1-Introdução
Os métodos de micropropagação podem influenciar o crescimento das plantas, bem como a composição química dos seus metabolitos secundários (Nookaraju e Agrawal, 2012). Existem inúmeras vantagens na utilização da micropropagação, no entanto, existem algumas preocupações, no que respeita a alterações genéticas resultantes deste processo (Debrath, 2011).
As variações somaclonais podem ser vistas como positivas, quer in vitro quer ex vitro, uma vez que podem aparecer características vantajosas, podendo por exemplo permitir à planta resistir a pragas, sendo este fato já discutido por vários autores (Debrath, 2011; Borse
et al., 2011; Damiano et al., 1997).
A análise da variabilidade genética é explorada na tentativa de seleção de genótipos superiores, estes dados são especialmente úteis quando associados a dados fenotípicos, tais como: resistência a doenças; qualidade e composição química de óleos essenciais; entre outros. Os marcadores moleculares mostram que em populações de regiões geográficas próximas, a variabilidade genética é menor e com o distanciamento a tendência é aumentar as diferenças genéticas, podendo não alterar o perfil químico dos óleos essenciais. Através destas análises pode inferir-se sobre alterações genéticas ao longo de diferentes gerações obtidas em cultura in vitro. O estudo da variabilidade genética permite verificar diferenças genéticas entre os indivíduos das diferentes gerações, bem como da planta mãe (Lerin et al., 2007).
A fidelidade genética é a manutenção da constituição genética de um clone através do tempo. No entanto, o protocolo de micropropagação pode ser severamente agressivo provocando variações somaclonais. Estas ocorrem principalmente como resposta ao stresse, imposto sobre a planta em condições de cultura, podendo manifestar-se na forma de duplicação de genes, metilação do DNA, rearranjos cromossómicos e mutações pontuais (Yadav et al., 2013).
A fidelidade genética dos tecidos dos clones obtidos em cultura pode ser influenciada: por aplicação de níveis baixos/altos de reguladores de crescimento; meios de cultura; pH; temperatura; luz; tipo de explantes e a implementação de subculturas para a manutenção da cultura ao longo do tempo. É importante estabelecer uniformidade genética das plantas micropropagadas para confirmar a sua qualidade para utilidade comercial (Singh et al., 2012).
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Os marcadores moleculares são referidos como a ferramenta mais desejável para comprovar a uniformidade genética das plântulas micropropagadas. Existem vários tipos de técnicas de análise molecular e cada marcador pode examinar diferentes porções do genoma. O genoma completo não pode ser estudado com base em apenas um tipo de marcador molecular. Segundo vários estudos comparativos em plantas micropropagadas, os marcadores moleculares ISSRs (Simple Sequence Repeats) são os mais eficientes para verificar a fidelidade genética dos indivíduos (Gantait et al., 2011).
A variação somaclonal é mais frequentemente observada quando as plantas são regeneradas a partir de células somáticas de cultura, principalmente durante a formação de
calli e cultura em suspensão (Borse et al., 2011).
1.1-Marcadores genéticos
Um marcador genético é, por definição, qualquer variação na sequencia de DNA de um ser vivo que o distinga de um outro. Assim sendo, considera-se marcador genético qualquer
locus, que pode ser relativo a um caracter morfológico, uma proteína ou um fragmento de
DNA, e cuja presença num agregado de genótipos se mostra como polimórfica (Bagali et al., 2010).
As características morfológicas que são controladas por um único locus podem ser utilizadas como marcadores genéticos desde que a sua expressão seja reprodutível em diferentes ambientes (Lerin et al., 2007).
Segundo Canhoto (2010) os marcadores genéticos podem ser agrupados em três categorias: marcadores morfológicos, marcadores bioquímicos e os marcadores moleculares.
Os marcadores moleculares podem ser subdivididos em marcadores bioquímicos (isoenzimas, aloenzimas) e baseados na molécula de DNA (Bagali et al., 2010).
Os marcadores moleculares apresentam a vantagem de refletir as alterações ao nível molecular, permitindo obter maiores níveis de polimorfismo, não serem influenciados pelo ambiente e serem independentes do órgão e da fase de desenvolvimento da planta (Bagali et
al., 2010).
Os marcadores moleculares são fragmentos específicos de DNA que podem ser identificados ao longo do genoma. Estes, por detetarem variações genéticas, podem fornecer informações úteis a diferentes níveis: estrutura da população, relações filogenéticas, padrão de biogeografia histórica e análises de ascendência e parentesco. Estes marcadores têm sido
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utilizados em várias aplicações, como a construção de mapas genéticos, análise de mapeamento comparativo, conhecimento da variação natural, identificação de genes economicamente importantes e na seleção assistida por marcadores. O grande desafio para os investigadores é a seleção dos marcadores para um determinado objetivo. Os marcadores devem possuir algumas propriedades, como elevado polimorfismo, hereditariedade co- dominante, longa distribuição no genoma, fácil acesso, entre outros. Até agora não existe nenhum marcador que reúna todas estas características (Lerin et al., 2007).
Dos vários marcadores genéticos, os mais adequados são os baseados na molécula de DNA, uma vez que, os marcadores baseados na análise de metabolitos secundários por exemplo, é bastante restrito a plantas que produzem uma gama adequada de metabolitos secundários (Bagali et al., 2010).
Vários tipos de marcadores moleculares são utilizados para avaliar o polimorfismo de DNA e são geralmente classificados como marcadores baseados em hibridação e marcadores com base na PCR. No primeiro caso, os perfis de DNA são visualizados através da hibridação DNA digerido por enzimas de restrição, com ajuda de um marcador, fragmento ou sequência de DNA conhecida (Bagali et al., 2010).
Os marcadores baseados em PCR envolvem a amplificação in vitro de sequências de DNA especificas ou loci, com a ajuda de sequências específicas ou arbitrariamente escolhidas, oligonucleotídeos (primers). Baseia-se na síntese enzimática de um segmento específico de DNA na presença da enzima DNA polimerase e de primers que podem ou não ser específicos. Tais primers delimitam a sequência de DNA da dupla cadeia a ser amplificada, e o resultado são milhões de cópias do fragmento em estudo (Bagali et al., 2010).
A análise RFLP (Restriction Fragment Lingth Polymorphism) foi uma das primeiras técnicas amplamente utilizadas para detetar variações ao nível das sequências DNA (Malacinski, 2005). Mais tarde foram desenvolvidas técnicas baseadas na PCR e entre elas pode referir-se: RAPDs (Random Amplified Polymorphyc DNA), com primers arbitrários e AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction), estes produzem grandes quantidades de polimorfismo de fragmentos de DNA, por todo o genoma, usando primers escolhidos ao acaso.
Com a conjugação da deteção de segmentos genómicos de restrição e a amplificação por PCR, surge um novo tipo de marcadores, os AFLPs (Amplified Frafment Length
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Polymorphism). Estes marcadores encontram-se distribuídos por todo o genoma de
procariontes e eucariontes. (Xavier et al., 2000).
Ao longo do genoma dos indivíduos eucariontes, existem várias cópias de sequências de DNA repetidas em tandem, chamadas de VNTR (número variável de repetição tandem). Os VNTRs são sequências curtas de bases que ocorrem em números variáveis dentro dos grupos de repetição em tandem. O número de repetições em tandem pode variar de um local para o outro dentro do genoma de um determinado indivíduo, e também pode variar entre indivíduos. Estas repetições são de dois tipos básicos: microssatélites, que consistem em repetições em tandem de 2 a 5 nucleotídeos ocorrendo em muitos locais do genoma, e as repetições minissatélites, que consistem em unidades de repetição maiores (30 a 35 pb). As repetições minissatélite maiores tendem a ocorrer em menos locais dentro do genoma de um indivíduo (Malacinski, 2005).
Recentemente, os marcadores relacionados com a amplificação de sequências entre SSRs (ISSRs) surgiram como um sistema alternativo de confiança. Esta técnica envolve a amplificação de segmentos genómicos flanqueados por sequências de microssatélites inversamente orientadas com a utilização de um único primer com sequências de SSR. As sequências são arbitrariamente selecionadas. Os ISSRs são herdados de modo Mendeliano e segregam como marcadores dominantes (Godwin et al., 1997).
Os ISSRs utilizam sequências de microssatélites como primers podendo ser di, tri, tetra ou pentanucleótidos sendo a sua execução simples, rápida e eficaz. Estes primers podem ser ancorados nas extremidades 3’ ou 5’, 2 a 4 nucleótidos degenerados para garantir a sua hibridação às extremidades das repetições genómicas. Nestes marcadores utilizam-se primers com 15 a 30 nucleótidos sendo a temperatura de annealing 45-65ºC, dependendo do conteúdo em GC. Os ISSRs detetam altos níveis de polimorfismo apresentam alta reprodutibilidade; é uma técnica barata e rápida; não requerem o conhecimento prévio da sequencia de DNA sendo muito utilizados em estudos de variabilidade genética (Mao e Fang, 2014). Além disso, estes marcadores apresentam multi-loci e características multi-alélicas que os tornam potencialmente mais eficientes para a análise de diversidade genética (Haji et al., 2014). Algumas desvantagens podem estar inerentes a estes marcadores moleculares, como o fato de serem do tipo dominante e pela possibilidade de serem amplificadas sequências com o mesmo tamanho que podem não corresponder a regiões homólogas (Zhao et al., 2009).
Os ISSRs têm uma elevada reprodutibilidade graças à utilização de primers mais longos (20-25pb), quando se compara com os primers dos RAPDs permitindo temperaturas de
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annealing mais elevadas, 45-60ºC, estas dependem do teor em GC do primer a ser utilizado
(Debnath, 2006). Vários estudos sobre a reprodutibilidade mostram que apenas as bandas fracas é que não são reprodutíveis (Reddy et al., 2002).
Atualmente existem muitos marcadores moleculares e estão, constantemente, a surgir novas tecnologias. Existem diferentes bases para a classificação dos marcadores moleculares (Canhoto, 2010).
No anexo IV são apresentados os marcadores mais utilizados em tecidos vegetais, onde constam algumas das suas principais características.
A variação somaclonal, requer múltiplos acontecimentos genéticos e/ou epigenéticos que afetam os padrões de expressão. Vários mecanismos moleculares podem ser responsáveis pela mutação da molécula de DNA e instabilidade genética que leva ao desenvolvimento de variações entre as populações. Tais mecanismos moleculares incluem danos na molécula de DNA, mutação, alteração da capacidade das células para reparar o DNA danificado ou mutado, alterando os genes para mecanismos de controlo do ciclo celular e a metilação de DNA. Os danos na molécula de DNA podem resultar de uma alteração espontânea da molécula, por exemplo, uma mutação causada durante a replicação do DNA, reparação DNA e/ou uma alteração química resultante da oxidação e metilação. A utilização de marcadores moleculares constitui uma ferramenta importante na caracterização genética, permite a identificação de regiões alteradas no genoma. No entanto, não permitem detetar aneuploidia molecular resultante da exclusão, amplificações, translocações, inserções, recombinações e alterações químicas (Zhao et al., 2009).
A metilação altera o DNA, sendo considerada uma das principais causas de modificação epigenética, é por vezes, observado nas experiências de cultura in vitro. A manutenção dos caracteres genéticos da planta mãe elite em cultura in vitro é um fato que não deve ser ignorado (Singh et al., 2012).
1.2-Métodos de Extração DNA
O isolamento de DNA genómico suficiente e de elevada qualidade é vital para as pesquisas em biologia molecular, uma vez que são vários os materiais intracelulares de plantas que interferem com o isolamento do DNA (Zhang et al., 2013).
Até à data têm sido publicados inúmeros métodos para o isolamento de DNA. Os métodos destinados a melhorar a qualidade e rendimento do DNA em diferentes espécies de
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plantas, e incluem principalmente sulfato de sódio – método SDS (dodecil- sulfato de sódio) - (Marmur, 1961); método CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamónio) - (Doyle e Doyle, 1990) e o método NaOH (Hidroxido de Sódio) - (Hill-Ambroz et al., 2002) disponíveis em vários kits comerciais (Zhang et al., 2013).
Para aumentar a velocidade e eficiência da técnica PCR, numerosos protocolos têm sido desenvolvidos para reduzir o período de tempo e para melhorar a qualidade de DNA extraído, a maioria dos quais são baseados em CTAB ou SDS, detergentes iónicos utilizados para romper membranas para libertar o DNA das células (Satya et al., 2013).
Um protocolo de isolamento de DNA deve ser simples, rápido, eficiente e deve produzir concentrações desejáveis de DNA de elevada qualidade, adequado para a análise molecular. A quantidade de tecido vegetal que é utilizada para a análise molecular influencia a qualidade e quantidade de DNA isolado. O rendimento depende da quantidade de tecido vegetal por volume de tampão (Moyo et al., 2008).
Segundo os estudos realizados por Moyo e colaboradores (2008) o rendimento mais elevado foi obtido a partir de 0,1-0,2g de tecido vegetal por 500 mL de tampão de extração mas depende das espécies. Encontrar o equilíbrio correto entre o peso dos tecidos vegetais e o volume de tampão de extração reduz a probabilidade de co-precipitação de contaminantes com o sedimento de DNA. Uma vez que o tampão é o responsável pela lise das membranas celulares e saída dos conteúdos celulares. Sem DNA de qualidade os marcadores moleculares deixam de ser eficientes.
A maioria das plantas medicinais, aromáticas e lenhosas contêm elevado conteúdo de metabolitos secundários, como os flavonóides, polifenois entre outros. Estes componentes implicam grandes dificuldades no isolamento do DNA dos tecidos vegetais. A extração e a purificação dos ácidos nucleicos, nomeadamente o DNA a partir de amostras de plantas é uma etapa fundamental para se obter alta eficiência na amplificação, nos protocolos que usam a PCR (Kasajima et al.,2013). Apesar da facilidade de amplificação de DNA possibilitada pela técnica de PCR, existe a necessidade de uma adequada padronização dos protocolos a serem utilizados em todas as etapas, desde a obtenção do DNA até à técnica PCR.
O DNA, na sua forma original de dupla cadeia, apresenta alta estabilidade e é resistente. No entanto, alguns cuidados têm de ser tomados para se evitar a sua degradação (Kasajima et
al., 2013). As amostras de tecidos vegetais devem ser cuidadosamente colhidas,
imediatamente congeladas e armazenadas a -80ºC. No início do processo de isolamento devem ser reduzidos a um pó muito fino por maceração em azoto líquido.
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Após a lise das células, o DNA deve ser separado do resto do conteúdo celular como as proteínas, ele é precipitado e suspenso num volume adequado de solução tampão. Para cada tipo de amostra, vários são os protocolos testados, adaptados e otimizados de forma a adquirir DNA de boa qualidade (Kasajima et al., 2013).
A manipulação das amostras durante todo processo deve ser realizada com luvas, para que parte do DNA não seja degradado por nucleases, enzimas que normalmente estão presentes nos fluídos corporais, estando presente nas mãos. O material plástico deve ser novo e esterilizado (Kasajima et al., 2013).
A extração de DNA de plantas envolve a lise das células vegetais por meio de tratamento com detergente, posteriormente a separação e por fim a precipitação do DNA. A preparação do DNA das plantas pela técnica da centrifugação em gradiente de cloreto de césio produz DNA de alta pureza. Outro protocolo que tem sido largamente utilizado pela sua facilidade e rapidez é aquele que utiliza o detergente CTAB, que solta o DNA, formando um complexo de ligação com ele (Kasajima et al., 2013).
Um estudo realizado por Roso e Vidal (2010) mostrou que os melhores resultados em relação à qualidade e quantidade de DNA extraído realizou-se a partir de folhas muito jovens. A maceração em pequena escala utilizando um bastão de alumínio num tubo de eppendorf mostrou ser mais eficiente, quando o material foi recolhido e imediatamente congelado em azoto líquido ou adicionar PVP no tampão de extração, com concentração de 1 a 2%. No anexo V consta uma tabela onde se apresenta a comparação entre três protocolos de extração de DNA. Segundo os estudos de Roso e Vidal (2010) o protocolo adaptado de Murray & Thompson (1980) mostrou ser o único a não apresentar problemas de contaminação nas amostras testadas, enquanto a quantidade de DNA extraída também foi superior.
O DNA pode ser extraído de forma eficiente a partir de folhas mais velhas com o auxílio do tampão PVPP (polivinipolipirrolidona), a partir do qual a quantidade e qualidade de DNA suficiente nunca podem ser extraídos com quaisquer outros protocolos (Roso e Vidal, 2010).
Posteriormente o DNA é separado por meio do tratamento com isopropanol e etanol. Este protocolo pode ser adaptado de várias formas, para diversos tipos e quantidade de amostras de tecido vegetal (Kasajima et al., 2013).
O DNA deve ser protegido da ação dos compostos fenólicos, estes oxidam a molécula de DNA, tornando este inacessível às enzimas de restrição. A contaminação por parte dos compostos fenólicos pode ser evidenciada pela coloração do DNA que tende e ficar com tons
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acastanhados. Para evitar o efeito oxidativo pelos polifenóis, deve ser adicionado ao tampão de extração agentes anti-oxidantes, como o pvp (polivinilpirrolidona) ou BSA (albumina do soro bovino) (Kasajima et al., 2013; Zhang et al., 2013).
Os ácidos nucleicos devem ser separados dos polissacáridos. Estes inibem a ação de enzimas de restrição e tornam a amostra de DNA excessivamente viscosa, interferindo na migração do DNA durante a eletroforese. O detergente CTAB é utilizado com essa finalidade, já que polissacáridos e ácidos nucleicos possuem solubilidade diferenciada na presença deste detergente (Kasajima et al., 2013).
Segundo Zhang e colaboradores (2013) para reduzir moléculas como a sacarose é necessário adicionar ao tampão de extração uma concentração elevada de NaCl. A proteinase K pode ser utilizada para degradar as proteínas existentes em solução de DNA. Estes reagentes são eficientes até certo ponto, pois em algumas espécies não foi possível remover o conteúdo celular e isolar a molécula de DNA.
Por exemplo o DNA de plantas recalcitrantes pode ser analisado de forma segura, qualitativamente e quantitativamente por eletroforese em gel. Com base na eletroforese em gel, a pureza do DNA bruto é de apenas 10%, mas pode ser purificado por ultracentrifugação em CsCl. Os procedimentos de extração de DNA através deste protocolo podem melhorar a análise genética de plantas recalcitrantes (Kasajima et al., 2013).
Existe a necessidade de um novo método de isolamento de DNA que consiga eliminar todas as substâncias celulares. Assim sendo, surge o método inovador de reciclagem de isolamento de DNA para tecidos vegetais.
Este método permite que uma única amostra de tecido vegetal seja tratada quatro vezes pelo tampão de extração (CTAB), correspondendo a quatro precipitações. Esta etapa de reciclagem foi introduzida no método CTAB (Zhang et al., 2013).
1.3-Utilização dos marcadores moleculares nas plantas medicinais
O genoma das plantas têm aproximadamente 20000 – 60000 genes e muito provavelmente 15-25% desses genes codificam enzimas para o metabolismo secundário existentes no reino das plantas. Nos últimos anos, os marcadores moleculares baseados no DNA têm sido utilizados na identificação de culturas e na análise das relações genéticas entre os indivíduos e espécies, contribuindo também, para estudos evolutivos e ecológicos (Lerin et
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As etapas fundamentais de um programa de melhoramento de plantas são: obtenção da variabilidade genética; seleção de indivíduos superiores e a avaliação de materiais genéticos promissores para lançamento comercial. O uso de marcadores moleculares pode auxiliar o melhoramento de plantas pois possibilita aceder diretamente ao genótipo de um indivíduo. É necessário primeiro identificar marcadores associados a determinadas características através do mapeamento molecular. Uma vez que esta informação esteja disponível, é possível selecionar indivíduos com o marcador de interesse, sem que seja necessário avaliar o fenótipo dos mesmos (Canhoto, 2010).
A manutenção das populações depende da existência de um nível suficiente de diversidade genética para enfrentar variações bióticas e abióticas. Portanto, a análise da variação de populações com base em marcadores genéticos e bioquímicos é necessário para as práticas de conservação eficazes e eficientes e para a utilização dos recursos naturais (Ali et
al., 2012).
De acordo com Gómez-Galera e colaboradores (2007) mais de 25% das novas drogas aprovadas nos últimos 30 anos são baseadas numa molécula de origem vegetal, e cerca de 50% dos produtos químicos mais vendidos derivam dos metabolitos secundários das plantas. Cerca de 40.000 amostras de plantas mostraram atividade significativa contra SIDA, a partir do isolamento de cinco substâncias químicas derivadas dessas mesmas plantas. Assim sendo, os marcadores moleculares tornam-se numa ferramenta muito valiosa, pois permitem selecionar os indivíduos que apresentam determinados genes responsáveis pela produção de determinadas substâncias químicas, indispensáveis por exemplo, para o tratamento de algumas patologias.
A redução da variabilidade genética e fenotípica, assim como o controlo do processo de cultivo são os ingredientes principais para obter níveis de pureza das espécies vegetais. Essa redução permite dar continuidade da espécie ao longo dos tempos, evitando a perda de genes (Gomez-Galera et al., 2007). No entanto existem muitas razões para querer alterar o perfil dos metabolitos secundários das plantas medicinais e aromáticas, entre as quais, melhorar características agronómicas através da expressão de um metabolito que pode proteger a planta contra o ataque de insetos ou patogénicos; redução dos níveis de fatores nocivos na alimentação humana e animal, aumentando os níveis de componentes benéficos; utilizar plantas intactas, órgãos ou células como veículo de produção de novos compostos, ou para aumentar os níveis de composto alvo que podem estar presentes em pequenas quantidades.
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Existem várias estratégias para o conseguir, como o aumento do fluxo para o destino da