UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS CENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E ENGENHARIA DE MATERIAIS
Tese
Membranas Nanofibrosas Obtidas por Electrospinning Contendo Nanopartículas de Pentóxido de Nióbio e suas Aplicações em Biomateriais
Natália Hadler Marins
Natália Hadler Marins
Membranas Nanofibrosas Obtidas por Electrospinning Contendo Nanopartículas de Pentóxido de Nióbio e suas Aplicações em Biomateriais
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutora em Ciência e Engenharia de Materiais.
Orientador: Prof. Dr. Neftalí Lenin Villarreal Carreño
Natália Hadler Marins
Membranas Nanofibrosas Obtidas por Electrospinning Contendo Nanopartículas de Pentóxido de Nióbio e suas Aplicações em Biomateriais
Tese aprovada, como requisito parcial, para obtenção do grau de Doutora em Ciência e Engenharia de Materiais do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas.
Data da defesa: 22/02/2019
Banca examinadora:
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Neftalí Lennin Villarreal Carreño (orientador)
Doutor em Química pela Universidade Federal de São Carlos
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Tomasz Tański (coorientador)
Doutor em Engenharia Mecânica pela Universidade Tecnológica da Silésia
___________________________________________________________________ Prof.ª Dr.ª Amanda Dantas de Oliveira
Doutora em Ciência e Engenharia de Materiais pela Universidade Federal de São Carlos
__________________________________________________________________ Prof.ª Dr.ª Fernanda Nedel
Doutora em Biotecnologia pela Universidade Federal de Pelotas
___________________________________________________________________ Prof.ª Dr.ª Mabel Miluska Suca Salas
Doutora em Odontologia pela Universidade Federal de Pelotas
___________________________________________________________________ Prof.ª Dr.ª Fabiula Danielli Bastos de Sousa
Dedico este trabalho ao meu esposo,
Agradecimentos
A Deus, pela vida;
Aos meus pais, Clarisse e Antônio, por tudo em minha vida e por sempre me incentivarem a estudar;
Ao meu esposo e amigo, Ricardo Marques, por toda a compreensão, parceria, dedicação, incentivo, amor, amizade, carinho e principalmente pelo ótimo convívio díario. Muito obrigada por tudo.
Ao meu orientador, prof. Neftalí Carreño, pelo conhecimento e orientação; A minha orientadora no Canadá, prof.ª Kathryn Grandfield, por me receber em seu grupo de pesquisa, pela orientação, inspiração, dedicação e disponibilidade;
Aos membros do grupo GRG, Arjun, Bryan, Chiara, Dakota, Ivan, pela atmosfera acolhedora e ótima convivência. Em especial, ao meu amigo Bryan, pela realização dos ensaios celulares, pela troca de experiência, amizade e ótima convivência;
Aos queridos amigos gaúchos do Canadá, Bianca, Cezar, Luiza, Rafael e Taiane, pela grande amizade e parceria. Muito obrigada por tornarem a minha jornada no Canadá tão especial;
Ao amigos e membros do grupo Novonano, Ananda, Bruno, Guilherme, Oscar, e Ricardo, pelo o bom convívio, pelo auxílio e troca de conhecimentos. Em especial a querida Ananda, pelas contribuições, disponibilidade, amizade e ótimas risadas;
Aos órgãos de financiamentos: Ao CNPq pela bolsa de estudos. Ao programa Erasmus BE Mundus, financiado pela União Européia, pela bolsa de doutorando sanduíche. Ao programa ELAP, financiado pelo Governo do Canadá, pela bolsa de doutorado sanduíche;
Aos meus amigos e familiares, por todo o suporte, incentivo, carinho e amizade; Muito obrigada a todos aqueles que, de alguma maneira, contribuíram na minha formação e na realização deste trabalho.
“Quanto mais aumenta nosso conhecimento, mais evidente fica nossa ignorância.” (John F. Kennedy)
Resumo
MARINS, Natália Hadler. Membranas nanofibrosas obtidas por electrospinning
contendo nanopartículas de pentóxido de nióbio e suas aplicações em biomateriais. 2019. 98f. Tese (Doutorado em Ciência e Engenharia de Materiais) -
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2019.
A exigência por materiais modernos e eficientes que sejam capazes de acelerar o processo de cicatrização e regeneração de tecidos e órgãos humanos tem aumentado consideralvemente. O presente estudo teve como objetivo desenvolver membranas com propriedades aprimoradas para aplicações em engenharia de tecidos epitelial e ósseo. As membranas foram fabricadas pelo processo de electrospinning e compostas de matriz polimérica contendo nanopartículas de pentóxido de níobio (Nb2O5). A membrana compósita para aplicação em tecido epitelial foi obtida utilizando poli (ácido lático) (PLA) e diferentes concentrações (0, 1, 3 e 5% p/p) de nanopartículas de Nb2O5 (PLA/Nb). A membrana compósita para tecido ósseo foi produzida utilizando policaprolactona (PC), gelatina (GL), 2% (p/p) de nanopartículas de hidroxiapatita (HA) e diferentes concentrações (0, 3, 7 e 10% p/p) de nanopartículas de Nb2O5 calcinadas (PGHANb). As nanopartículas de HA e Nb2O5 foram obtidas por síntese hidrotérmica assistida por micro-ondas (SHM) e a utilização do tratamento térmico para a obtenção de partículas mais cristalinas foi eficaz. As caracterizações químicas e morfológicas confirmaram a obtenção de nanopartículas de HA, Nb2O5 obtidas por SHM e Nb2O5 calcinadas com estruturas cristalográficas hexagonal, pseudo-hexagonal e ortorrômbica, respectivamente. Ambas as matrizes foram obtidas com sucesso através do método de electrospinning e as nanopartículas foram homogeanemente dispersas sobre a superfície das fibras ao longo de todo o comprimento. A incorporação de nanopartículas não modificou as propriedades mecânicas e os resultados de molhabilidade das diferentes membranas (PLA/Nb e PGHANb). A incorporação de Nb2O5 nas membranas de PLA/Nb não demonstrou resultados citotóxicos e induziu a proliferação celular sem alterar a porosidade. A introdução de Nb2O5 nas membranas de PGHANb demonstrou propriedades bioativas através da imersão em fluído corporal simulado, induzindo a formação de cristais de hidroxiapatita na superfície das membranas. Essas membranas também apresentaram resultados não citotóxicos e contribuíram para a proliferação e diferenciação celular. Esse estudo demonstrou que o Nb2O5 é um material com propriedades bioativas e biocompatíveis promissoras para a utilização em biomateriais. As membranas nanofibrosas obtidas por electrospinning contendo nanopartículas de Nb2O5 apresentaram resultados potenciais para aplicação em engenharia de tecidos.
Palavras-chave: biomateriais; electrospinning; engenharia de tecidos; membrana;
pentóxido de nióbio; síntese hidrotérmica assistida por micro-ondas; tecido epitelial; tecido ósseo
Abstract
MARINS, Natália Hadler. Nanofibrous membranes obtained by electrospinning
containing niobium pentoxide nanoparticles and its applications in biomaterials.
2019. 98f. Thesis (Ph.D. degree in Materials Science and Engineering) - Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2019.
The requirement for modern and efficient materials that are capable of accelerating the healing process and regeneration of human tissues and organs has considerably increased. The present study aimed to develop membranes with improved properties for skin and bone tissue applications. Membranes were fabricated by the electrospinning process and composed by polymeric matrix containing niobium pentoxide (Nb2O5) nanoparticles. The membrane for epithelial tissue application was obtained using poly (lactic acid) (PLA) and different concentrations (0, 1, 3, and 5% w/w) of Nb2O5 nanoparticles (PLA/Nb). The membrane for bone tissue was made of polycaprolactone (PC), gelatin (GL), 2% (w/w) hydroxyapatite (HA) nanoparticles and different concentrations (0, 3, 7, and 10% w/w) of calcined Nb2O5 nanoparticles (PGHANb). HA and Nb2O5 nanoparticles were obtained by microwave-assisted hydrothermal synthesis (MHS) and the thermal treatment was effective to obtain more crystalline particles. Chemical and morphological characterizations confirmed the obtaining of calcined HA, as-obtained Nb2O5, and calcined Nb2O5 nanoparticles with hexagonal, pseudo-hexagonal and orthorhombic crystallographic structures, respectively. Both membranes were successfully obtained using the electrospinning process and the nanoparticles were homogeneously dispersed on the surface all over the fiber length. The incorporation of nanoparticles did not modify the mechanical properties and wettability results of the different membranes (PLA/Nb and PGHANb). The incorporation of Nb2O5 nanoparticles into PLA/Nb membranes did not demonstrate cytotoxic results and induced cell proliferation without altering porosity. The introduction of Nb2O5 into the PGHANb membranes demonstrated bioactive properties by immersion in a simulated body fluid, inducing the formation of hydroxyapatite crystals on the surface of the membranes. These membranes also presented non-cytotoxic results and contributed to cell proliferation and differentiation. This study has demonstrated that Nb2O5 is a material with promising bioactive and biocompatible properties for use in biomaterials. The nanofibrous membranes obtained by electrospinning containing Nb2O5 nanoparticles presented potential results for application in tissue engineering.
Keywords: biomaterials; electrospinning; tissue engineering; membrane; niobium
Lista de Figuras
Figura 1. Estrutura da pele humana. ... 20
Figura 2. Organização hierárquica do osso em diferentes escalas dimensionais. .... 22
Figura 3. Representação esquemática do processo de electrospinning. ... 23
Figura 4. Tipos de jatos formados conforme o aumento do potencial elétrico... 25
Figura 5. Estrutura química do poli (ácido lático). ... 29
Figura 6. Estrutura química da policaprolactona. ... 30
Figura 7. Estrutura química da gelatina. ... 31
Figura 8. Ilustração do equipamento utilizado na síntese hidrotérmica assistida por micro-ondas. ... 33
Figura 9. Estrutura química do pentóxido de nióbio. ... 34
Figura 10. Alterações das fases do Nb2O5 em função da temperatura de síntese. ... 35
Figura 11. Estrutura química da hidroxiapatita. ... 36
Figura 12. Fluxograma de obtenção das nanopartículas de Nb2O5 por SHM. ... 40
Figura 13. Fluxograma de obtenção das membranas de PLA/Nb. ... 41
Figura 14. Fluxograma de obtenção das nanopartículas de HA por SHM. ... 46
Figura 15. Fluxograma de obtenção das membranas de PGHANb. ... 48
Figura 16. Fluxograma de obtenção da solução de fluído corporal simulado (SBF). 53 Figura 17. (A) Padrões de raios-X e (B) espectro Raman das nanopartículas de Nb2O5. ... 56
Figura 18. (A) Análise de EDS e micrografias de (B) MEV, (C) MET e (D) MET de alta resolução das nanopartículas de Nb2O5. ... 57
Figura 19. Espectros de FTIR das membranas PLA/Nb-5% e PLA. ... 58
Figura 20. Micrografias de MEV com baixa (x5000) e alta (x10000) magnificações das membranas PLA, PLA/Nb-1%, PLA/Nb-3% e PLA/Nb-5%. ... 59
Figura 21. Molhabilidade das membranas: (A) PLA, (B) PLA/Nb-1%, (C) PLA/Nb-3% e (D) PLA/Nb-5%. ... 60
Figura 22. Porosidade das membranas PLA, PLA/Nb-1%, PLA/Nb-3% e PLA/Nb-5%. ... 61
Figura 23. Resistência à tração das membranas PLA, PLA/Nb-1%, PLA/Nb-3% e PLA/Nb-5%. ... 62
Figura 24. Viabilidade celular (NIH/3T3) do grupo controle e das membranas PLA, PLA/Nb-1%, PLA/Nb-3% e PLA/Nb-5% após 24h e 48h de incubação. ... 63
Figura 25. (A) Padrões de raios-X e (B) espectros Raman das nanopartículas de Nb2O5 e HA. ... 65 Figura 26. Micrografias de MEV e MET das nanopartículas de Nb2O5 e HA... 66 Figura 27. (A) Micrografias de MEV e (B) diâmetro das fibras das membranas com diferentes proporções de PG (100:0, 90:10, 70:30 e 50:50)... 67 Figura 28. Degradação in vitro das membranas com diferentes proporções de PG (100:0, 90:10, 70:30 e 50:50) nos períodos de 1, 4 e 7 dias. ... 68 Figura 29. Micrografias de MEV com baixa (x5000) e alta (x20000) magnificações das membranas PG, PGHA, PGHANb-3, PGHNb-7 e PGHANb-10. ... 69 Figura 30. (A) Ângulo de contato das membranas (PCL pura, PG, PGHA, PGHANb-3, PGHNb-7 e PGHANb-10) e (B) imagens de ângulo de contato de membranas PCL pura, PG e PGHANb-7. ... 70 Figura 31. (A) Degradação in vitro das membranas (PG, PGHA, 3, PGHANb-7 e PGHANb-10) em diferentes períodos (PGHANb-7, 14, 28 e 56 dias) e (B) micrografias de MEV das membranas PG e PGHANb-7 recém-preparadas e após 28 dias de imersão em PBS. ... 72 Figura 32. Micrografias de MEV das membranas PG, PGHA, PGHANb-3, PGHANb-7 e PGHANb-10 recém-preparadas e após imersão em SBF por 7 e 14 dias. ... 74 Figura 33. Metabolismo celular das membranas PG, PGHA, PGHANb-3, PGHANb-7 e PGHANb-10 nos períodos de 1, 3 e 7 dias de incubação. ... 75 Figura 34. Ativilidade de fosfatase alcalina das membranas PG, PGHA, PGHANb-3, PGHANb-7 e PGHANb-10 nos períodos de 1, 3 e 7 dias de incubação. ... 76 Figura 35. Micrografias de MEV das células Saos-2 aderidas à membrana PGHANb-7. ... 77
Lista de Tabelas
Tabela 1. Variáveis que influenciam na obtenção de nanofibras por electrospinning. ... 24 Tabela 2. Efeitos dos parâmetros na morfologia das fibras. ... 24 Tabela 3. Descrição das membranas de PLA/Nb e as quantidades de nanopartículas utilizadas. ... 41 Tabela 4. Descrição das membranas de PGHANb e as quantidades de nanopartículas utilizadas. ... 47 Tabela 5. Resistência à tração, módulo de Young e alongamento na ruptura das membranas PG, PGHA, PGHANb-3, PGHANb-7 e PGHANb-10 sob condições secas e molhadas. ... 71
SUMÁRIO 1. Introdução ... 14 2. Objetivos ... 17 2.1. Objetivo Geral ... 17 2.2. Objetivos Específicos ... 17 3. Revisão da Literatura ... 18 3.1. Engenharia de Tecidos ... 18 3.1.1. Tecido Epitelial ... 19 3.1.2. Tecido Ósseo ... 21 3.2. Electrospinning ... 23 3.3. Biomateriais ... 26
3.3.1. Poli (ácido lático) ... 29
3.3.2. Policaprolactona ... 30 3.3.3. Gelatina ... 31 3.4. Nanomateriais ... 31 3.4.1. Síntese Hidrotérmica ... 32 3.4.2. Pentóxido de Nióbio ... 34 3.4.3. Hidroxiapatita ... 36 4. Materiais e Métodos ... 38 4.1. Materiais ... 38 4.1.1. Membranas de PLA/Nb ... 38 4.1.2. Membranas de PGHANb ... 38 4.2. Métodos ... 39 4.2.1. Membranas de PLA/Nb ... 39
4.2.1.1. Síntese das Nanopartículas de Nb2O5 ... 39
4.2.1.2. Obtenção das Membranas de PLA/Nb ... 40
4.2.1.3. Caracterizações das Nanopartículas de Nb2O5 ... 42
4.2.1.4. Caracterização das Membranas de PLA/Nb ... 42
4.2.1.4.1. Morfologia e Composição Química ... 42
4.2.1.4.2. Molhabilidade ... 43
4.2.1.4.3. Porosidade ... 43
4.2.1.4.4. Propriedades Mecânicas ... 44
4.2.2. Membranas de PGHANb ... 45
4.2.2.1. Síntese das Nanopartículas de Nb2O5 e HA ... 45
4.2.2.2. Obtenção das Membranas de PGHANb ... 46
4.2.2.3. Caracterização das Nanopartículas de Nb2O5 e HA ... 48
4.2.2.4. Caracterização das Membranas de PGHANb ... 49
4.2.2.4.1. Morfologia e Composição Química ... 49
4.2.2.4.2. Molhabilidade ... 49
4.2.2.4.3. Propriedades Mecânicas ... 50
4.2.2.4.4. Degradação In Vitro ... 50
4.2.2.4.5. Bioatividade ... 51
4.2.2.4.6. Metabolismo Celular e Fosfatase Alcalina ... 53
4.2.2.4.7. Interação Células-Membrana ... 54
5. Resultados e Discussão ... 55
5.1. Membranas de PLA/Nb ... 55
5.1.1. Caracterização das Nanopartículas de Nb2O5 ... 55
5.1.2. Caracterização das Membranas de PLA/Nb ... 57
5.1.2.1. Morfologia e Composição Química ... 57
5.1.2.2. Molhabilidade ... 60
5.1.2.3. Porosidade... 60
5.1.2.4. Propriedades Mecânicas ... 61
5.1.2.5. Viabilidade Celular ... 62
5.2. Membranas de PGHANb ... 63
5.2.1. Caracterização das Nanopartículas de Nb2O5 e HA... 63
5.2.2. Avaliação Preliminar da Morfologia e Degradação In Vitro ... 66
5.2.3. Caracterização das Membranas de PGHANb ... 68
5.2.3.1. Morfologia ... 68
5.2.3.2. Molhabilidade ... 70
5.2.3.3. Propriedades Mecânicas ... 71
5.2.3.4. Degradação In Vitro ... 72
5.2.3.5. Bioatividade ... 73
5.2.3.6. Metabolismo Celular e Atividade de Fosfatase Alcalina ... 74
5.2.3.7. Interação Células-Membrana ... 76
6. Conclusão ... 78
Referências ... 80 Apêndices ... 96
1. Introdução
A engenharia de tecidos tem como objetivo regenerar e restaurar o tecido humano danificado através da utilização de uma combinação de biomateriais de suportes com células e fatores de sinalização que imitam tecidos nativos (VO et al., 2016). A busca por novos biomateriais para aplicações em engenharia de tecidos que proporcionem um aumento da qualidade e expectativa de vida vem crescendo devido à necessidade de reposição de tecidos e órgãos do corpo humano (HABIBOVIC; GROOT, 2007). Os tecidos humanos estão sujeitas a falhas e com o aumento da expectativa de vida há uma propensão maior no desenvolvimento de doenças, as quais surgem com o envelhecimento da população (JAUL; BARRON, 2017). Desse modo, a engenharia de tecidos visa a obtenção de novos biomateriais na forma de matrizes remodeláveis que sejam capazes de estimular o corpo humano a capacidade de autoregeneração e de atuar na recuperação e reposição de tecidos e órgãos humanos.
Além disto, a maioria dos biomateriais utilizados no Brasil são importados e, consequentemente, são adquiridos por um elevado custo. Assim, é importante a realização de pesquisas no Brasil que visem a obtenção de novas tecnologias para o desenvolvimento de biomateriais que contribuam para a melhoria da qualidade e aumento da expectativa de vida a um custo reduzido.
A técnica de electrospinning é um método simples que tem sido utilizado na engenharia de tecidos devido à possibilidade de fabricação de nanofibras contínuas. As nanofibras apresentaram uma alta área superficial em relação ao volume, a qual é muito semelhante à matriz extracelular encontrada no corpo humano (CUI; ZHOU; CHANG, 2010). As membranas eletrofuncionais devem apresentar requisitos como biocompatibilidade, biodegradabilidade e propriedades mecânicas adequadas (VALENTE et al., 2016). Essas matrizes devem permitir que a troca de gases (RAMAKRISHNA et al., 2006) enquanto lentamente se degradam no corpo à medida que a regeneração celular ocorre sendo substituída pelo tecido regenerado (NAKASHIMA; AKAMINE, 2005). A matriz ideal deve ser capaz de assemelhar-se à razão entre área superficial e volume, alta porosidade e morfologia da matriz extracelular nativa, promovendo o crescimento e proliferação celular (PRABHAKARAN; VENUGOPAL; RAMAKRISHNA, 2009).
As nanofibras produzidas por electrospinning vem mostrando grande potencial para aplicações biotecnológicas, tais como engenharia de tecidos, curativo de feridas, imobilização de enzimas e liberação de fármacos (LIANG; HSIAO; CHU, 2007). Esta técnica, econômica e versátil, é utilizada para a produção de nanofibras funcionais a partir de uma ampla variedade de materiais, incluindo polímeros e estruturas compostas (KAYACI et al., 2013). A combinação de matrizes orgânicas e partículas inorgânicas bioativas podem ser candidatos promissores para aplicações biomédicas (RAN et al., 2017). As matrizes que fornecem suporte para a proliferação de células são comumente feitas de materiais biorreabsorvíveis como polissacarídeos, poli (ácido láctico) (PLA), poli (ácido glicólico) (PGA), policaprolactona (PCL), gelatina (GL), e quitosana (CS) (BOSE; ROY; BANDYOPADHYAY, 2012; REZWAN et al., 2006).
O poli (ácido lático) (PLA), amplamente utilizado em técnicas de electrospinning (VALENTE et al., 2016), é um polímero biodegradável e biocompatível derivado de fontes renováveis (AREIAS et al., 2012; SENCADAS et al., 2012), o que o torna um excelente atrativo para aplicação em biomateriais (SHI et al., 2012). PCL e gelatina são polímeros amplamente utilizados por electrospinning para aplicações biomédicas, devido à sua alta biocompatibilidade e propriedades biorreabsorvíveis (CHONG et al., 2007). No entanto, a aplicação de PCL é limitada devido à sua hidrofobicidade e lenta biodegradabilidade. Por outro lado, a gelatina é muito hidrofílica e tem uma rápida taxa de degradação (BINULAL et al., 2014). Assim, a combinação de PCL e gelatina é freqüentemente utilizada, pois cada um complementa a deficiência do outro. Estruturas de nanofibras híbridas de PCL/gelarina foram desenvolvidas para melhorar as propriedades das matrizes e têm sido utilizadas com sucesso em aplicações biomédicas (REN et al., 2017). Além disso, também demonstraram melhoria na migração e proliferação celular (YU et al., 2016).
A adição de nanopartículas em matrizes nanofibrosas biopoliméricas pode melhorar as propriedades da matriz enquanto fornece uma nanotopografia que imita a nanoestrutura da matriz extracelular (LI et al., 2014a; SWETHA et al., 2010). Diversos tipos de nanopartículas estão sendo utilizadas em biomateriais, mas existem poucos estudos usando pentóxido de nióbio (Nb2O5). O Nb2O5 vem apresentando propriedades bioativas e biocompatíveis, o que o torna promissor para aplicações em biomateriais devido a sua boa interação com o corpo humano. Esse material melhorou a atividade de fosfatase alcalina (OBATA et al., 2012), exibiu crescimento de cristais
de hidroxiapatita (KARLINSEY et al., 2006) e contribuiu para a disseminação de células e aumento da produção de colágeno (VELTEN et al., 2004). No entanto, até onde se sabe o Nb2O5 ainda não foi utilizado em membranas obtidas por electrospinning para aplicação no desenvolvimento de biomateriais para aplicação em engenharia de tecidos.
Desta forma, esse projeto teve como objetivo a obtenção de membranas nanofibrosas obtidas por electrospinning contendo nanopartículas de Nb2O5 e avaliação de suas aplicações em engenharia de tecidos. Esse trabalho foi dividido em duas etapas, as quais ambas utilizaram o processo de electrospinning para a obtenção das membranas nanofibrosas. A primeira etapa teve como objetivo a otenção de membranas a base PLA contendo nanopartículas de Nb2O5 para aplicação em tecidos epiteliais. A segunda etapa teve como foco a obtenção de membranas a base PCL e gelatina contendo nanopartículas de HA e Nb2O5 para aplicação em engenharia de tecidos ósseos. As nanopartículas foram obtidas através de síntese hidrotérmica assistida por radiação micro-ondas (SHM).
2. Objetivos
2.1. Objetivo Geral
Obtenção de membranas nanofibrosas por electrospinning contendo nanopartículas de pentóxido de nióbio e hidroxiapatita para aplicação em biomateriais.
2.2. Objetivos Específicos
✓ Síntese de nanopartículas de pentóxido de nióbio via SHM; ✓ Síntese de nanopartículas de hidroxiapatita via SHM;
✓ Caracterização das nanopartículas obtidas via SHM quanto a morfologia, tamanho de partícula, estrutura cristalina e química;
✓ Obtenção de membranas nanoestruturadas a base de PLA com adição de nanopartículas de Nb2O5 em diferentes concentrações via electrospinning; ✓ Obtenção de membranas nanoestruturadas a base de policaprolactona e
gelatina contendo nanopartículas de HA e diferentes concentrações de nanopartículas de Nb2O5 via electrospinning;
✓ Caracterização das membranas nanoestruturadas quanto a morfologia, estrutura química, propriedades mecânicas, molhabilidade e biocompatibilidade in vitro.
3. Revisão da Literatura
3.1. Engenharia de Tecidos
A engenharia de tecidos é um campo interdisciplinar da engenharia biomédica que integra muitos conceitos de ciência e engenharia para projetar e desenvolver substitutos biológicos que restaurem, mantenham ou melhorem os tecidos e/ou órgãos danificados (CLARK; GHOSH; TONNESEN, 2007). O objetivo desse campo é investigar a relação entre a estrutura e a função do tecido natural, e desenvolver substratos biológicos que substituam a função do tecido lesionado ou ausente (ARMENTANO et al., 2010). Desde a última década, a engenharia de tecidos vem mostrando progressos no desenvolvimento de alternativas viáveis para procedimentos cirúrgicos de tecidos ósseos, implantes e próteses. Grandes avanços no transplante de células e órgãos, bem como na ciência e engenharia de materiais, contribuíram para o desenvolvimento da engenharia de tecidos e da medicina regenerativa (Desai, 2000; Harrison e Atala, 2007; Norman e Desai, 2006).
Os avanços da última década mudaram o campo da engenharia de tecidos alcançando a obtenção de materiais que se assemelham aos tecidos nativos em aparência e função (NORMAN; DESAI, 2006). Os tecidos de engenharia geralmente apresentam duas partes principais: as células e a matriz. As células fornecem a funcionalidade biológica enquanto a matriz fornece uma plataforma para o crescimento celular (NORMAN; DESAI, 2006).
Diversas pesquisas estão sendo feitas visando o desenvolvimento de matrizes biocompatíveis para aplicações em engenharia de tecidos. Estas matrizes devem imitar a estrutura e função biológica da matriz extracelular, tanto em termos de composição e estrutura física (MA et al., 2005). Ou seja, devem suportar a reprodução de tecido à escala celular e fornecem moldes para a forma macroscópica do tecido alvo (SPERLING et al., 2016). A matriz ideal deve ser capaz ter uma razão entre elevada área superficial e baixo volume, apresentar alta porosidade e morfologia semelhantes à matriz extracelular nativa. Também deve ser capaz de promover o crescimento e proliferação de células, e de se degradar no corpo a uma taxa consistente com o crescimento do novo tecido (PRABHAKARAN; VENUGOPAL; RAMAKRISHNA, 2009).
Essas matrizes vêm sendo obtidas usando diversas técnicas, incluindo matrizes à base de nanofibras e microfibras produzidas por electrospinning. Essas fibras podem ser produzidas com diâmetros na faixa de 100nm até alguns micrômetros. Diâmetros de fibra pequena apresentam grandes áreas de superfície específicas, as quais são altamente favoráveis para processos de adesão celular. Diversos fatores favorecem a adesão celular. A orientação longitudinal das fibras favorece o contato para as células e a alta porosidade das fibras favorece a permeação, processos de difusão de gases e meios fluidos (SPERLING et al., 2016). Dentre os diferentes tipos de matrizes investigadas, as matrizes para regeneração dos tecidos epitelial e ósseo são as mais comumente pesquisadas.
3.1.1. Tecido Epitelial
A pele é o maior órgão do corpo humano e possui diversas funções como: proteção contra efeitos ambientais deletérios, regulação da temperatura, prevenção da desidratação, além de fornecer suporte a vasos sanguíneos e nervos (RODRIGUES et al., 2008). Assim, lesões na pele podem alterar funções fisiológicas distintas, resultando em desordens do organismo. Além disso, a pele é uma barreira eficiente contra influências externas como distúrbios mecânicos, radiação ultravioleta e agentes microbianos patogênicos. Esse órgão evita a perda substancial de fluidos corporais e desempenha um papel significativo na termorregulação e defesa imunológica (BOTTCHER-HABERZETH; THOMAS; REICHMANN, 2010). Esse órgão é anatômico e funcional e possui duas camadas distintas: a epiderme e a derme (Figura 1) (JONES; CURRIE; MARTIN, 2002).
Figura 1. Estrutura da pele humana.
Fonte: Adaptada de MACNEIL, 2008, p. 27.
Se a pele sofrer algum dano é necessário a tomada de diferentes medidas dependendo da profundidade e extensão superficial do dano causado. Lesões envolvendo a epiderme e a camada superficial da derme serão capazes de se regenerar sem intervenção cirúrgica, desde que haja um número suficiente de células-tronco de queratinócitos presentes na epiderme remanescente ou na derme residual (BOTTCHER-HABERZETH; THOMAS; REICHMANN, 2010). Se houver a falta de queratinócitos epidérmicos a regeneração pode ser alcançada por células-tronco epiteliais derivadas de folículos pilosos e/ou glândulas sudoríparas. Por outro lado, lesões com danos que se estendem para a derme mais profunda ou mesmo a hipoderme necessitam de um tratamento mais complexo, pois a superfície lesada é deficiente de suas células-tronco de queratinócitos (BOTTCHER-HABERZETH; THOMAS; REICHMANN, 2010).
A ruptura da pele frequentemente leva a um aumento na perda de fluidos, infecção, cicatrização, comprometimento da imunidade e mudança na imagem corporal (ALEMDAROGLU et al., 2006). Muitas razões podem ser apontadas para a perda da integridade da pele como distúrbios genéticos (condições bolhosas), trauma agudo, feridas crônicas (por exemplo, úlceras venosas, diabéticas e de pressão) ou
mesmo intervenções cirúrgicas (DAI et al., 2004; SHEVCHENKO et al., 2010). Entretanto, traumas térmicos como queimaduras, são uma das causas mais comuns de grandes perdas de pele, onde áreas substanciais da pele podem ser danificadas e a possibilidade de regeneração da pele é improvável (Shevchenko et al., 2010). A taxa de mortalidade causada por queimaduras vem diminuindo desde as duas últimas décadas com os avanços da medicina regenerativa.
3.1.2. Tecido Ósseo
O osso é um tecido mineralizado que serve como suporte mecânico e proteção para órgãos e também é o principal reservatório de íons de cálcio e fosfato, os quais são necessários para uma ampla variedade de funções metabólicas (DOROZHKIN; EPPLE, 2002). O tecido ósseo é composto por componentes minerais (69%) e orgânicos (22%). A composição mineral é quase toda constituída de hidroxiapatita, que é um complexo cristalino de fosfato de cálcio responsável pela dureza e rigidez do osso e os componentes orgânicos consistem em proteínas de colágeno, incluindo proteoglicanos, sialoproteínas e glicoproteínas (BALAGANGADHARAN; DHIVYA; SELVAMURUGAN, 2017).
O osso apresenta uma estrutura hierárquica onde suas dimensões variam na macroescala até a nanoescala, conforme demostrado na figura 2 (STEVENS; GEORGE, 2005). As letras indicadas na figura 2 mostram as diferentes divisões: (A e B) camada externa é compactada e fortemente calcificada, que compreende muitas camadas cilíndricas que são os ósteons; (C) as células residentes são revestidas por receptores de membrana celular que respondem a sítios de ligação específicos; (D) nanoarquitetura bem definida da matriz extracelular circundante (STEVENS; GEORGE, 2005).
Figura 2. Organização hierárquica do osso em diferentes escalas dimensionais. Fonte: Adaptada de STEVENS; GEORGE, 2005, p. 1135.
O osso é um tecido muito dinâmico e altamente vascularizado, uma vez que possui altas propriedades mecânicas e capacidade regenerativa (MARTINS et al., 2010) e defeitos ósseos geralmente levam algum tempo para cicatrizar.
A cicatrização de uma fratura pode ser dividida em três fases: fase inflamatória, reparativa e fase de remodelação e, em geral, a consolidação da fratura é concluída após 6-8 semanas após a lesão inicial (LIEBERMAN; FRIEDLAENDER, 2005). No entanto, a capacidade de cicatrização do osso tem suas limitações. Grandes defeitos ósseos causados devido â traumas, fraturas, câncer, periodontite, osteoporose e doenças infecciosas podem não cicatrizar por si mesmos (JIANG et al., 2010). A regeneração óssea não ocorre no caso de grandes defeitos. Quando grandes defeitos
occorem a intervenção médica é frequentemente necessária para permitir a regeneração óssea (TAYLOR; KHAN; LAURENCIN, 2009).
3.2. Electrospinning
O processo de electrospinning proporciona uma grande flexibilidade na obtenção de materiais para aplicações em engenharia de tecidos. O processo baseia-se na aplicação de um campo elétrico, o qual é aplicado entre a ponta da agulha acoplada em uma seringa contendo uma solução polimérica e um coletor metálico, onde as nanofibras são depositadas. A solução polimérica é carregada eletricamente formando uma gota na ponta da agulha. Conforme as forças elétricas superam a tensão superficial da solução, um jato polimérico em formato de cone é formado a partir da superfície da gota, o qual é depositado sobre o coletor enquanto o solvente é imediatamente evaporado dando origem as nanofibras (RENEKER et al., 2007). A figura 3 mostra um esquema representativo do processo de electrospinning.
Figura 3. Representação esquemática do processo de electrospinning. Fonte: Adaptada de ATHIRA; SANPUI; CHATTERJEE, 2014, p. 62.
A obtenção de fibras por electrospinning é influenciada por diversos parâmetros, os quais afetam as propriedades finais das nanofibras. Esses fatores podem ser divididos em: propriedades da solução polimérica, parâmetros de processo
e parâmetros ambientais (MIT-UPPATHAM; NITHITANAKUL; SUPAPHOL, 2004). A tabela 1 mostra cada um desses parâmetros.
Tabela 1. Variáveis que influenciam na obtenção de nanofibras por electrospinning.
Parâmetros da solução Parâmetros de processo Parâmetros ambientais
Concentração Potencial eletrostático Temperatura
Viscosidade Força do campo elétrico Humidade
Tensão superficial Forma do campo eletrostático Fluxo da atmosfera local
Condutividade Distância de trabalho Composição da atmosfera
Constante dielétrica Taxa de alimentação Pressão
Volatilidade do solvente Diâmetro do orifício de alimentação Fonte: OLIVEIRA, 2011, p. 32.
Os efeitos na morfologia das fibras podem ser diferentes para cada sistema polímero/solvente. Há um número de relações gerais entre parâmetros e morfologia da fibra, os quais estão descritos na tabela 2 (SILL; VON RECUM, 2008). Existem regras gerais que são úteis ao definir as condições ideais para um determinado sistema, mas é difícil quantificar as relações que podem ser aplicadas para todos os sistemas de polímero/solvente (SILL; VON RECUM, 2008).
Tabela 2. Efeitos dos parâmetros na morfologia das fibras.
Parâmetros Efeito na morfologia das fibras
Elevada voltagem aplicada Inicialmente o diâmetro da fibra diminui e depois aumenta Elevada vazão da solução Diâmetro da fibra diminui (podem ocorrer a formação de gotas
se a vazão é muito alta)
Elevada distância de trabalho Redução do diâmetro da fibra (podem ocorrer a formação de gotas se a distância for muito pequena)
Elevada viscosidade da solução polimérica
Aumento do diâmetro da fibra (dentro de uma faixa ideal, porém soluções muitos viscosas podem entupir a agulha) Elevada condutividade da solução
polimérica
Redução do diâmetro da fibra (pode haver uma ampla faixa de diâmetro da fibra)
Elevada volatilização do solvente Aumento de microtexturas (formação de poros na superfície e aumento da área superficial)
Fonte: Adaptada de SILL; VON RECUM, 2008, p. 1992.
Outra característica importante no processo de obtenção de nanofibras é o tipo de jato formado. É possível observar diferentes tipos de jatos com o aumento do potencial elétrico aplicado: gotejamento, microgotejamento, cone, multijato e jato
ramificado (Figura 4) (CLOUPEAU, 1994; CLOUPEAU; PRUNET-FOCH, 1990; GRACE; MARIJNISSEN, 1994; PONTELLI, 2011).
Figura 4. Tipos de jatos formados conforme o aumento do potencial elétrico. Fonte: PONTELLI; BERGMANN; BERUTTI, 2011, p. 6.
Electrospinning é uma técnica rentável e versátil utilizada na fabricação de nanofibras funcionais a partir de uma grande variedade de materiais, incluindo polímeros, sol-géis e estruturas compostas devido à obtenção de membranas com elevada área superficial em relação ao volume, ao tamanho de poros pequenos e à alta porosidade (KAYACI et al., 2013). Nos últimos anos, as nanofibras obtidas através do processo de electrospinning vêm mostrando um potencial significativo em sensores químicos e ópticos (WANG et al., 2004), engenharia de tecidos (AGARWAL; WENDORFF; GREINER, 2008; KANANI; BAHRAMI, 2010), cicatrização de feridas (KHIL et al., 2003) e liberação de fármacos (KENAWY et al., 2002).
As matrizes fibrosas produzidas pelo processo de electrospinning têm atraído considerável interesse na engenharia de tecidos (RAJZER et al., 2014a). As matrizes de fibras aleatórias possuem uma microestrutura característica com uma alta área superficial, alta porosidade e alta interconectividade de poros. Além disso, as propriedades mecânicas e biológicas, bem como a cinética de degradabilidade podem ser manipulados alterando a composição da solução de polímero e parâmetros de processamento (MENG et al., 2010a). Essa técnica permite a fabricação de características em micro e nano escala (LI et al., 2014a), as quais são muito semelhantes à matriz extracelular natural (ECM) e são capazes de estimular a adesão, proliferação e crescimento celular (RAJZER et al., 2014b).
A matriz ideal deve ser capaz de assemelhar-se à razão entre a área superficial e o volume, a alta porosidade e a morfologia da matriz extracelular, promovendo o crescimento e a proliferação celular, e idealmente degradando-se no corpo a uma taxa consistente com o crescimento de novos tecidos (PRABHAKARAN; VENUGOPAL; RAMAKRISHNA, 2009).
As matrizes obtidas pelo processo de electrospinning para aplicação em engenharia de tecidos têm sido fabricadas utilizando materiais reabsorvíveis como polissacarídeos, poli (ácido lático), poli (ácido glicólico), policaprolactona, gelatina, quitosana e diversos outros polímeros (BOSE; ROY; BANDYOPADHYAY, 2012; REZWAN et al., 2006). Além disso, as nanopartículas têm sido extensivamente incorporadas em matrizes poliméricas devido às suas propriedades físicas, químicas e biológicas únicas (CHEN et al., 2011; WUTTICHAROENMONGKOL et al., 2006). A adição de nanopartículas nas matrizes pode melhorar as propriedades da matriz enquanto fornece uma nanotopografia que imita a nanoestrutura do osso natural (LI et al., 2014a; SWETHA et al., 2010).
3.3. Biomateriais
Os biomateriais são qualquer substância (outra que não droga) ou combinação de substâncias, de origem sintética ou natural, que possa ser usada por um período de tempo como parte de um sistema que trate, aumente ou substitua qualquer tecido, órgão ou função do corpo (HELMUS; TWEDEN, 1995). A biocompatibilidade é uma propriedade fundamental que os biomateriais quando colocados em contato com tecidos e órgãos vivos devem apresentar. Um material é definido como biocompatível quando não causa efeitos prejudiciais ao organismo. Quando um material é implantado no corpo ele interage com os fluidos corporais, proteínas e células, os quais produzem uma série de reações que determinam se ele é aceito ou não pelo sistema hospedeiro sem causar reações inflamatórias ou alérgicas (WILLIAMS, 2008). A falta de biocompatibilidade pode causar trombose e encapsulamento de tecido fibroso do implante (GEETHA et al., 2009). A superfície do biomaterial desempenha um papel importante na determinação de como o corpo responderá ao implante, pois é o primeiro ponto de contato entre o implante e o tecido hospedeiro. Além disso, para avaliar a biocompatibilidade global de um implante, é importante considerar todos os
elementos que o constituem, uma vez que poderiam ser liberados no corpo humano devido ao desgaste ou à corrosão e, potencialmente, causar efeitos adversos (LI et al., 2014b).
Nos últimos anos, a engenharia de tecidos tem sido amplamente investigada como uma abordagem promissora para a regeneração do tecido humano através da utilização de biomateriais. Os biomateriais são necessários em estratégias de engenharia de tecidos na produção de suportes onde as células do corpo humano podem se ligar, crescer e proliferar (JAYAKUMAR et al., 2011).
Idealmente, as matrizes para engenharia de tecidos devem ser biocompatíveis para ter uma boa integração com o tecido hospedeiro sem provocar uma resposta imune, devem ser porosas para que permitam o crescimento de células e tecidos, devem ser mecanicamente resistentes para resistir ao estresse local mantendo a estrutura dos poros para o crescimento do novo tecido e devem ser biodegradáveis para que sejam reabsorvidas na medida em que o novo tecido é regenerado (JIANG et al., 2010).
Os biomateriais podem ser divididos conforme o tipo de interação que apresentam com os tecidos sendo: bioinertes, bioativos e biodegradáveis. Os materiais bioinertes são biocompatíveis, ou seja, são tolerados pelo organismo, porém não são capazes de promover uma ligação íntima com o tecido humano, podendo provocar respostas inflamatórias toleráveis. Normalmente, esses materiais são encapsulados por um tecido fibroso sendo isolados dos tecidos vivos (CASTNER; RATNER, 2002; HENCH, LARRY L.; WILSON, 1993). O metal bioinerte mais comumente utilizado é o titânio, o qual apresenta em sua superfície uma fina camada de óxidos naturalmente passivada quando exposto à atmosfera (HENCH, LARRY L.; WILSON, 1993). Os materiais bioativos são aqueles capazes de formar um tecido sobre sua superfície e estabelecer uma interface capaz de suportar cargas funcionais, ou seja, esses materiais interagem diretamente com as moléculas do organismo, promovendo interações químicas e biológicas com o tecido humano (HENCH, LARRY L.; WILSON, 1993; KOHN, DAVID H.; DUCHEYNE, 1992). Os materiais biodegradáveis são degradados, solubilizados ou fagocitados pelo organismo após um certo tempo em contato com o tecido humano. Esses materiais sofrem hidrólise e degradação enzimática resultando na liberação de micropartículas, as quais são absorvidas pelo organismo ou metabolizadas e eliminadas por vias de excreção (KULKARNI et al., 1996).
Uma grande diversidade de materiais, incluindo cerâmicas, compósitos e polímeros tem sido estudada para a produção de matrizes para aplicação em engenharia de tecidos e esses possuem propriedades e taxas de degradação diferentes.
As cerâmicas como hidroxiapatita (HA), fosfatos de cálcio e vidros bioativos têm recebido atenção especial, devido à sua excelente biocompatibilidade, juntamente com suas propriedades osteocondutoras e osteoindutoras (SCHUMACHER et al., 2010). Dependendo da composição, tamanho de partícula e processo de produção, as cerâmicas podem ter vários graus de bioatividade, se ligando ao osso vivo através da formação de HA (YUN et al., 2011). No entanto, esses materiais são frágeis e apresentam baixa estabilidade mecânica, o que os tornam inadequados para aplicações de suporte de carga (MISTRY; MIKOS, 2005).
Os polímeros biodegradáveis podem evitar algumas das desvantagens da cerâmica. Os polímeros naturais de origem animal ou vegetal como colágeno, fibronectina, quitosana, amido e ácido hialurônico são altamente abundantes e apresentam grande semelhança estrutural com os constituintes naturais dos tecidos humanos, possuindo assim um baixo potencial imunogênico (ZABOROWSKA et al., 2010). Os polímeros sintéticos apresentam grande vantagem porque sua estrutura, composição e, consequentemente, suas propriedades podem ser adaptadas às necessidades específicas (VERGROESEN et al., 2011). A biodegradabilidade dos polímeros pode ser controlada de diferentes maneiras, enquanto alguns polímeros podem sofrer hidrólise e outros podem ser degradados por enzimas (VERGROESEN et al., 2011). Os mais amplamente investigados são o poli (ácido láctico), poli (ácido glicólico), poli (ε-caprolactona) (PCL) e seus copolímeros, tais como poli (ácido L-láctico-co-glicólico) (HUANG et al., 2010; MENG et al., 2010b).
Desse modo, as matrizes compostas de polímero/cerâmica representam uma alternativa conveniente para aplicações na regeneração de tecidos devido à possibilidade de adaptar as suas várias propriedades dependendo das necessidades particulares. Os compósitos mostraram-se mais eficazes para o aumento das propriedades mecânicas e da bioatividade em comparação aos polímeros e as cerâmicas, quando utilizados separadamente (ROOHANI-ESFAHANI et al., 2010).
3.3.1. Poli (ácido lático)
O poli (ácido lático) (PLA) é um poliéster alifático (Figura 5) derivado de recursos renováveis e degradáveis como o milho e o arroz. As principais vantagens desse polímero são a biocompatibilidade e a biodegradabilidade. Os produtos resultantes de sua degradação, água e dióxido de carbono, tornam esse material excelente para aplicações biomédicas, pois não são tóxicos nem cancerígenos. Ainda, outro fator que contribui para sua aplicação em biomateriais é a sua alta capacidade de se hidrolisar no corpo humano. Desde 1970 os produtos de PLA foram aprovados pela Administração de Comidas e Rémedios (Food and Drug Administration, FDA) nos Estados Unidos para contato direto com fluidos biológicos (XIAO et al., 2012).
A degradação do PLA é realizada com base em uma reação hidrolítica onde as moléculas d’água quebram as ligações de ésteres, diminuindo o comprimento da cadeia e quebrando em fragmentos menores (XIANG; FREY, 2014).
Figura 5. Estrutura química do poli (ácido lático). Fonte: NAM; OGIHARA; KOBAYASHI, 2012, p. 105.
O PLA apresenta dois estereoisômeros: poli (L-ácido lático) (PLLA) e o poli (D-ácido lático) (PDLA) e a mistura de ambos gera o poli (D,L-(D-ácido lático) (PDLLA) (VERT et al., 1992). A polimerização do PLLA e do PDLA resultam na formação de um material puro e semicristalino e o PDLLA resulta na formação de um material amorfo. As propriedades físicas resultantes dos diferentes monômeros estão diretamente relacionadas com a estrutura do polímero e sua massa molar (JAHNO, 2005).
Esse material vem sendo utilizado em diversas aplicações nos últimos anos. Foi utilizado na distribuição de genes para engenharia de tecidos juntamente com polietilenoglicol (LUU et al., 2003), na obtenção de materiais híbridos para aplicações em curativos de feridas (IGNATOVA et al., 2009), em embalagens ativas de alimentos
quando combinado com um complexo de inclusão de triclosano/ciclodextrina (KAYACI et al., 2013), em nanocompósitos bactericidas com nanopartículas de dióxido de titânio (CAMPARDELLI et al., 2013), em nanocompósito com nanocristais de celulose para aplicações em engenharia de tecido ósseo (ZHOU et al., 2013), em membranas para a prevenção de adesões pós-cirúrgicas (KESSLER et al., 2015), entre outras.
3.3.2. Policaprolactona
A policaprolactona (PCL) é um poliéster alifático semicristalino sintético, não tóxico e biocompatível (RAMESH; MORATTI; DIAS, 2018) (Figura 6). Esse polímero é capaz de hidrolisar a uma taxa de degradação lenta. Essa degradação é afetada pelo tamanho, cristalinidade do polímero, pH e temperatura do ambiente (KENAWY et al., 2009). É um polímero biodegradável aprovado pelo Food and Drugs Administration (FDA) com excelente biocompatibilidade e flexibilidade. A policaprolactona pode ser prontamente processada em matrizes com forma específica devido ao seu baixo ponto de fusão relativo (entre 55°C e 60°C) e boa compatibilidade de mistura com outros aditivos (CIPITRIA et al., 2011).
Figura 6. Estrutura química da policaprolactona. Fonte: RAMESH; MORATTI; DIAS, 2018, p. 6.
Esse polímero vem atraindo um crescente interesse como material biodegradável para embalagens, biomateriais implantáveis e micropartículas para carregamento de fármacos (MENG et al., 2010b). No entanto, polímeros sintéticos podem variar suas propriedades em função da fabricação, temperatura, esterilização, ambiente local e geometria do projeto mesmo que possuam a mesma composição (VERGROESEN et al., 2011). Outra desvantagem é que o PCL não possui osteocondutividade, bioatividade e também possui baixa rigidez, características
importantes para aplicações em engenharia de tecidos ósseos (VERMA; KUMAR, 2010).
3.3.3. Gelatina
A gelatina é um biopolímero natural, biocompatível, biodegradável derivado de colágeno, um dos principais componentes da matriz extracelular nativa. A figura 7 ilustra a representação da estrutura química da gelatina. Não é imunogênico e aparentemente retém sinais informacionais como a sequência de arginina-glicina-ácido aspártico, que promove a adesão, diferenciação e proliferação celular (GHASEMI-MOBARAKEH et al., 2008).
Esse polímero tem sido usado em várias aplicações: indústrias farmacêuticas, alimentos e fotográfico. A pele de porco (46%), ossos de porco e bovinos (23,1%) e peles de bovinos (29,4%) são as fontes mais frequentes de produção de gelatina (GÓMEZ-GUILLÉN et al., 2009).
Figura 7. Estrutura química da gelatina. Fonte: THAKUR et al., 2017.
3.4. Nanomateriais
A redução do tamanho de partículas para a escala nanométrica pode alterar as propriedades mecânicas, físicas e químicas dos materiais (LEITUNE et al., 2013). As propriedades óticas, elétricas, magnéticas, catalíticas e de transporte são diretamente relacionadas ao tamanho das partículas, que atingem um tamanho crítico que diferenciam suas propriedades (ZARBIN, 2007). Além do tamanho, outro efeito importante em materiais nanoestruturados é a elevada razão entre área e volume (XIA
et al., 2008). As nanopartículas geralmente apresentam elevada área superficial e seus átomos encontram-se na superfície com coordenação não satisfeita. Isto aumenta a energia da superfície e, consequentemente, da partícula, tornando esses materiais mais reativos (KATAOKA, 2011).
Pesquisas envolvendo ciência e tecnologia prometem avanços através da obtenção de novos materiais em áreas como nanoeletrônica, medicina, saúde, energia, biotecnologia e tecnologia da informação. Desta maneira, a síntese de materiais nanoestruturados tem sido promissora devido às propriedades que esses materiais apresentam nesta escala, visto que estas podem ser sensivelmente alteradas variando-se o tamanho e morfologia das partículas (BHUSHAN, 2010).
3.4.1. Síntese Hidrotérmica
A síntese hidrotérmica convencional tem sido aplicada na obtenção de óxidos cerâmicos por ser uma rota simples, versátil (XU et al., 2008), eficiente e ecologicamente correta (VERMA et al., 2004). Esta síntese vem se destacando por ser uma rota bem estabelecida e promissora para a preparação de nanocristais inorgânicos controlados. A síntese hidrotérmica pode iniciar a nucleação do crescimento dos nanocristais e promover a formação de produtos cristalinos a temperaturas substancialmente mais baixas que outros métodos de síntese. No entanto, o aquecimento convencional do processo hidrotérmico se baseia na condução térmica de radiação de corpo negro de conduzir reações químicas. O recipiente da reação serve como um intermediário para transferir a energia a partir da fonte de aquecimento para o solvente e, finalmente, para as moléculas do reagente. Por isto esse método apresenta desvantagens como cinética de reação lenta e não uniforme, resultando em uma nucleação fraca e grandes distribuições de tamanho de partícula (HU; YU, 2008). A síntese hidrotérmica assistida por micro-ondas (SHM) é uma técnica relativamente nova, na qual as vantagens de ambos aquecimentos, micro-ondas e hidrotérmico, são utilizados. Existem vários relatos de que as sínteses hidrotérmicas convencionais foram substituídas pelas sínteses hidrotérmicas assistidas por micro-ondas (VERMA et al., 2004).
A obtenção de materiais nanoestruturados através da SHM tem atraído bastante interesse por ser um método de processamento limpo, o qual apresenta
como principais vantagens a obtenção de partículas pequenas, elevada reatividade e morfologia de partículas bem definida (VERMA et al., 2004). Nesta síntese, a radiação micro-ondas acelera o aquecimento e as reações necessárias para a cristalização do material desejado. O aquecimento é gerado por dois mecanismos principais para a transformação de energia eletromagnética em calor: rotação de dipolo e condução iônica. A rotação de dipolo é relacionada com o alinhamento das moléculas (que tem dipolos permanentes ou induzidos) com o campo elétrico aplicado. Esses movimentos das moléculas excitadas perturbam as moléculas não excitadas de modo que o conjunto é aquecido através das colisões geradas. A condução iônica ocorre quando o calor é gerado através de perdas por fricção, que acontece através da migração de íons dissolvidos sob a ação de um campo eletromagnético (BRAGA et al., 2012).
Além de ser um método eficiente e não invasivo (RAGHUVEER et al., 2006) na preparação de óxidos metálicos de alta pureza (BYRAPPA; ADSCHIRI, 2007), a síntese apresenta elevada rapidez, alta eficiência, baixo custo e baixo consumo de energia (DING et al., 2015; ZHU; CHEN, 2014). Estas vantagens são decorrentes da utilização de baixas temperaturas, rápido aquecimento, elevada aceleração da cinética das reações, maior homogeneidade, maior rendimento, menor consumo de energia e melhor reprodutibilidade quando comparada ao método hidrotérmico convencional (CAO; ZHU, 2009; HAN et al., 2006; HU; YU, 2008).
O equipamento utilizado na síntese hidrotérmica assistida por micro-ondas consiste em um reator de aço inox (Figura 8) composto por um recipiente de politetrafluoretileno, o qual é aquecido pela radiação micro-ondas (Electrolux, MEF41, Brasil). O monitoramento da temperatura é realizado através de um termopar interno, o qual é inserido dentro de um poço frio e o monitoramento da pressão é realizado por meio de uma sonda de pressão (manômetro).
O forno micro-ondas operara com radiação de 2,45GHz e potência controlada automaticamente pelo equipamento (máxima de 1000W) de maneira a manter a temperatura desejada e, consequentemente, a pressão constante.
3.4.2. Pentóxido de Nióbio
O nióbio é um metal de transição pertencente à família 5A da tabela periódica e possui número atômico 41. Esse metal apresenta os estados de oxidação de +5 até -1, no entanto o estado de oxidação +5 é o mais estável (GREENWOOD; EARNSHAW, 2012). Dentre as diferentes estequiometrias de óxidos de nióbio, o
pentóxido de nióbio (Nb2O5) vem se destacando por ser um óxido semicondutor termodinamicamente estável, apresentando inércia química e baixa citotoxicidade (HE et al., 2014). Esse material possui excelentes propriedades químicas e físicas, as quais o tornam bastante promissor em diferentes aplicações como catálise, dispositivos eletrocrômicos (LEITE et al., 2006), fotocatálise, detector de gases (HE et al., 2014) e em biomateriais (KARLINSEY et al., 2006; VELTEN et al., 2004).
É importante salientar que o Brasil é o maior produtor mundial de nióbio, representando mais de 98% do total mundial (PEREIRA, 2013) e, por esta razão, é importante a realização de estudos visando a geração de novas tecnologias com a utilização de compostos desse material. A figura 9 mostra a estrutura química do Nb2O5.
Figura 9. Estrutura química do pentóxido de nióbio.
Fonte: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Niobium_oxide#section=2D-Structure
O Nb2O5 apresenta diferentes fases cristalográficas: pseudo-hexagonal (fase TT), ortorrômbica (fase T), tetragonal (fase M) e monoclínica (fase H). Geralmente, o Nb2O5 se cristaliza a 500ºC nas fases TT ou T (pseudo-hexagonal ou ortorrômbica), a temperatura média (~800ºC) se transforma na fase M (tetragonal) e acima de ~1000ºC a fase H (monoclínica) é formada (RANI et al., 2014). As fases TT e T possuem estruturas semelhantes, mas a fase TT nem sempre é formada quando são utilizados
componentes puros como materiais precursores, o que sugere que a fase TT seja apenas uma forma menos cristalina da fase T, mas estabilizada por impurezas (KO; WEISSMAN, 1990). A figura 10 ilustra as alterações das fases do Nb2O5 em função da temperatura de síntese.
Figura 10. Alterações das fases do Nb2O5 em função da temperatura de síntese.
Fonte: Adaptado de RANI et al., 2014, p. 15685.
Os compostos de nióbio vêm se destacando como materiais promissores para aplicações em biomateriais devido a sua boa interação com os tecidos humanos. Estudos mostraram que ligas de titânio revestidas com Nb2O5 apresentaram grande melhoria na biocompatibilidade, bioatividade e resistência à corrosão (LI et al., 2016b; MAZUR et al., 2015; VELTEN et al., 2004). O Nb2O5 também melhorou a adesão, diferenciação e proliferação celular (EISENBARTH et al., 2006; KUSHWAHA et al., 2012), facilitou o crescimento de cristais de hidroxiapatita (KARLINSEY et al., 2006), promoveu a formação de cristais de fluorapatita submicrométricos esféricos (DENRY et al., 2005) e aumentou a atividade de fosfatase alcalina (OBATA et al., 2012).
Diversas pesquisas estão sendo voltadas para a criação de diferentes metodologias de síntese de nanopartículas de Nb2O5 visando a busca de propriedades
específicas como, por exemplo, obtenção de nanopartículas em determinada fase cristalina com controle de tamanho e morfologia (HASHEMZADEH; RAHIMI; GAFFARINEJAD, 2013). As nanopartículas de Nb2O5 já foram obtidas através de diferentes metodologias, tais como: hidrotérmica (HASHEMZADEH; RAHIMI; GAFFARINEJAD, 2013; LEITE et al., 2006; LOPES.O.F, 2013; UEKAWA et al., 2003), meio orgânico (PINNA; ANTONIETTI; NIEDERBERGER, 2004), precipitação (ZHOU et al., 2008), sol-gel (SREETHAWONG et al., 2013) e Pechini (RABA; BARBA-ORTEGA; JOYA, 2015).
3.4.3. Hidroxiapatita
A hidroxiapatita (HA) é a uma cerâmica à base de fosfato de cálcio e possui fórmula química Ca10(PO4)6(OH)2 e é o principal componente inorgânico do osso. Esse material vendo sendo amplamente utilizado em pesquisas envolvendo biomateriais devido à sua biocompatibilidade, bioatividade e semelhança química aos ossos e dentes naturais (WANG; FU, 2011). Tem sido amplamente empregada para aplicações biomédicas, utilizada, principalmente, como material de reparo ósseo (CHEN et al., 2011). Estudos demonstraram que as nanopartículas de HA promoveram a proliferação de células ósseas, impediram o crescimento de células cancerígenas (CAI et al., 2007) e aumentaram a absorção de proteínas e adesão celular (CHEN; CHANG, 2011). A figura 11 mostra a estrutura química da HA.
Figura 11. Estrutura química da hidroxiapatita.
A hidroxiapatita apresenta uma razão Ca/P de 1,67, mas pode apresentar razões com variações de até 1,5 nos casos de substituições (FULMER et al., 2002). A HA sintética pode ser obtida através de diferentes rotas de síntese e, dependendo da rota utilizada, a razão Ca/P, cristalinidade, dimensão dos cristais, área superficial, e, consequentemente, o grau de compactação, resistência mecânica e porosidade podem variar (TORRENT-BURGUES; RODRIGUEZ-CLEMENTE, 2001).
A HA tem sido amplamente utilizada na pesquisa de biomateriais devido à sua biocompatibilidade, bioatividade e semelhança química aos ossos e dentes naturais (WANG; FU, 2011). Tem sido amplamente empregada para aplicações biomédicas, usado principalmente como material de reparo ósseo (CHEN et al., 2011). Demonstrou-se que as nanopartículas de HA promovem a proliferação de células ósseas, impedem o crescimento de células cancerígenas (CAI et al., 2007) e aumentam a absorção de proteínas e a adesão celular (CHEN; CHANG, 2011).
4. Materiais e Métodos
4.1. Materiais
4.1.1. Membranas de PLA/Nb
Para a síntese das nanopartículas de Nb2O5 foi utilizado o oxalato amoniacal de nióbio, o qual foi gentilmente doado pela Companhia Brasileira de Metalurgia e Mineração (CBMM, Brasil), o peróxido de hidrogênio (Dinâmica, Brasil) e o álcool etílico absoluto (LabSynth, Brasil).
Para a obtenção das membranas foram utilizados o poli (ácido lático) (PLA, 4032D, NatureWorks LLC, 100.000g/mol), clorofórmio (≥99%, Synth, Brasil) e N,N-dimetilformamida (99,8%, Vetec, Brasil). As células de fibroblastos de camundongos (NIH/3T3) foram obtidas do Banco de Células do Rio de Janeiro (PABCAM, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil). Para as demais análises foram utilizados o meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco, EUA), soro fetal bovino (SFB, Gibco, EUA), brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT, Sigma-Aldrich, Brasil) e dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich, Brasil).
4.1.2. Membranas de PGHANb
Para a síntese das nanopartículas de Nb2O5 foram utilizados os mesmos reagentes descritos anteriormente no item 4.1.1 e para a obtenção das nanopartículas de HA foram utilizados nitrato de cálcio tetrahidratado (Synth, Brasil), ácido fosfórico (Synth, Brasil), 1,2-etilenodiamina (Dinâmica, Brasil) e água deionizada.
Para a obtenção das membranas foram utilizadas a policaprolactona (PCL, PM 80.000, Aldrich, Canadá), gelatina (GL tipo B, extraída de pele bovina, Sigma-Aldrich, Canadá), 2,2,2-trifluoroetanol (TFE, EMD Millipore Corporation, EUA) e ácido acético (Caledon, Canadá).
Para a preparação da solução de fluido corporal simulado (SBF) foram utilizados cloreto de sódio Aldrich, Canadá), bicarbonato de sódio (Sigma-Aldrich, Canadá), cloreto de potássio (Sigma-(Sigma-Aldrich, Canadá), hidrogenofosfato di-potássico trihidratado (Sigma-Aldrich, Canadá), cloreto de magnésio hexahidratado
(Sigma-Aldrich, Canadá), ácido clorídrico (LabChem, Canadá), cloreto de cálcio (Sigma-Aldrich, Canadá), sulfato de sódio (Sigma-Aldrich, Canadá) e tris-hidroximetilaminometano (Tris, Sigma-Aldrich, Canadá).
Para o ensaio de degração in vitro foi utilizado a solução tampão fosfato salina (PBS) com pH 7 (PBS, GibcoTM, Life Technology Corporation, EUA).
4.2. Métodos
Esse trabalho foi dividido em duas etapas: 1) Obtenção e caracterização de nanopartículas de Nb2O5 por SHM e obtenção de membranas compósitas à base de PLA com adição de diferentes concentrações de nanopartículas de Nb2O5 para aplicação em tecido epitelial (referidas como PLA/Nb); 2) Obtenção e caracterização de nanopartículas de Nb2O5 e nanopartículas de HA e obtenção de membranas compósitas à base de PCL/GL com adição de nanopartículas de HA e diferentes concentrações de nanopartículas de Nb2O5 para aplicação em tecido ósseo (referidas como PGHANb).
4.2.1. Membranas de PLA/Nb
4.2.1.1. Síntese das Nanopartículas de Nb2O5
A obtenção das nanopartículas de Nb2O5 foi realizada através da síntese hidrotérmica assistida por micro-ondas, conforme metodologia descrita anteriormente (MARINS et al., 2017). Nesta síntese, 2g do complexo amoniacal de nióbio foram dissolvidas em 100mL de água destilada. Após a completa dissolução, o peróxido de hidrogênio a 30% (em volume) foi adicionado em uma relação 10mol/mol de Nb. O tratamento hidrotérmico foi realizado a 160°C por 1h, seguido de resfriamento natural até a temperatura ambiente (~24°C). Após o tratamento, o precipitado foi lavado com álcool etílico absoluto e seco em estufa com circulação de ar a 50°C por 24h. A figura 12 mostra o fluxograma com as etapas da SHM para a obtenção das nanopartículas de Nb2O5.
Figura 12. Fluxograma de obtenção das nanopartículas de Nb2O5 por SHM.
4.2.1.2. Obtenção das Membranas de PLA/Nb
As membranas foram preparadas a partir de soluções contendo 12% (p/v) de PLA em clorofórmio/dimetilformamida e diferentes concentrações de Nb2O5 (0, 1, 3 e 5% p/p). Uma solução de 12% (p/v) de PLA foi preparada dissolvendo PLA em clorofórmio/dimetilformamida em uma razão de 4:1. Primeiramente, o PLA foi dissolvido em clorofórmio sob agitação durante 150min à temperatura ambiente (~24°C) e as diferentes concentrações de nanopartículas de Nb2O5 foram dispersas em dimetilformamida sob banho ultrassônico durante 30min. Ambas as soluções foram misturadas e agitadas durante 2h à temperatura ambiente (~24°C). As soluções de PLA/Nb2O5 foram agitadas durante 15min antes de serem submetidas ao processo de electrospinning. A tabela 3 mostra a descrição das amostras.
Tabela 3. Descrição das membranas de PLA/Nb e as quantidades de nanopartículas utilizadas. Amostras % de Nanopartículas PLA puro 0% (p/p) PLA/Nb-1% 1% (p/p) de Nb2O5 PLA/Nb-3% 3% (p/p) de Nb2O5 PLA/Nb-5% 5% (p/p) de Nb2O5
Cada solução foi colocada em uma seringa de plástico (BD) de 2mL acoplada com uma agulha de aço inoxidável de 26G. As fibras foram obtidas utilizando uma bomba de infusão (KD100 KD Scientific Inc., Nova Esperança, PA) acoplada a uma fonte de alimentação de alta tensão. As nanofibras foram coletadas em folha de alumínio por 1h utilizando uma voltagem de 20kV, vazão de alimentação de 1mL/h, distância de trabalho de 20cm (distância entre o coletor e a agulha), umidade relativa de ~40% e temperatura ambiente (~24°C). As concentrações poliméricas e os parâmetros de processo utilizados foram selecionados após testes pilotos previamente realizados. As membranas obtidas foram armazenadas em um dessecador por uma semana visando a evaporação total do solvente. A figura 13 ilustra o fluxograma de obtenção das amostras de PLA/Nb.
4.2.1.3. Caracterizações das Nanopartículas de Nb2O5
A fase e a estrutura cristalina das nanopartículas de Nb2O5 foram investigadas por difração de raios-X (XRD, 6000, Shimadzu, Japão) com radiação CuKα (λ=1,5418 Å) e a composição química e estrutural foi determinada por Espectroscopia Raman (InViaTM, Renishaw, Reino Unido).
A morfologia foi analisada por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV, Supra 35, Zeiss, Alemanha) e Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET, TITAN 80-300, FEI Company, EUA). Para a análise de MEV, as nanopartículas foram dispersas em álcool etílico absoluto através de banho de ultrassom durante 15min. As amostras dispersas foram depositadas sobre uma placa de silício e deixadas evaporar por 2h. As amostras foram recobertas com uma fina camada de ouro (~10nm). Para a análise de MET, as nanopartículas foram dispersas em álcool etílico absoluto através de banho ultrassônico por 15min. Em seguida, foram depositadas sobre uma grade de cobre contendo um filme de carbono e deixadas evaporar por 2h. As amostras foram submetidas a uma limpeza com plasma de oxigênio por 30seg para remoção de resíduos orgânicos. Os diâmetros das nanopartículas foram medidos usando o software ImageJ (Instituto Nacional de Saúde, EUA). As medidas foram realizadas utilizando as micrografias obtidas por MEV em locais aleatórios (n=100).
4.2.1.4. Caracterização das Membranas de PLA/Nb
A análise estatística dos diferentes resultados foi avaliada por análise de variância de duas-vias com intervalo de significância de α=0,05 e teste Tukey para avaliar os contrastes, utilizando o programa estatístico R.
4.2.1.4.1. Morfologia e Composição Química
A morfologia e composição química das membranas foram observadas por MEV e Espectroscopia de Raios-X por Dispersão de Energia (EDS). Para esta análise, as amostras foram coladas no substrato com fita dupla face de carbono e recobertas com uma fina camada de carbono (~5nm). O diâmetro das fibras foi medido usando o
