miRNA x CNV

A variação do número de cópias pode ser uma forma comum de variabilidade para moléculas de miRNA (MARCINKOWSKA et al., 2011). Wong et al. (2007) reportaram a presença de miRNAs detectados em regiões de CNV e reconheceu as potenciais consequências deste achado. Uma outra busca genômica de CNVs identificou algumas regiões duplicadas abrigando genes de miRNA, alguns deles relacionados com doenças, como esquizofrenia e autismo (ROGAEV; ISLAMGULOV; GRIGORENKO, 2008). Na

figura 8 está descrito um esquema de como o miRNA pode ser influenciado na presença

de CNVs.

Woodwark e Bateman (2011) classificaram os genes relacionados a CNVs em 3 grupos: tipo 1 (se encontra inteiramente dentro de uma CNV), tipo 2 (se encontra parcialmente dentro de uma CNV) e tipo 3 (a CNV se encontra dentro da região compreendida ao gene). As CNVs tipo 1 estavam mais relacionadas a genes da resposta imune, as CNVs tipo 3 estavam relacionadas com genes envolvidos na sinalização celular, e as CNVs tipo 2 eram uma mistura dos tipos 1 e 3. Foi observado que as CNVs tipo 3 sofriam maior influência da regulação por miRNAs e eram expressas mais monoalelicamente, enquanto que as CNVs tipo 1 sofriam pouca regulação por miRNA devido às suas altas taxas de mutação, e eram menos expressas monoalelicamente. Foi descoberto que, apesar dos genes de CNVs tipo 1 variarem em número de cópias conjuntamente com a CNV, a maioria dos genes tipo 1 possuíam os mesmos níveis de expressão em relação ao número de cópias selvagem. Pôde-se inferir a partir daí que esses genes podem sofrer um controle de compensação da dosagem homeostática.

Figura 8: Representação esquemática do transcrito primário de um miRNA. A posição da sequencia do pré-miRNA está indicada como uma estrutura em forma de grampo. Linhas pontilhadas representam transcritos que não devem ser produzidos pela falta de regiões promotoras ou sequencias iniciadoras. Os quadros laranja representam as regiões de CNV em deleções, duplicações ou duplicações dispersas. Cada grupo (A, B, C e D) representa a CNV localizada em diferentes partes do gene do miRNA. Os sinais “+” , “-“ e “0” indicam potencial para aumento, diminuição ou nenhuma mudança para a expressão do miRNA

Fonte: Marcinkowska et al. (2011)

Pelo fato de as CNVs participarem de 18% das variações na expressão de genes, existe uma correlação plausível em que a expressão dos miRNAs pode ser modificada pelo número de cópias em CNVs, bem como sabe-se que os genes de miRNAs estão geralmente amplificados ou perdidos em tumores. Marcinkowska et al. (2011) analisaram a co-localização de loci de miRNAs em regiões de CNV, e identificaram e validaram 209 miRNAs nessa condição usando banco de dados DGV.

Krill-Burger et al. (2012) em uma análise de CNVs em tecido de carcinoma celular renal, identificou variações em número de cópias específicas para diferentes

classificações de tumores. As regiões de CNV identificadas em comum para todos os tipos de tumor não eram compostas de DNA codificante, e foram encontradas, em outras regiões de CNVs, sequências codificantes para três miRNAs, 12 mRNAs, deleções de genes envolvidos com modificação de histonas e remodelamento de cromatina. Isso reforça a idéia que a variação do número de cópias de alguma forma influencia a expressão de moléculas não codificadas, como os miRNAs.

Garcia-Orti et al. (2012) avaliaram a influência das CNVs na expressão de miRNAs em Leucemia Mielóide Aguda. Dezenove miRNAs possuiam associação significante entre a sua expressão e a CNV na qual estavam relacionados. Dentre eles, o miR-370 estava em uma região de alta amplificação e superexpresso. Foi visto que o alvo desse miRNA é um supressor tumoral (NF1) comumente subexpresso na Leucemia Mielóide Aguda. Uma análise funcional mostrou que a superexpressão do miR-370 levou à inativação do NF1, evidenciando que a influência da CNV sobre o miR-370 é um mecanismo envolvido na subexpressão ou inativação do NF1 (AN et al., 2013; DI FIORE et al., 2013). Nesse estudo não foi feita a correlação estatisticamente válida da influência da CNV sobre a expressão do miR-370, porém é demonstrado que isso, de fato, pode acontecer.

Estudos mostram que as CNVs podem influenciar na dosagem de genes associados a elas, incluindo miRNAs e unidades codificadoras de proteínas processadoras de miRNA, como a DICER1 e ARGONAUTE2. Wu; Zhang; Li (2012) descreveram uma alta frequência em CNVs que contêm genes processadores de miRNA. Um total de 209 miRNAs foram relatados em regiões de CNV. Foram encontrados 1.134 genes regulados exclusivamente por CNV-miRNAs. Concluiu-se que as CNV-miRNAs tendem a regular em média um número maior de genes-alvo, e que esses alvos tendem a ter uma variabilidade maior de expressão em populações. Esses genes-alvo também tendem a ter maior expressão diferencial entre tecidos e estados de desenvolvimento celular.

Uma correlação inversa entre CNV-miRNAs e seus alvos foi estabelecida: Se há a deleção de um miRNA em uma região de CNV, logo o seu gene-alvo pode ter sua dosagem gênica aumentada, já que o miRNA não está mais exercendo sua função de

inibição de mRNAs-alvo. Porém, se esse gene-alvo também se encontra em uma região de CNV, e esta região se duplica, pode não haver mudança alguma no seu produto gênico. Mesmo dessa forma, há alterações que levam a diferenças fenotípicas, devido ao efeito pleiotrópico dos miRNAs (VAISHNAVI et al., 2013).

O câncer colorretal é uma doença de importância global, segundo dados epidemiológicos. A elucidação de mecanismos isolados que influenciam a tumorigênese tem importante papel na compreensão das desordens causadoras do câncer. Dentro do contexto dos miRNAs e CNVs exercendo influência sobre as doenças, não se pode ignorar que não apenas um, mas vários caminhos moleculares, em nível de mutações e alterações epigenéticas, regulam paralela e conjuntamente as diferentes vias de sinalização que levam ao desenvolvimento do câncer colorretal.

A análise da expressão diferencial dos miRNAs tem sido elucidada, bem como a variação do número de cópias. Alguns estudos já relacionam esses eventos com algumas características de desfecho clínico, como remissão e óbito, porém, até o momento, não existem relatos na literatura relacionando a influência dos CNVs no padrão de expressão de miRNAs em câncer colorretal. Uma análise profunda nesse assunto se torna essencial, em consequência da crescente disponibilidade de informação em bancos de dados de miRNAs e CNVs, uma vez que já possuímos o conhecimento de vários miRNAs diferencialmente expressos, bem como de CNVs no câncer colorretal.

Neste contexto, este trabalho propõe investigar a relação entre miRNAs e CNVs em câncer colorretal, bem como correlacionar essa informação com os dados de desfecho clínico dos indivíduos, a fim de se obter uma visão mais integrada a respeito do desenvolvimento dessa doença.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Correlacionar a expressão diferencial de microRNAs com CNVs em espécimes de câncer colorretal visando compreender se a variação do número de cópias influencia na diferença de níveis expressão de miRNAs em CCR.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Analisar a expressão diferencial de miRNAs entre tecidos normais, tumorais e linfonodais por qPCR;

 Analisar a Variação do Número de Cópias entre tecidos normais, tumorais e linfonodais por qPCR;

 Comparar os dados obtidos nos experimentos, verificando se as alterações de número de cópias de CNV no genoma podem modificar os níveis de expressão dos miRNAs em CCR;

4 MATERIAL E MÉTODOS