Morfologia

A morfologia e as medidas dos diâmetros das fibras contendo nanopartículas de HA e Nb2O5 são apresentadas na figura 29. Todas as amostras apresentaram estruturas lisas, aleatoriamente orientadas e livres de gotículas. As membranas PG, PGHA, PGHANb-3, PGHANb-7 e PGHANb-10 apresentaram diâmetro médio de fibras variando de 123 a 156nm. A incorporação de nanopartículas não alterou a morfologia ou o diâmetro das fibras, sugerindo que o processo de electrospinning gerou membranas uniformes e reprodutíveis, mesmo com a incorporação de nanopartículas. As micrografias com alta magnificação (x20.000) das membranas contendo nanopartículas de HA e Nb2O5 confirmam a formação de fibras uniformes, aleatoriamente distribuídas e livres de gotículas. É possível notar a presença das nanopartículas moderadamente agregadas na superfície das fibras, conforme destacado pelas setas amarelas. Essa morfologia pode se assimilar topograficamente à matriz extracelular nativa do osso humano.

Figura 29. Micrografias de MEV com baixa (x5000) e alta (x20000) magnificações das membranas PG, PGHA, PGHANb-3, PGHNb-7 e PGHANb-10.

5.2.3.2. Molhabilidade

Os resultados de molhabilidade das membranas nanofibrosas são mostrados na figura 30. A introdução da gelatina alterou o caráter das membranas de hidrofóbico para hidrofílico. Os ângulos de contato revelaram que o PCL puro exibiu um alto grau de hidrofobicidade (133°) e as membranas contendo gelatina exibiram um comportamento hidrofílico (ângulos de contato de ~0° dentro de 10s). Esse comportamento é devido à presença de grupos funcionais amina e carboxila na estrutura da gelatina (XUE et al., 2014), os quais criam ligações com o hidrogênio presente na água, aumentando a hidrofilicidade (KALWAR et al., 2016). Superfícies hidrofílicas desempenham um papel importante no comportamento celular para aplicações em biomateriais (REN et al., 2017). Estudos demonstraram que as superfícies hidrofílicas podem aumentar a afinidade com as células e contribuir para a proliferação celular (ZHENG et al., 2014). Além disso, a adição de nanopartículas atrasou ligeiramente a absorção de água, mas não alterou significativamente a hidrofilicidade das membranas. Isso pode ter ocorrido porque as nanopartículas podem ter atuado como uma barreira física, bloqueando a entrada d’água. Um estudo anterior verificou que a adição de nanopartículas na matriz polimérica diminuiu a taxa de degradação in vitro e inibiu a difusão d’água (ZHOU et al., 2013).

Figura 30. (A) Ângulo de contato das membranas (PCL pura, PG, PGHA, PGHANb-3, PGHNb-7 e PGHANb-10) e (B) imagens de ângulo de contato de membranas PCL pura, PG e PGHANb-7.

5.2.3.3. Propriedades Mecânicas

As propriedades mecânicas das membranas nanofibrosas sob condições secas e molhadas (imersas em solução tampão fosfato salina) são mostradas na tabela 5. Os resultados são apresentados em média e desvio padrão. As letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas. Os resultados de resistência à tração, módulo de Young e alongamento na ruptura das membranas nanofibrosas não mostraram diferenças estatisticamente significantes entre as amostras, porém houve diferenças estatisticamente significantes (p<0,05) entre as amostras secas e molhadas. A adição de nanopartículas não melhorou as propriedades mecânicas das membranas nanofibrosas. A resistência à tração sob condições úmidas foi reduzida em 34%, 38%, 36%, 27% e 48% para as amostras de PG, PGHA, PGHANb-3, PGHANb-7 e PGHANb-10, respectivamente. O módulo de Young sob condições úmidas apresentou um decréscimo de 61%, 67%, 55%, 52% e 62% para as amostras de PG, PGHA, PGHANb-3, PGHANb-7 e PGHANb-10, respectivamente. O alongamento na ruptura sob condições de umidade também diminuiu em 61%, 52%, 49%, 46% e 62% para as mesmas amostras, respectivamente. Esses resultados ainda apresentam uma vantagem global, uma vez que a adição de nanopartículas reteve as propriedades mecânicas da matriz original ao mesmo tempo que conferiu uma melhoria nas propriedades biológicas. Alguns autores demonstraram que a adição de nanopartículas em matrizes obtidas por electrospinning aumentou as propriedades mecânicas (YANG et al., 2009) enquanto outros mostraram que a adição de nanopartículas enfraqueceu as membranas (FUJIHARA; KOTAKI; RAMAKRISHNA, 2005).

Tabela 5. Resistência à tração, módulo de Young e alongamento na ruptura das membranas PG, PGHA, PGHANb-3, PGHANb-7 e PGHANb-10 sob condições secas e molhadas.

Amostras

Resistência à Tração (MPa) Módulo de Young (MPa) Alongamento na Ruptura (%)

Seco Molhado Seco Molhado Seco Molhado

PG 10,2a _{(±1,0) 6,7}b _{(±1,3) 40,3}a _{(±15,7) 15,6}b _{(±1,9) 118,9}a _{(±33,2) 46,5}b _(±10,3)

PGHA 9,1a _{(±1,6) 5,7}b _{(±1,3) 32,6}a _{(±10,0) 10,6}b _{(±5,7) 111,6}a _{(±26,8) 53,3}b _(±10,2)

PGHANb-3 10,7a _{(±3,1) 6,8}b _{(±1,3) 33,1}a _{(±18,0) 14,9}b _{(±5,2) 105,3}a _{(±24,9) 53,8}b _(±9,9)

PGHANb-7 8,8a _{(±2,1) 6,4}b _{(±1,8) 36,3}a _{(±6,3) 17,4}b _{(±6,9) 92,9}a _{(±32,3) 50,5}b _(±14,4)

5.2.3.4. Degradação In Vitro

Os resultados de degradação in vitro das membranas nanofibrosas são apresentados na figura 31A. As membranas apresentaram uma taxa de degradação similar em 7, 14 e 28 dias. No entanto, as membranas PG e PGHA exibiram uma taxa de degradação mais rápida em 56 dias quando comparadas àquelas com maiores quantidades de nanopartículas (PGHANb-3, PGHANb-7 e PGHANb-10). Esse resultado pode ser atribuído à formação de uma matriz estrutural mais estável formada pela interação entre o polímero e as nanopartículas (SHARMA et al., 2016). A redução da taxa de degradação em amostras contendo partículas é consistente com resultados anteriores (MOHAMED; MOSTAFA, 2008; PETER et al., 2010). Isso sugere que as nanopartículas podem ter restringindo a entrada da solução de PBS nas fibras e, consequentemente, retardado a taxa de degradação das membranas (ZHOU et al., 2013). A figura 31B mostra as micrografias das membranas PG e PGHANb-7 recém- preparadas e após 28 dias de imersão em PBS. As membranas recém-preparadas apresentaram fibras com morfologia lisa e após 28 dias de imersão em PBS as fibras aprensetaram morfologia rugosa e inchada.

Figura 31. (A) Degradação in vitro das membranas (PG, PGHA, PGHANb-3, PGHANb-7 e PGHANb- 10) em diferentes períodos (7, 14, 28 e 56 dias) e (B) micrografias de MEV das membranas PG e PGHANb-7 recém-preparadas e após 28 dias de imersão em PBS.

Nota: As barras de erros representam o desvio padrão e letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas (p<0,05).

5.2.3.5. Bioatividade

A bioatividade das membranas nanofibrosas foi avaliada através da determinação da capacidade de suas superfícies em facilitar a formação de apatita, como mostrado na figura 32. As membranas nanofibrosas foram embebidas em uma solução de fluído corporal simulado (SBF), cujas concentrações iônicas são quase iguais às do plasma sanguíneo humano (KOKUBO; TAKADAMA, 2006). Não houve formação de hidroxiapatita em membranas sem nanopartículas (PG) até 2 semanas de incubação em SBF. Esse resultado é condizente com a literatura, pois a formação de apatita não ocorre espontaneamente na maioria dos polímeros sintéticos sem que haja algum pré-tratamento para ativar suas superfícies (YANG et al., 2009). As membranas contendo nanopartículas apresentaram formação de hidroxiapatita e os resultados aumentaram em 14 dias. As membranas contendo Nb2O5 (PGHANb-3, PGHANb-7 e PGHANb-10) ao menos dobraram os teores de cálcio (cálcio) e fosfato (fósforo) de 7 para 14 dias, enquanto que a membrana contendo apenas HA (PGHA) aumentou em 32% do Ca e 11% do conteúdo de P de 7 a 14 dias. A membrana PGHANb-10 apresentou um aumento triplicado nos teores de Ca e P quando incubada por 14 dias, o que sugere uma bioatividade ainda maior. A membrana PGHANb-10 apresentou maior bioatividade no tempo de 14 dias. As micrografias sugerem que os cristais de hidroxiapatita foram nucleados nas superfícies das nanopartículas, as quais estavam distribuídas ao longo de toda a amostra. Além disso, esses resultados demonstram que, embora as nanopartículas de Nb2O5 e HA estivessem agregadas em pequenos aglomerados, esses pequenos aglomerados foram homogeneamente dispersos por toda a superfície da membrana. Esses resultados corroboram com estudos anteriores que também demonstraram que o Nb2O5 induziu o crescimento de cristais de hidroxiapatita (BONADIO et al., 2013; KARLINSEY et al., 2006). A formação de apatita pode ser atribuída à dissolução parcial das nanopartículas de HA e à liberação subsequente de íons cálcio, os quais podem favorecer a formação de apatita e também devido à exposição de nanopartículas na superfície das membranas que poderiam fornecer locais de nucleação e crescimento de apatita (KOKUBO, 1998).

Figura 32. Micrografias de MEV das membranas PG, PGHA, PGHANb-3, PGHANb-7 e PGHANb-10 recém-preparadas e após imersão em SBF por 7 e 14 dias.