. ... 44
Figura II-3 – Plântulas de Thymus vulgaris com 6 semanas de cultura em meio MS mais
1mg/L de BAP. ... 54
Figura II-4- Enraizamento de plântulas em meio de cultura MS sem reguladores de
crescimento. ... 55
Figura II-5-Micropropagação de Thymus vulgaris em meio líquido. ... 55 Figura III-1 – Marcadores de peso molecular padrão de DNA usados para verificar o
tamanho dos fragmentos (GeneRulerTM100 pb Plus DNALadder – ordena fragmentos (em
pb): 3000, 2000, 1500,1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400,300, 200 e 100). ... 77
xv
Tabela I-1- Híbridos do género Thymus que ocorrem em Portugal. Adaptado de Figueiredo et
al., 2008. ... 11
Tabela I-2-Estudos sobre os óleos essenciais de plantas do género Thymus existentes em Portugal. Adaptado de Figueiredo et al., 2008; Salgueiro L., 2007. ... 16
Tabela II-1 - Número de rebentos de Thymus vulgaris existentes por semana e por meio de cultura. Os resultados dos valores de prova que apresenta a letra a significam que foram tratados com testes paramétricos. ... 46
Tabela II-2-Comprimento dos rebentos de Thymus vulgaris existentes por semana e por meio de cultura. Os resultados dos valores de prova que apresenta a letra a significam que foram tratados com testes paramétricos. ... 47
Tabela II-3- Número de nós do rebento principal de Thymus vulgaris existentes por semana e por meio de cultura. Os resultados dos valores de prova que apresenta a letra a significam que foram tratados com testes paramétricos. ... 49
Tabela II-4- Número de nós dos restantes rebentos de Thymus vulgaris existentes por semana e por meio de cultura. Os resultados dos valores de prova que apresenta a letra a significam que foram tratados com testes paramétricos. ... 50
Tabela II-5 - Nº de raízes de Thymus vulgaris existentes por semana e por meio de cultura. Os resultados dos valores de prova que apresenta a letra a significam que foram tratados com testes paramétricos. ... 52
Tabela II-6-Comprimento de raízes de Thymus vulgaris existentes por semana e por meio de cultura. Os resultados dos valores de prova que apresenta a letra a significam que foram tratados com testes paramétricos. ... 53
Tabela III-1-Sequências dos 8 primers ISSRs. ... 75
Tabela III-2-Amostras utilizadas no estudo a sua origem e o código utilizado. ... 78
xvii
Gráfico II-1- Número médio de rebentos por meio de cultura e por semana. Valores médios
com a mesma letra não são significativamente diferentes (p>0,05), para cada meio de cultura. ... 46
Gráfico II-2-Comprimento médio de rebentos por meio de cultura e por semana. Valores
médios com a mesma letra não são significativamente diferentes (p>0,05), para cada meio de cultura. ... 48
Gráfico II-3- Média do número de nós do rebento principal por meio de cultura e por
semana. Valores médios com a mesma letra não são significativamente diferentes (p>0,05), para cada meio de cultura. ... 49
Gráfico II-4-Número médio dos restantes rebentos. Valores médios com a mesma letra não
são significativamente diferentes (p>0,05), para cada meio de cultura. ... 51
Gráfico II-5- Média do número de raízes em cada semana por tipo de cultura. Valores médios
com a mesma letra não são significativamente diferentes (p>0,05), para cada meio de cultura. ... 52
Gráfico II-6- Comprimento médio de raízes em cada semana por tipo de cultura. Valores
médios com a mesma letra não são significativamente diferentes (p>0,05), para cada meio de cultura. ... 54
xix 2,4 D – Ácido diclorofenoxiacético
2-iP – isopertiniladenina ABA - Ácido abscísico
AFLP – Amplified Fragment Length Polymorphism (Polimorfismo do comprimento dos fragmentos amplificados)
ATP – Adenosina trifosfato BAP - 6-benzilaminopurina BHT - hidroxitolueno butilado
CTAB – Brometo de cetil trimetilamónio
DNA – Deoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucleico) dNTPs – Desoxirribonucleótidos trifosfato
EDTA – Ácido etileno diamino tetra acético EtBr – Brometo de etídio
FPIX – Ferro-protoporfirina IX GA3 - Ácido Giberélico
GEE – Gases de efeito de estufa IAA - Ácido indoleacético IBA - Ácido indol butírico
IC50 – Concentração necessária para inibir 50% da atividade de uma população
ISSRs – Inter Simple Sequence Repeat (Amplificação entre repetições de sequências simples) KIN – Cinetina
LPS - Lipopolissacarideo MDA – Malonaldeído mM – Milimolar
MS – Meio de cultura Murashige e Skoog NAA – Ácido naftaleno acético
O2● – Ião superóxido OH – Radical hidroxilo
OMS – Organização Mundial Saúde PAM – Plantas aromáticas e medicinais pCO2 – Pressão dióxido de carbono
xx
RAPD – Randon Amplification of Polymorphic DNA (Polimorfismo de DNA amplificado aleatoriamente)
RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism (Polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição)
RNA - Ribonucleic Acid (Ácido ribonucleico) ROS – Espécies Reativas de Oxigénio
rpm – Rotações por minuto
SIDA – Síndrome de imunodeficiência adquirida
SSR – Simple Sequence Repeats (Repetições de sequências simples) TBE – Tris borato EDTA
TDZ – Tidiazurão UV – Ultra Violeta Z – Zeatina
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Introdução Geral
As plantas do género Thymus são pequenos arbustos com 20 a 50cm de altura, pertencente à família Lamiaceae, existem em todo o mundo mais de 300 espécies diferentes de Thymus (Figueiredo et al., 2008). Em Portugal são conhecidas pelo menos 11 espécies desta planta aromática. Tomilho é o nome comum dado às espécies de plantas pertencentes ao género Thymus.
O grande interesse do género Thymus vem da sua utilização em medicina, como aditivo alimentar ou do seu uso na indústria da cosmética. Existem vários estudos que demonstram as propriedades antibacterianas; antifúngicas; antitumoral; anti-inflamatória; antiviral e antioxidante dos óleos essenciais de Thymus. Diferentes extratos de folhas de Thymus revelaram a presença de um elevado número de flavonóides e vitamina E, compostos de grande interesse para a indústria alimentar devido à sua atividade antioxidante, bem como na medicina no combate a fungos e bactérias (Morales, 1995).
A micropropagação tem uma grande importância na multiplicação de Thymus, uma vez que, permite a otimização dos seus parâmetros exógenos e a obtenção de um elevado número de clones similares à planta mãe, o que é difícil de se obter ex vitro devido à planta ser fortemente alogâmica. Assim sendo, não é necessário a obtenção da planta em campo evitando o seu esgotamento e possível extinção da espécie (Cardoso et al., 2013).
A cultura de tecidos pode ser iniciada, entre outros, a partir de pedaços de plantas inteiras. Os pequenos órgãos ou pedaços de tecido que são usados são chamados de explantes. A parte da planta a partir da qual são obtidos os explantes (planta mãe) depende de: tipo e objetivo da cultura; espécie de plantas a serem utilizadas. Os explantes podem ser de vários tipos diferentes, tendo a escolha correta do tipo de material um efeito importante sobre o sucesso da cultura de tecidos, ver anexo I. Os explantes devem estar livres de contaminantes microbianos, quando colocados em meio de cultura nutritivo, pelo que se torna necessário, a maior parte das vezes, submetê-los a processos de desinfeção (George et al., 2008).
Existem vários fatores que podem afetar a multiplicação dos rebentos, tais como: genótipo; meios de cultura utilizados; condições de crescimento (temperatura, luz e humidade) e os métodos de micropropagação (Cardoso et al., 2013).
Podendo, a cultura in vitro potencializar o aparecimento de variabilidade genética, ou seja, variação somaclonal, ou uniformidade, mediante os diferentes métodos de propagação utilizados.
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O uso de elevados níveis, ou determinados tipos de reguladores de crescimento durante a micropropagação pode comprometer a estabilidade genética da cultura, considerado um fator indesejável para as culturas comerciais.
Desde o início do século XX com o aparecimento da genética moderna, os marcadores moleculares têm sido usados como meio de seleção indireta de características desejáveis e eliminação das indesejáveis, bem como, análises de diversidade taxonómica, filogenética e genética (Godwin, et al., 1997).
Os primeiros marcadores de DNA aplicados às plantas foram os marcadores RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). E desde essa época os sistemas de marcadores baseados em PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), nomeadamente, RAPDs (Random
Amplified Polymorphic DNA); SSRs (Simple Sequence Repeats) e ISSRs (Inter-Simple Sequence Repeat) e AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphism) são os mais
utilizados (Borse et al., 2011).
A técnica dos marcadores moleculares ISSRs (Zietkiewicz et al., 1994), baseia-se em PCR, envolve amplificações de segmentos de DNA entre duas regiões idênticas repetidas de microssatélites, a uma distância amplificável, orientadas em direções opostas. Estes marcadores devido à sua abundância e dispersão no genoma têm sido muito utilizados na avaliação de relações filogenéticas entre populações relacionadas, em estudos de fingerprinting, seleção assistida por marcadores, filogenia e mapeamento genético em plantas (Semagn et al., 2006).
Os marcadores moleculares, baseados na molécula de DNA têm-se revelado como uma ferramenta importante para o estudo da variabilidade genética. A vantagem inerente a estes marcadores estabelece-se com a deteção de polimorfismos em sequências de DNA (Godwin
et al., 1997).
O objetivo deste trabalho consiste em avaliar a variabilidade genética de várias gerações de plantas de Thymus vulgaris obtidas in vitro por diferentes metodologias. Para a concretização deste objetivo foi necessário: multiplicar plantas de Thymus in vitro, extrair DNA de plantas de Thymus vulgaris obtidas in vitro por cultura em meio sólido, em meio líquido e a partir de tecido caloso da mesma planta, e avaliar a variabilidade genética através de marcadores moleculares, ISSRs.
Assim sendo, o trabalho foi dividido em três capítulos, no primeiro capítulo consta a revisão bibliográfica do tema. O segundo capítulo é referente à micropropagação do género
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Thymus micropropagadas. Para a análise da estabilidade genética foram utilizados, os
marcadores moleculares ISSRs, e as bandas originadas foram amplificadas por PCR, utilizando oito primers diferentes.
Primeiramente os explantes de Thymus foram colocados em meio de cultura MS com diferentes concentrações da citoquinina BAP (6-benzilaminopurina) 1mg/L e 2mg/L. O meio de cultura MS sem reguladores de crescimento foi considerado como controlo.
Durante o processo de micropropagação foi extremamente difícil a obtenção de tecido caloso a partir de tecido foliar em meio sólido. Para ultrapassar esta dificuldade foi necessário instalar alguns explantes caulinares em meio MS sólido com a adição de 2mg/L de auxina 2,4-D (ácido diclorofenoxiacético), regulador de crescimento utilizado para a indução de tecido caloso. Também foram colocados em meio MS (Murashige e Skoog) líquido explantes foliares com adição de 1mg/L de BAP. Posteriormente 13 das plântulas formadas por diferentes métodos de micropropagação, com quatro gerações distintas foram sujeitas a análise da estabilidade genética, através dos marcadores moleculares ISSRs. Na figura 0-1 pode ser visualizado um esquema geral da metodologia utilizada neste trabalho.
Figura 0-1 - Esquema geral da metodologia de estudo. Micropropagação de Thymus vulgaris e avaliação da variabilidade genética por amplificação de DNA com primers ISSRs.
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Capítulo I Enquadramento teórico
1-Género Thymus
A palavra tomilho é um genérico para mais de 300 espécies pertencentes ao género
Thymus, incluindo diversos híbridos. Existem variedades de ecótipos, que diferem nas suas
características morfológicas e na composição dos seus óleos essenciais. A palavra Thymus tem duas derivações: a partir da palavra grega thyo sentido de cheio, limpar ou da palavra
thymon de coragem (Figueiredo et al., 2008).
O Thymus é o género mais bem representado na família das Lamiaceae. Este género está amplamente distribuído em zonas temperadas. O número de espécies dentro deste género ainda é muito discutível dependendo do ponto de vista taxonómico (Sostaric et al., 2012). As folhas são opostas; verde-acinzentadas; inteiras, lineares ou elípticas; até 15 mm de comprimento, cobertas com filamentos densamente emaranhados, que contêm glândulas esferoidais onde se produz e acumula a maioria dos óleos essenciais (tricomas glandulares), o que permite a muitas espécies suportar condições de seca (Jia et al., 2012).
Os tricomas glandulares podem estar presentes quer na superfície adaxial quer na superfície abaxial das folhas. Estes podem ser de dois tipos, os tricomas peltados e tricomas capitados, que diferem na morfologia; início e duração da atividade secretora, modo de secreção e tipo de material segregado. Durante o período de floração é evidente menos tricomas glandulares, no entanto, apresentam maior quantidade de óleo essencial segregado. Contrastando com muitas espécies da família Lamiaceae o Thymus vulgaris apresenta apenas um tipo de tricoma, o peltado produzindo substâncias lipofílicas. O tricoma glandular peltado apresenta oito células na cabeça, responsáveis pela produção do óleo essencial (Jia et al., 2012).
As flores são pequenas, roxo-pálido ou branco, dispostas em inflorescências terminais que podem estar juntas ou dispersas. Aparecem desde o início do verão até o fim do outono, e crescem geralmente em agregados. Poucas espécies apresentam apenas duas flores por nó, geralmente aparecem grupos maiores de flores. O cálice do tomilho (2,5-8mm), quando seca tem um papel importante na dispersão de pequenos frutos. O fruto é um aquênio ovoide suave, podem existir até quatro por flor, embora alguns abortem durante o desenvolvimento inicial. As sementes apreendidas a partir da população selvagem, normalmente germinam com facilidade e as plantadas crescem relativamente rápido (Morales, 2002). Estas espécies
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são muitas vezes, polinizadas por abelhas, no entanto a autopolinização também pode ocorrer (Alia et al., 2012).
O tomilho é nativo da região do Mediterrâneo ocidental, especialmente no sul da Itália e Turquia de onde se disseminou para muitas regiões do mundo (Murillo-Amador, 2013). Apenas duas das oito secções de Thymus ocorrem fora do Mediterrâneo. A designação de
secção é normalmente utilizada em taxonomia para ajudar a organizar géneros com muitas
espécies. Na nomenclatura botânica, o termo secção refere-se a um nível taxonómico que está abaixo do género, mas acima da espécie (Aguiar, 2013). Pode referir-se que o tomilho tem origem na área do mediterrâneo, uma vez que, as secções Serpyllum e Micantes têm estado presentes desde o Paleocénico. No Miocénico aparecem algumas espécies das secções
Thymus e Hyphodromi. Durante o Quaternário os ancestrais da secção Serpyllum bem como,
aqueles que pertencem à secção Hyphodromi produziram novos processos de especiação, colonizando toda a Terra livre de gelo, após a última glaciação. Estes processos ainda não estão bem determinados e podem ser a razão por que todas as espécies são difíceis de se distinguir. Pode supor-se que estas estão no meio do trilho, num processo de especiação para originar espécies bem definidas. Os cromossomas desta espécie são muito pequenos e podem variar no seu número. A aneuploidia tem sido um fenómeno importante na evolução deste género (Morales, 2002).
Numa mesma população de Thymus, podemos observar a existência de indivíduos femininos e hermafroditas, sendo as espécies designadas ginodióica. Nestas espécies as flores classificadas como femininas produzem anteras muito reduzidas e pouco ou nenhum pólen viável, enquanto, nas flores hermafroditas ambos os sexos são funcionais. Este fenómeno é recente em angiospérmicas, ocorre em cerca de 7% das espécies e ocorre com mais frequência em climas temperados. A determinação do sexo nestes casos é muitas vezes cito-nuclear. Existe portanto um conflito genético nestes sistemas, devido a diferenças no modo de hereditariedade de genes mitocondriais (herdados na mãe) e nucleares (Hong et al., 2003).
Segundo os estudos realizados por Belhassen (1991) com Thymus vulgaris verificou-se que sucessivas cópias de cruzamentos entre hermafroditas e uma linha feminina originam apenas descendentes do sexo feminino, assim sendo, a herança citoplasmática deve estar envolvida. A análise molecular de diversos indivíduos revelou que os genes envolvidos na esterilidade masculina estão localizados na mitocôndria. A heterogeneidade entre cruzamentos indica que ocorre a herança não mendeliana.
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De acordo com Jalas (1971) in (Sostaric et al., 2012) o género Thymus é dividido em oito secções: Micantes, Mastichina, Piperella, Tencrioides, Pseudothymbra, Thymus,
Hyphodromi e Serpyllum. As dificuldades na interpretação taxonómica deste género estão
relacionadas com a elevada variabilidade das populações em muitas características morfológicas e micromorfológicas, bem como, com a composição química dos seus metabolitos secundários. Esta variabilidade expressa é uma consequência da influência de fatores ambientais e variação genética devido à frequente hibridação (Sostaric et al., 2012).
Assim sendo, parece ser razoável aplicar o conceito de espécie filogenética ao género
Thymus, que define as espécies como a menor agregação das populações diagnosticável por
uma combinação única de estados de carateres em indivíduos comparáveis. Tal definição filogenética das espécies é baseada em carateres e padrões orientados. Ela permite a existência de intercâmbio genético com outras espécies, desde que este não iniba o desenvolvimento evolutivo independente das respetivas populações (Sostaric et al., 2012).
Segundo Moreles (2002) as espécies lenhosas com formas eretas podem ser filogeneticamente mais velhas do que as herbáceas.
O tomilho é cultivado em quase todos os países, como planta aromática para usos culinários. Tem sido demonstrado que apresenta propriedades benéficas, tais como: antiespasmódico, antibacteriano, antifúngico, antiviral, antiprotozoário, antitumoral, antitússico, antisséptico, inseticida e como antioxidante. A composição química dos seus óleos essenciais (misturas complexas de compostos voláteis, principalmente monoterpenos, sesquiterpenos e fenilpropanóides) apresenta uma elevada quantidade de flavonóides, que incluem luteolina, apigenina, naringenina, timonina, em menor quantidade também apresenta glicosídeos, triterpenos (ácidos ursólico e oleanólico) (Ruiz-Navajas et al., 2012).
A composição do óleo essencial pode ser muito variada. A variabilidade é observada entre as plantas que crescem em diferentes países e climas. Todas as variedades de tomilho podem conter pelo menos seis componentes comuns: geraniol, linalol, terpineol, carvacrol, timol entre outros (Murillo-Amador, 2013).
A espécie Thymus vulgaris é rica em fenóis monoterpenos (timol e carvacrol) e os seus correspondentes hidrocarbonetos terpénicos (p-cimeno e γ-terpineno). Em geral o elevado teor de óleos essenciais é exibido no período de crescimento. Durante este período existe formação de muitas folhas, consequentemente a produção de tricomas glandulares, onde se formam e armazenam os óleos essenciais (Jia et al., 2013).
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Ocorre variação da composição do óleo essencial desta espécie (Thymus vulgaris) durante as várias etapas vegetativas, foi demonstrado que o óleo recolhido em Maio/Junho (este é o período adequado para a colheita, em plena floração antes da frutificação) foi caraterizado por níveis mais baixos de hidrocarbonetos monoterpenos principalmente o γ-terpineno. Verificaram-se níveis elevados de monoterpenos oxigenados linalol e borneol, fenóis monoterpenos (principalmente timol) e os seus derivados (principalmente, carvacrol éter metil) e sesquiterpenos (principalmente β-cariofileno) quando comparado com outras espécies de Thymus nomeadamente o Thymus hyemalis. Esta espécie de tomilho é caracterizada por ter um quimiotipo 1,8-cineol, sendo endémico na Península Ibérica. Apesar da fase de colheita mais favorável ser em Maio/Junho, uma vez que o óleo essencial atinge concentrações mais elevadas em fenóis, esta colheita só pode ser definida com as necessidades da indústria farmacêutica, tendo em conta os componentes dos óleos essenciais desejados (Jordan et al., 2006).
Os óleos essenciais podem ser isolados através de diferentes métodos, hidrodestilação, destilação a vapor e extração por solvente orgânico. A extração dos óleos essenciais pode ser realizada através de uma técnica designada de fluido supercrítico (SFE) utilizando dióxido de carbono. Este é um processo promissor que evita a degradação térmica e a presença de resíduos de solventes nos extratos, permitindo também uma seletividade dos compostos preferenciais. Mesmo assim, os extratos continuam a ter uma enorme lista de diferentes substâncias, logo é necessário existir uma purificação, no sentido de isolar as substâncias pretendidas. Desta forma as técnicas de cromatografia supercrítica são uma alternativa útil para esse isolamento (García-Risco et al., 2011).
Atualmente existe um método inovador para a extração dos óleos essenciais assistido por enzimas. As folhas secas são misturadas com água destilada e enzimas, esta mistura é depois sujeita a hidrodestilação para o isolamento do óleo essencial. Este método pode ser considerado como um processo biotecnológico promissor para aumentar a eficiência dos óleos essenciais. A aplicação de celulase e hemicelulase sozinhas ou em combinação não afeta as características qualitativas mas induz variações notáveis na proporção dos componentes individuais dos óleos essenciais (Hosnia et al., 2013). A hidrólise enzimática de pectina promove a diminuição da viscosidade e neutraliza as cargas electroestáticas entre os ácidos urónicos, proteínas, reduzindo as forças de ligação e por conseguinte, a estabilidade da matriz (Cerda et al., 2013).
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Um estudo realizado por Gavahian e colaboradores (2012) compara vários métodos convencionais de isolamento de óleos essenciais em Thymus vulgaris com o método hidrodestilação ohmic assistido, designado por eles “amigo do ambiente”, uma vez que resulta em menores gastos de energia e não utiliza solventes orgânicos. Com este método foi possível isolar a totalidade dos óleos essenciais existentes no tomilho num curto espaço de tempo. O aquecimento ohmic (é um processo em que a corrente elétrica passa através de materiais) só funciona em sistemas contínuos de água e materiais com baixa condutividade elétrica, como gotículas de óleo em sistemas mistos.
Segundo os estudos realizados por Hudaib e colaboradores (2002) os Thymus vulgaris mais jovens, ao longo de toda a fase vegetativa com mais teor em óleo essencial (1,2%) apresentam maior rendimento do óleo essencial em relação ao Thymus vulgaris mais velho. Os Thymus mais jovens apresentam um maior conteúdo de óleo essencial rico em fenóis em maio/junho e mínimos em novembro/dezembro. Portanto a qualidade e quantidade de óleo essencial também depende do ciclo vegetativo.
A quantidade de compostos biologicamente ativos de óleos essenciais obtidos a partir de folhas e flores é muito mais elevado do que aquele que é obtido a partir de caules. Portanto, pode inferir-se que os caules não são importantes para a comercialização. A biomassa de plantas secas, a quantidade de óleo essencial e a composição química desse mesmo óleo são os primeiros critérios para a seleção de clones valiosos do género Thymus (Loziene K. , 2009).
Relativamente ao armazenamento do óleo essencial de Thymus e de acordo com os estudos de Usai e colaboradores (2011) o congelamento é o melhor método para manter a composição do óleo essencial de tomilho, por outro lado, os piores resultados foram obtidos com a secagem por congelação (são congelados e introduzidos em vácuo), mesmo sendo este o melhor método na retenção de timol e carvacrol, uns dos componentes mais importantes do tomilho. As amostras secas ao ar tiveram a melhor retenção de compostos voláteis durante o armazenamento quando comparadas com as submetidas a liofilização.
Estas plantas deviam estar sob a denominação de origem protegida, devido às suas propriedades únicas. A constante pressão humana, devido ao turismo, agricultura e construção tem provocado a redução e destruição da população de Thymus um pouco por toda a Península Ibérica, tornando algumas espécies deste género extremamente vulneráveis. Do ponto de vista legal algumas espécies já se encontram protegidas pela Diretiva 2006/105/CE do Conselho de 20 de Novembro de 2006. Técnicas e processos biotecnológicos
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desempenham um papel essencial no apoio à conservação da biodiversidade vegetal. A micropropagação de plantas e tecidos vegetais é uma importante ferramenta da biotecnologia de propagação ex situ de espécies em vias de extinção, sendo possível obter milhares de exemplares a partir de um único explante, num curto período de tempo. As plantas cultivadas
in vitro podem posteriormente serem utilizadas para diversos estudos, evitando a colheita no
seu ambiente natural (Coelho et al., 2012).
Segundo Gomez (2004) no género Thymus a hibridação é bastante comum. Quando coabitam duas ou mais espécies que apresentam compatibilidade genética dão lugar a híbridos. Esta compatibilidade também pode existir entre níveis diferentes de ploidia. Assim sendo, existe uma grande facilidade para hibridar como provam as estritas relações genéticas entre as espécies, podendo então tratar-se de um táxon monofilético de origem comum.
Até à data, foram detetados 60 híbridos entre as 35 espécies que vivem na Península Ibérica (Morales, 2002).
As espécies que produzem mais híbridos são o Thymus mastichina, Thymus vulgaris e
Thymus zygis, que também são frequentes em toda a região do Mediterrâneo (Morales, 1995).
Existem na Península Ibérica mais de cinquenta híbridos, cinco deles ocorrem em Portugal, tabela I-1. A composição química dos óleos essenciais de três híbridos Portugueses como o
Thymus mastichina x Thymus. villosus ssp. villosus, Thymus x mourae e Thymus x viciosoi foi
muito útil para perceber que eles eram de origem hibrida (Figueiredo et al., 2008).
Como auxiliar da taxonomia clássica os metabolitos secundários, nomeadamente os óleos essenciais, têm-se revelado de grande utilidade, particularmente para os taxa morfologicamente difíceis de distinguir, como por exemplo, os híbridos. Estes herdam carateres dos progenitores algumas vezes com o predomínio dos de um sobre os do outro. Apresenta-se o exemplo do híbrido Thymus x mourae Paiva & Salgueiro, tabela I-1, cuja composição do óleo essencial alertou para a sua origem hibrida, uma vez que foi possível identificar os principais compostos de cada um dos progenitores no respetivo óleo. Assim, o óleo de Thymus x mourae apresenta teores elevados de borneol e de 1,8 cineol como o progenitor Thymus mastichina subsp. donyanae e percentagem elevada de sesquiterpenos oxigenados dos quais se destaca o intermedeol, proveniente de Thymus lotocephalus (Salgueiro et al., 2000).
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Tabela I-1- Híbridos do género Thymus que ocorrem em Portugal. Adaptado de Figueiredo et al., 2008.
Híbridos Progenitores
T. x brachychaetus (Willk.) Coutinho T. mastichina (L.) L. subsp. mastichina x T. caespititius Brot T. mastichina x T. villosus ssp. Villosus T. mastichina x T. villosus ssp. Villosus
T. x mourae Paiva & Salgueiro T. mastichina (L.) L. subsp. donyanae R. Morales x T. lotocephalus
G. López & R. Morales
T. x viciosoi (Pau) R. Morales T. pulegioides L. x T. zygis L. subsp. Zygis
T. x welwitschii Boiss. T. carnosus x T. mastichina (L.) L. subsp. Mastichina
2-Aspetos da ecologia do género Thymus
O Thymus é uma planta heliófila e xerófita, requer climas temperados, quentes, secos e com boa exposição solar (Mourão, 2012).
O Thymus é uma planta que frequentemente vive em rochas, requer solos leves, bem drenados de textura média e grosseira com pH entre os 5,0-8,0. Diferentes espécies de
Thymus exigem substratos diferentes. Por exemplo, o Thymus carnosus vive em dunas de
areia perto do litoral, o Thymus locatae e Thymus vulgaris em solos calcários, enquanto o
Thymus mastichina apresenta boa adaptação a solos ácidos (Mourão, 2012).
O Thymus é uma planta resistente, o que lhe permite viver em condições climáticas extremas relativamente à temperatura e abastecimento de água. A maior produção de óleos essenciais pode ser também uma característica de adaptação ao clima seco, pois as substâncias voláteis evaporam-se e produzem uma atmosfera saturada em torno da planta fazendo com que a perda de água seja menor. Contrariamente algumas espécies como as da secção
Serphyllum podem viver em climas muito frio como os da Sibéria e Gronelândia (Morales,
2002).
Para a produção do tomilho deve evitar-se humidade excessiva uma vez que este é bastante susceptível a doenças causadas por fungos do solo. Esta planta está adaptada a precipitações na ordem dos 500-600 mm anuais. No entanto é uma planta bastante resistente às geadas, pois desenvolvem estratégias de sobrevivência com alterações morfológicas e fisiológicas (Mourão, 2012).
Por exemplo, os quimiótipos cujos monoterpenos dominantes apresentam uma estrutura aromática fenólica (carvacrol e timol) são abundantes em solos pedregosos, onde as temperaturas de inverno tendem a ser pouco rigorosas, altitudes inferiores a 400 metros e
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perto do litoral. Em contraste quimiótipos não fenólicos (geraniol, α-terpineol, linalol), dominam em áreas onde os solos são mais profundos e húmidos, em áreas onde podem ocorrer temperaturas abaixo dos -10ºC, ou seja, com altitudes superiores a 400 metros (Thompson et al., 2004).
A adição de adubo, nas culturas de Thymus vulgaris antes das sementeiras provoca um aumento na produção, mas as diferenças na produção de óleos essenciais não são significativas. No entanto, a introdução de azoto resultou num aumento significativo, em relação ao rendimento dos óleos essenciais, a partir da unidade de área de cultivo dm3/ha. Foram registadas algumas diferenças na composição e quantidade dos quimiótipos dos óleos essenciais (Baranauskiene et al., 2003).
Os microrganismos do solo podem fazer aumentar a produtividade das plantas e juntamente com os reguladores de crescimento, podem ainda controlar os indivíduos patogénicos das plantas medicinais nomeadamente, o tomilho. Um, desses microrganismos benéficos é o fungo Microrhizal arbuscular. Este forma relações de simbiose com raízes em cerca de 90% das plantas nos ecossistemas naturais e agrícolas. As relações de simbiose melhoram a disponibilidade de nutrientes principalmente o fosfato, a absorção de água, aumentam a resistência ao stresse hídrico, a durabilidade, o crescimento, a prevenção de toxicidade dos metais pesados e melhora a estrutura do solo (Dolatabadi et al., 2012).
Segundo os estudos realizados por Dolatabadi e colaboradores (2012) o crescimento do
Thymus vulgaris foi afetado positivamente pela presença de fungos colonizadores de raízes, Piriformospora indica e Sebacina vermifera, melhorando o crescimento da planta e o
desenvolvimento das suas raízes.
A crescente ocupação de áreas agrícolas e alterações climáticas têm impulsionado um grave problema mundial que é a salinização dos solos. Torna-se assim emergente a necessidade de respostas e adaptação das plantas. Foi realizado um estudo que mostrou o comportamento de uma espécie de Thymus broussonetti a condições de salinidade. Após o estudo verificou-se que a espécie reagiu como moderadamente tolerante ao sal. No entanto, quando sujeito a concentrações superiores a 50mM de NaCl ocorreram prejuízos no desenvolvimento da planta. Deste estudo ainda se verificou que a composição do óleo essencial de Thymus não foi afetada pelo aumento da salinidade (Belaqziz et al., 2014).
O dióxido de carbono é uma fonte básica de carbono para as plantas, uma vez, que é utilizado para sintetizar matéria orgânica via fotossíntese. Assim, uma maior disponibilidade na atmosfera exige por parte da planta maior produção de matéria orgânica. Além deste efeito
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direto sobre o metabolismo primário, o aumento da concentração de dióxido de carbono na atmosfera permite aumentar o rácio pCO2/pO2, com a consequente redução das espécies
reativas de oxigénio (Vurro et al., 2009).
De acordo com os estudos de Vurro e colaboradores (2009) o aumento da concentração de dióxido de carbono pode afetar o nível do óleo essencial das plantas aromáticas de interesse fitoquímico, nomeadamente a espécie Thymus vulgaris. Verificou-se um aumento de compostos fenólicos quando Thymus vulgaris foi sujeito a níveis superiores de dióxido de carbono comparando com a concentração atual de CO2 na atmosfera. Assim sendo, o Thymus
apresenta uma adaptação do sistema metabólico e antioxidante com o aumento da concentração de CO2 na atmosfera.
Uma outra preocupação da humanidade é o aumento dos gases de efeito de estufa (GEE) na atmosfera. Esta preocupação leva os investigadores a realizar estudos que permitam avaliar como as espécies respondem perante esta problemática, uma vez que, o problema continua, apesar, dos países terem vindo a aplicar políticas de forma a diminuir a emissão de GEE para a atmosfera. Por mais que os países diminuam a emissão destes gases é muito difícil baixar a sua concentração, pois estes têm um tempo de permanência na atmosfera dependente do tipo de GEE. Neste sentido as previsões afirmam que a concentração de dióxido de carbono na troposfera terrestre continuará a aumentar para valores de 500-700 µmol/mol até ao final deste século (Vurro et al., 2009).
Foi realizado um estudo por Sotomayor e colaboradores (2004) em que avaliam o efeito da rega nas culturas de Thymus, onde se verificou que o nível adicional de água é diretamente proporcional à produção de matéria seca e indiretamente proporcional ao rendimento do óleo essencial. A produção de compostos fenólicos presentes nos óleos essenciais deste género aumenta em condições ambientais quentes e secas.
O pastoreio excessivo provoca a redução da área fotossintética, a remoção do meristema apical com a perda de nutrientes armazenados nas extremidades. Algumas espécies do género
Thymus são boas indicadoras de paisagens degradadas de ambientes áridos, com pressões de
longa data de pastoreio, porque têm características favoráveis que resistem ao impacto do stresse ambiental. No Thymus pode existir uma correlação positiva entre a pressão do pastoreio e a massa das raízes das plantas contrariamente a outras espécies que são ameaçadas pelo pastoreio excessivo (Thompson et al., 2013).
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3-Importância económica do género Thymus
A produção mundial de óleos essenciais de tomilho é estimada nos EUA em 1,2 milhões de dólares. O comércio global anual de tomilho é de cerca de 15 mil toneladas. A Turquia é o maior produtor e exportador, com cerca de 11 mil toneladas, seguido pelo México, Grécia e Israel. Os principais países importadores de Thymus da Turquia são os EUA, Alemanha, Itália e Canadá (Ozudogru, 2011).
Em 2013 o estado “Baja Califórnia Sur” do México foi considerado um dos principais produtores de tomilho, no entanto, há pouca ou nenhuma pesquisa avaliando as culturas locais cultivadas. As culturas são cultivadas principalmente em campo aberto, num sistema orgânico, onde as plantas são fertilizadas, irrigadas e protegidas de pragas e doenças durante todo o período de crescimento seguindo padrões aceites para o cultivo da agricultura orgânica da região (Murillo-Amador, 2013).
O uso não-medicinal desta planta é também de grande importância económica no mercado mundial. Por exemplo, os óleos essenciais extraídos a partir de flores e folhas são amplamente utilizados na indústria de cosméticos e alimentar. Nesta ultima, serve como conservante e aditivo aromático para alimentos. As folhas, frescas ou secas, são usadas para dar sabor aos alimentos. Os óleos essenciais são ainda utilizados para a produção de produtos farmacêuticos. Além do uso industrial e comercial, a espécie Thymus também é cultivada como planta de paisagem, colorindo as paisagens de branco, creme, rosa ou violeta (Ozudogru, 2011).
A população de Thymus vulgaris está longe de ser suficiente para suportar a crescente, procura dos seus produtos. Além disso, o interesse das indústrias de cosméticos e alimentos, principalmente em alguns quimiotipos, levam à perda de outras espécies, tais como Thymus
cariensis, Thymus cilicicus, Thymus sipyleus, Thymus pulvinatus, e Thymus cherlerioides na
natureza. Recentemente as técnicas de propagação in vitro fornecem alternativas, com uma alta taxa de multiplicação de plantas, ao nível da horticultura, económica e medicinal (Ozudogru, 2011).
Em Portugal a produção e a comercialização de Plantas Aromáticas e Medicinais (PAM) ainda é um mercado em crescimento, quer na cosmética; alimentar ou farmacêutico. O aumento da procura de produtos naturais, por oposição aos produtos sintéticos, tem-se alavancado na tendência crescente dos cidadãos para um estilo de vida mais natural, mais sustentável e amigo do ambiente (GPP, 2012).
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Portugal só depois de 2009 é que apresenta dados estatísticos da produção de PAM. Segundo dados de 2012, existem três espécies de Thymus que são produzidas e comercializadas: Thymus×citriodorus; Thymus vulgaris e Thymus mastichina. Para secagem são produzidos 3,95ha, 2,88ha e 0,93 há, respetivamente (GPP, 2012).
4 Espécies de Thymus que ocorrem em Portugal
Em Portugal graças à sua situação geográfica e ao seu clima predominantemente mediterrânico, o género Thymus está amplamente distribuído, com a presença de elevadas espécies endémicas (Salgueiro, 2007).
O género Thymus é taxonomicamente bastante complexo não só por constituir uma série de poliploidia, bem como pela ocorrência natural de híbridos (Salgueiro, 2007).
De acordo com Morales (2002), um dos autores que mais estudou o género Thymus da Península Ibérica, existem sete secções, ocorrendo apenas cinco delas em Portugal:
Mastichina (Mill) Benth, Micantes velen, Pseudothymbra Benth, Thymus subsecção Thymus, Thymus subsecção Thymbra R. Morales, Serpyllum (Mill) Benth, subsecção Alternantes Klokov e Serpyllum subsecção Pseudomarginati (H. Braun & Barbás) Jalas.
Das onze espécies que ocorrem em Portugal algumas apresentam polimorfismo morfológico, sendo possível considerar nessas espécies taxa intraespecíficos com áreas fitogeográficas diferentes. Assim consideram-se catorze taxa Portugueses: Thymus mastichina subsp. Mastichina; Thymus mastichina subsp. donyanae R. Morales; Thymus albicans Hoffmanns & Link; Thymus caespititius Brot; Thymus lotocephalus G. Lopez & R. Morales;
Thymus villosus L. subsp. Villosus; Thymus villosus subsp. lusitanicus (Boiss) Coutinho; Thymus carnosus Boiss; Thymus zygis Loelf ex L. subsp. Zygis; Thymus zygis Loelf ex L.
subsp. sylvestris (Hoffmanns & link.) Brot ex Coutinho; Thymus capitellatus Hoffmanns & link; Thymus camphoratus Hoffmanns & link; Thymus pulegoides L e Thymus praecox opiz subsp. ligusticus (Salgueiro, 2007).
O Thymus é um género com elevada taxa de hibridação. Como auxiliar da taxonomia clássica os metabolitos secundários como os óleos essenciais, têm revelado uma grande utilidade, particularmente para os taxa morfologicamente difíceis de identificar, bem como para a identificação dos híbridos (Salgueiro, 2007).
Os óleos essenciais de Thymus têm sido estudados por vários investigadores tabela I-2, estes apresentam muitos compostos fenólicos na sua constituição. Os óleos essenciais são
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extraídos a partir das folhas e flores, a sua composição é diferente consoante a fase de desenvolvimento das plantas. Os óleos de Thymus caespititius sobretudo do NW de Portugal constituem uma exceção que é caracterizada pela alta quantidade de terpineol. Este componente pertence a um segundo grupo de componentes (citral, cânfora, acetato de geranilo, acetato de linalilo, entre outros) que ocorrem com menos frequência nos óleos essenciais de Thymus (Figueiredo et al., 2008).
Tabela I-2-Estudos sobre os óleos essenciais de plantas do género Thymus existentes em Portugal. Adaptado de Figueiredo et al., 2008; Salgueiro L., 2007.
Thymus
Espécies Composição do óleo essencial
Distribuição geográfica
T. albicans Timol 1,8-Cineol 29-43%, linalol 3-22%, α terpineol 6-10%, borneol 2-8%,
α pineno 4-5%, β-pineno 4-6%, canfeno 1-5% Algarve
T. caespititius
Álcool 60%, α- terpineol; 10% ester
α-terpineol 31-41%, p -cimeno 6-9%, γ-terpineno 4-7%, T-cadinol 6-9% carvacrol 41-65%, p –cimeno 4-19%, γ-terpineno 1-6%, T-cadinol
n.d.-15%, cadinene n.d.-5%
α-terpineol 33-37%, sabineno 16-18%, β-mircenol 7-10%, α-terpineno 4-6%, terpinen-4-ol 3-5%
NW Portugal Açores Madeira
T. camphoratus
1,8-Cineol 1-36%, borneol 1-35%, linalol 1-26%, acetato de linalol 0.3-13%, hidrato de trans -sabineno 0.11%, terpinen-4-ol 10%, α-pinene
1-11%, sabinene 1-5%, camfeno 0.2-14%, cânfora 0.3-10%, oxido de β-cariofileno 1-6%
Portugal
T. capitellatus
Três quimiótipos, o cineólico com 47,5% de 1,8 cineol, o 1,8 -cineol/borneol com 28,8% e 19,5%, respetivamente, e o 1,8-cineol/acetato
de linalilo/linalol com 27,5%, 20% e 17,5% respetivamente
Portugal
T. carnosus
Borneol 15-32%, canfeno 3-13%, hidrato de trans - sabineno 2-17%, hidrato de cis-sabineno 3-11%, terpinen-4-ol 4-12%, α-pineno 2-7%,
linalol 26%, acetate de borneol 2-7%
SW Portugal
T. lotocephalus 1,8-cineol 7-13%, linalol 4-17%, acetate de geranilo 0.2-15%, intermedeol
1-10%, α-pineno 5-9% Portugal
T. mastichina subsp. mastichina
1,8-cineol 15-66%, α-pineno 2-6%, β-pineno 2-6%, α-terpineol 1 9%, sabineno 15%, borneol 15%, canfeno 0.25%, cânfora 0.16%, linalol 1
-45%
linalol 64-80%, 1,8-cineol 7-19%
Portugal
Estremadura
T. mastichina
subsp. donyanae 1,8-cineol 38%, borneol 15%, canfeno 5%, α-terpineol 5% Algarve T. pulegoides
Timol 18-45%, carvacrol 2-31%, acetato de geranilo 34%, geranilo t-33%, β-terpineno 4-11%, p -cimeno 3-11%, 3-octanona 1-5%, β-cariofileno
1-5%
N Portugal
T. Villosus subsp. lusitanicus
Linalol 9-25%, acetato de geranilo 12-24%, geranilo 7-18%, terpinen-4-ol
5-15%, γ-terpineno 1-6% Estremadura
T. villosus subsp. villosus
Álcool 37%, 28% esteres, 5% fenois
p -cimeno 11-40%, borneol 2-23%, cânfora 3-14%, linalol 2-12%, γ-terpineno 2-11%, 1,8-cineol 0.1-12%, pineno 3-9%, canfeno 1-9%,
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terpineol 0.2-17%, mircenol 0.3-13%
T. zygis subsp. sylvestris
Timol 4-25%, carvacrol 1-23%, p-cimeno 10-22%, γ-terpineno 4-17%, linalol 3-30%, acetato de geranilo t-21%, geranilo t-21%, 1,8-cineol 1-12%
Centro Portugal
T. zygis subsp. zygis
p-cimeno 5-30%, carvacrol 0.3-41%, timol 0.2-34%, p-terpineno 1-24%,
acetato de geranilo 0.1-44%, geranilo 0.1-25% NW Portugal
Dada a variabilidade química a partir de óleos essenciais de Thymus portugueses e uma vez que não foi encontrada uma correlação entre a composição química dos óleos essenciais e os fatores ambientais, uma nova perspetiva está a ser estudada a fim de avaliar a possível correlação entre o polimorfismo químico e a variabilidade genética (Figueiredo, et al., 2008).
Segundo Figueiredo e colaboradores (2008) a atividade antibacteriana dos óleos essenciais de Thymus portugueses foi estudada através da análise de Thymus mastichina (L) L. subsp mastichina e Thymus albicans Hoffmanus & Link. A atividade antibacteriana dos óleos essenciais, isolados a partir de folhas das espécies mencionadas foi testada contra duas bactérias Gram positivo (Staphylococcus aureos e Listeria monocytogenes) e uma bactéria Gram negativa (Salmonella enterica). As bactérias Gram positivas foram mais suscetíveis aos óleos essenciais de Thymus albicans ao contrário da Salmonella enterica que foi mais sensível aos óleos de Thymus mastichina. Estas diferenças podem ser explicadas pela diferente composição dos óleos essenciais.
Foi realizado um outro estudo com Thymus portugueses em que os óleos essenciais foram isolados a partir das partes aéreas floridas de Thymus mastichina (L) L. subsp
mastichina; Thymus camphoratus e Thymus lotocephalus. Foram avaliados os óleos
essenciais destas três espécies contra bactérias Gram negativo, duas bactérias de Gram positivo e um fungo (Candida albicans). Os microrganismos testados apresentaram susceptibilidade diferente aos óleos essenciais dos Thymus utilizados. Por exemplo a
Echerichia coli foi mais sensível ao óleo essencial de Thymus mastichina (L) L. mastichina subsp. As bactérias de Gram positivo demonstraram susceptibilidade diferente o Staphylococcus aureos foi mais vulnerável ao óleo essencial de Thymus mastichina (L) L. mastichina subsp, quanto à Listeria monocytogenes foi mais vulnerável ao óleo essencial de Thymus lotocephalus (Figueiredo et al., 2008).
Segundo alguns estudos, os Thymus portugueses revelam um efeito positivo relativamente à atividade antifúngica, atuando os óleos essenciais sobre a formação das hifas dos fungos. Quanto à atividade antioxidante mostraram também essa aptidão, ou seja, atuam na prevenção da peroxidação lipídica (Figueiredo et al., 2008).
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Os híbridos herdam genes dos seus progenitores, ocorrendo com alguma frequência predomínio de um sobre os do outro. Desta forma as caraterísticas morfológicas não permitem identificar facilmente os híbridos, sendo que a composição do respetivo óleo essencial pode auxiliar na sua caracterização (Salgueiro, 2007).
5-Polimorfismo químico do género Thymus em Portugal
O polimorfismo químico dos óleos essenciais é uma característica principal das espécies do género Thymus (Loziene et al., 2005).
Sabe-se que as condições ambientais e a constituição genética influenciam o rendimento dos óleos essenciais do Thymus, bem como o polimorfismo sexual. Estas são algumas das razões pelas quais é muito difícil determinar o melhor período de colheita das plantas de tomilho, a fim de se obter um óleo essencial com melhor qualidade de plantas sem qualquer tipo de seleção prévia (Jordan et al., 2006).
A caracterização morfológica das secções que incluem as espécies de Thymus portugueses é por vezes difícil, mas estudos do polimorfismo químico destas espécies de provaram que os óleos essenciais podem ajudar na caracterização de algumas secções, na identificação de espécies e mesmo na identificação de híbridos e pequenas variações dentro do taxa. Ao observar a tabela anterior, é evidente que existe um enorme polimorfismo químico para a maioria dos Thymus portugueses. Apenas o Thymus mastichina e Thymus
caespetitius que ocorrem no NW de Portugal, é que não mostram polimorfismo químico
(Figueiredo et al., 2008).
O taxa da secção Mastichina (Thymus mastichina subs. mastichina; Thymus mastichina
subs. doyanae e Thymus albicans), embora apresentem polimorfismo químico para Thymus mastichina subs. mastichina e Thymus Albicans são caraterizados por ter em óleos essenciais
ricos em 1,8 cineol. Além disso, esta afinidade química está de acordo com a semelhança morfológica entre as espécies desta secção (Figueiredo et al., 2008).
A secção Micantes representada por Thymus caespititius apresenta, em Portugal, um óleo essencial muito diferente de todas as outras secções, caraterizado por um alto teor em terpineol e por ter um número de sesquiterpenos maior do que monoterpenos. No entanto os óleos essenciais isolados a partir de populações cultivadas das ilhas dos Açores apresentam polimorfismo diferente e aqueles isolados a partir de populações da ilha da Madeira
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mostraram possuir um polimorfismo químico semelhante a Portugal Continental (Figueiredo
et al., 2008).
Existe uma elevada variabilidade química dos óleos essenciais de Thymus portugueses, nos estudos realizados até ao momento não foi encontrada nenhuma correlação entre a composição química dos óleos essenciais e fatores morfológicos e/ou ambientais. Neste sentido, é importante analisar a possível correlação entre o polimorfismo químico e a variabilidade genética (Florl et al., 2009).
A análise molecular de Thymus caespititius apreendidos durante o período de floração (Açores), não fornece o mesmo grupo de componentes no óleo essencial. As plantas foram agrupadas de acordo com os seus perfis genéticos. Plantas com diferentes quimiótipos no seu óleo essencial foram agrupadas no mesmo grupo molecular (Florl et al., 2009).
A diversidade de quimiótipos ligada à distância geográfica pode ser explicada pelo baixo fluxo genético entre as populações, como resultado da baixa migração de sementes e grãos de pólen. No entanto a elevada diferenciação química entre as populações não pode ser apenas explicada pelo isolamento geográfico. O parâmetro bioclimático parece estar também envolvido no polimorfismo químico (Ali et al., 2012).
Existem muitas referências bibliográficas que referem que o conteúdo de fenol do
Thymus vulgaris é influenciado por fatores ambientais como a humidade e temperatura
(Santos et al., 2005).
Um estudo realizado por Salgueiro e colaboradores (2000) com duas subespécies que coabitam numa mesma área, zona centro de Portugal Continental, mostra quais os procedimentos a realizar quando não se consegue distinguir as duas subespécies. As subespécies em estudo são a Thymus villosus subp. villosus e Thymus villosus subsp.
lusitanicus (Bois) Coutinho, pertencentes à secção Pseudothymbra Benthom. As duas
subespécies têm uma distribuição similar nesta zona do país, nesta área é extremamente difícil de distinguir estes dois táxon. Em Espanha também é possível encontrar a segunda subespécie mencionada, a primeira é endémica de Portugal. Portanto é necessário estudar os seus óleos essenciais para as poder distinguir. Os resultados deste estudo mostram algumas diferenças importantes entre as populações, indicando a existência de polimorfismo químico, tal como acontece com as de Espanha. No entanto, os óleos essenciais das plantas portuguesas são diferentes das plantas espanholas. Estas últimas têm maior quantidade de cânfora, borneol e 1,8 cineol do que as mesmas espécies portuguesas, e não apresentam acetato de geranilo, nem geranilo ao contrário das portuguesas. Estas duas subespécies podem ser diferenciadas tendo
