MICROSSATÉLITES ISOLADOS A PARTIR DE BIBLIOTECA GENÔMICA ENRIQUECIDA (TC/AG) DE Arachis hypogaea.

Leoi, L¹; Bertioli, D.¹

Universidade Católica de Brasília, Brasil. lleoi@pos.ucb.br

Por volta de 10 mil anos atrás, após a mudança do homem nômade-caçador para a sociedade agrária, surgiram as primeiras atividades agrícolas, dando início às plantas cultivadas. A seleção continua, geração após geração, de linhagens que continham características diferenciadas por tais agricultores resultaram em uma progressiva restrição da base genética na subseqüente população.

Entre as plantas cultivadas com restrição na base genética, encontra-se o amendoim da espécie Arachis hypogaea L. (Leguminosae). Esta espécie é caracterizada por ser uma alelotetraplóide, provavelmente oriunda por domesticação da espécie também tetraplóide A. monticola e esta por sua vez do cruzamento entre duas espécies silvestres do gênero Arachis. Devido ao estreitamento genético, têm - se aumentado as preocupações por parte dos pesquisadores em relação às pragas em geral. Em escala global, as pragas podem causar perdas superiores a 70% da colheita no cultivado. O maior interesse pela prospecção, resgate e caracterização de germoplasma das espécies do gênero Arachis reside em seu potencial de fornecimento de genes úteis para o melhoramento do amendoim cultivado. O cultivo desta espécie está difundido nas áreas tropicais e subtropicais. Entre os seis maiores produtores mundiais está o Brasil, sendo os estados de São Paulo, Rio Grande do Sul e Paraná os principais produtores brasileiros. Uma das formas de aumentar a competitividade do produto brasileiro no mercado internacional e ao mesmo tempo incrementar o consumo interno desta oleaginosa é através do melhoramento genético, principalmente em genes de resistência contra pragas; qualidade da semente; plantas com ciclo extremamente curto e alta resistência ao estresse hídrico. O desenvolvimento de tecnologias de análise genômica na cultura do amendoim ainda é incipiente, porém já existem publicações de vários grupos de pesquisa envolvendo marcadores RFLP (Restriction Fragment Length

Polimorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Randomly

Amplified Polymorphic DNA) e SSR (Simple Sequence Repeats ou microssatélites)

na caracterização do germoplasma de Arachis.

Marcadores microssatélites são ideais para aplicações no melhoramento de plantas por sua natureza co-dominante, alto polimorfismo, riqueza em alelos, alta heterozigosidade e conteúdo informativo. Os microssatélites foram obtidos através de metodologias de enriquecimento de bibliotecas gênomicas para seqüências repetitivas contendo dinucleotídeos AG/TC, não ocorrendo uma pré-seleção por hibridização ou PCR-ancorado (Polymerase Chain Reaction). Foram seqüenciados 598 clones a partir de uma única biblioteca genômica enriquecida. Estes clones foram processados com o auxílio de um script Perl (Sort chromats for microsats), tendo como resultado a identificação total de 144 seqüências com microssatélites denominadas de contigs (hits). Após análise de redundância o número de contings reduziu para 138 e destes, apenas 80 (58%) tinham condições de desenhar marcadores por apresentarem tamanho suficiente de repetição e suas posições na seqüência serem adequadas para os desenhos dos pares de primers flanqueadores. Dos 80 contigs supracitados, 56,25% (45 contigs) continham seqüências simples ou

compostas com 12 ou mais repetições e tamanho médio de 26 motifs. A distribuição do tamanho das repetições versus os números de contigs de um total de 45 são mostradas na figura 01. Todos os cromatogramas que continham as seqüências repetidas foram previamente analisados e visualizados com o auxílio do programa interativo Staden, cuja função foi a de organizar e verificar as sobreposições das amostras, além de realizar a inspeção e edição manual das seqüências. Os pares de primers flanqueadores das regiões repetidas foram desenhados com o auxílio do programa Primer3 e os parâmetros específicos adotados (Tabela 01).

Figura 01. Distribuição dos loci de microssatélites desenvolvidos por método de captura por hibridização. Os loci foram agrupados pelos comprimentos de repetições. A média do comprimento das repetições foi de 26 motifs.

Tabela 01. Parâmetros específicos selecionados para os desenhos dos primers SSR no programa Primer 3.

Parâmetros Classes

Mínimo Ótimo Máximo

Tamanho do Primer 17mer 20mer 25mer

Temperatura de Ligação 57°C 60°C 63°

Quantidade de GC no Primer 30% 70%

Tamanho do Produto 100 pb 300 pb

Todas as seqüências obtidas através do seqüenciamento foram analisadas posteriormente através do programa Blast-X para se verificar homologia com seqüências depositadas no banco de proteínas de Arabidopsis thaliana. Entre as 576 seqüências analisadas, 42 apresentaram homologia com algum gene, sendo destas, 13 oriundas de seqüências com regiões ricas em microssatélites (Figura 02). Entre as seqüências sem SSR foram encontradas homologias freqüentes com retrotransposons, sugerindo abundância destes elementos no genoma de A. hypogaea (Tabela 02 e 03).

Dos 80 pares de primers desenhados, 77 amplificaram os fragmentos com o tamanho esperado em A. hypogaea. Em adição, 80% dos primers otimizados apresentaram polimorfismos quando comparados com outras espécies do gênero

Distribuição do tamanho de microssatélites TC/AG

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 11- 15 16- 20 21- 25 26- 30 31- 35 Comprimento das repetições

Nº

de

c

Arachis, entre elas, A. cardenasi, A.duranensis, A. sternosperma, A.batizocoi, A. honey, A. ipaensis, A. magna.

Figura 02. Fluxograma das etapas de análise computacional das seqüências de A. hypogaea.

Tabela 02. Resultado do Blast-X das seqüências presentes na Pasta NO-HITS para busca de similaridade contra um banco de dados local de gene de Arabidopsis thaliana.

Apoio Financeiro: Universidade Católica de Brasília (UCB), Funarbe e Protetab.

Homologias das seqüências de A. hypogaea sem SSR Freqüência encontrada

(E)<10-6

Retroelement 20

hypothetical protein 4

topoisomerase II 1

disease resistance protein, putative 1

Serine/threonine phosphatase PP7, putative 1

phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isolog 1

putative auxin-induced protein 1

Homologias de genes encontrados 29

Homologias das seqüências de A. hypogaea com SSR Freqüência encontrada

(E)<10-6

putative protein 6

retroelement 2

alpha subunit of F-actin capping protein 1

ATP dependent copper transporter 1

auxin-independent growth promoter, putative 1

serine/threonine kinase, putative 1

Tic22, putative 1

Homologias de genes encontrados 13

Biblioteca Genômica 598 clones sequenciados Sort Chromats for Microsats No -Hits Hits 144 Pregap4 (qualidade) 366 144 Gap4 Assembly 340 138 311 seqüências

sem Similaridade com Similaridade29 seqüências sem Similaridade125 seqüências com Similaridade13 seqüências

Primer-

-

454

Blast-X (A. thaliana)

E-value 10-6

3

80 _-Marcadores SSR -

ANÁLISE DAS RELAÇÕES DE CRUZABILIDADE EM UM RARO HÍBRIDO