Motivação da Tese

As estatísticas apontam para que haja um aumento exponencial na incidência de doenças crónicas, como o cancro, doenças cardiovasculares e respiratórias, diabetes, entre outras (WHO, 2005). Sabe-se também que muitas destas doenças estão diretamente relacionadas com o estilo de vida adotado mundialmente no último século, incluindo o sedentarismo e a má alimentação.

Por este facto, tem-se assistido a uma crescente procura por parte dos consumidores por novos produtos alimentares que complementem características nutricionais com propriedades funcionais, proporcionando uma fonte adicional de compostos benéficos para a saúde. Estes novos produtos alimentares podem ser conseguidos pela introdução de ingredientes naturais provenientes de matrizes tais como, plantas aromáticas e medicinais. Estas têm vindo a ser usadas desde tempos ancestrais dado as suas características organoléticas, terapêuticas e medicinais, representando por isso, ainda hoje, um marco para a etnomedicina na procura de novos compostos bioativos (Fabricant & Farnsworth, 2001).

Dado o aumento da procura por estes novos produtos à base de ingredientes naturais, é necessário encontrar uma resposta eficaz para a sua produção, nomeadamente sem conduzir a perdas de populações de plantas, degradação dos habitats ou perda da diversidade genética que, em último caso, pode levar à extinção de espécies (Schippmann et al, 2002; Roberto et al., 201). Surge assim a cultura de células e tecidos vegetais como uma alternativa sustentável e viável que responde a esta problemática estimulando a produção por técnicas de micropropagação e elicitação. Esta técnica está endossada pela FAO (Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura) como permitida para a produção de compostos bioativos com aplicabilidade na indústria alimentar. Adicionalmente, existem já uma série de diretrizes publicadas pela FAO em conjunto com a IAEA (Divisão de técnicas nucleares para a alimentação e agricultura), visando a sua implementação de forma sustentável e economicamente viável (FAO/IAEA, 2002).

Outra problemática relacionada com os compostos bioativos é a sua perecibilidade; estes podem apresentar tendência para a degradação quando processados, durante o armazenamento ou até mesmo após ingestão, o que condiciona a sua utilização direta nos alimentos limitando o desenvolvimento de novos alimentos funcionais na indústria alimentar (Espín et al., 2007; Joye et al., 2014).

A técnica proposta para colmatar esta fragilidade dos compostos bioativos é a microencapsulação, técnica que tem vindo a ser usada, já há já algumas décadas, em outros setores industriais, nomeadamente têxtil, agrícola e farmacêutico (Martins et al., 2014). No que respeita a indústria alimentar, a microencapsulação tem vindo a despertar um interesse crescente pois permite não só a proteção eficaz dos compostos bioativos, como

também assegura a sua estabilidade e permite uma libertação controlada e/ou localizada no organismo, aumentando assim a eficácia destes novos ingredientes naturais (Kuang et al., 2010; Nazzaro et al., 2012).

Neste contexto, o grande objecto de estudo desta tese são os compostos bioativos, mais propriamente os compostos fenólicos. Estes compostos são reconhecidos pelas suas propriedades biológicas, mas também bioativas, apresentando propriedades anticancerígenas e antifibrilogénicas (Quideau et al., 2011; Carocho & Ferreira, 2013). De realçar que o seu consumo diário resulta em efeitos benéficos para a saúde do consumidor a longo prazo e, por isso, tem motivado muitos estudos relacionados com a sua utilização na alimentação. Assim, torna-se importante a sua obtenção em quantidade através de técnicas de cultura de células e tecidos, mas também a sua protecção e aplicação em matrizes alimentares através de técnicas de microencapsulação.

Assim, no presente trabalho, aplicaram-se duas ferramentas à área dos bioativos naturais: (i) a técnica de cultura in vitro que visou estudar a intensificação da produção de compostos bioativos, mais especificamente compostos fenólicos; (ii) a técnica de microencapsulação como via de viabilização do uso destes ingredientes funcionais em matrizes alimentares, sem perda da sua bioatividade.

1.2. Objetivos

O objectivo principal deste trabalho consistiu na aplicação de duas tecnologias à obtenção de compostos bioativos de espécies vegetais, uma destinada à produção em larga escala destes fitoquímicos, nomeadamente compostos fenólicos (cultura in vitro), e outra visando colmatar a fragilidade que estes apresentam na sua forma livre (microencapsulação).

Numa primeira abordagem, selecionaram-se quatro espécies de plantas: Achillea

millefolium L., Fragaria vesca L. Laurus nobilis L. e Taraxacum sect Ruderalia (Figura 1),

que foram submetidas a estudos de caracterização nutricional e química, bem como à avaliação das propriedades bioativas. Foram determinados os teores de cinzas, proteínas, gordura, minerais (micro e macroelementos), fibra e valor energético, utilizando procedimentos AOAC (Associação Oficial de Químicos Analíticos), bem como a composição individual em ácidos gordos, tocoferóis, folatos, açúcares, ácidos orgânicos e compostos fenólicos, utilizando métodos cromatográficos e de espetrometria de massa. No caso dos minerais, efeturam-se ainda estudos de bioacessibilidade através de procedimentos de digestão in vitro. A bioatividade foi avaliada através da determinação das propriedades:

(i) antioxidantes (atividade captadora de radicais DPPH- 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo, poder redutor, inibição da descoloração do β-caroteno e inibição da peroxidação lipídica através do ensaio das espécies reativas do ácido tiobarbitúrico- TBARS); (ii) citotóxicas em linhas celulares tumorais humanas (ensaio da sulfarrodamina B em MCF-7- carcinoma de mama, NCI-H460- carcinoma de pulmão, HCT 15- carcinoma de cólon, HeLa- carcinoma cervical e HepG2- carcinoma de fígado) e em culturas primárias de células de fígado de porco PLP2;

(iii) antimicrobianas com estirpes ATCC (Coleção de culturas tipo Americana) e bactérias isoladas clinicamente (microdiluição acoplada ao método colorimétrico rápido com cloreto de p-iodonitrotetrazólio- INT); e (iv) inibição da produção de biofilme em estripes de bactérias isoladas clinicamente.

Foram também estabelecidas culturas de células e tecidos vegetais com as espécies mencionadas, com o objetivo de otimizar a produção de compostos fenólicos bioativos. Para isso, procedeu-se à esterilização do explante, à germinação das sementes e à aplicação de diferentes concentrações dos fitorreguladores IBA (ácido índolbutírico) e BAP (benzilaminopurina). Da massa vegetal recolhida após crescimento controlado (F.

vesca foi a única espécie bem-sucedida), fizeram-se novamente os ensaios de

caracterização química e avaliação das propriedades bioativas de extratos aquosos (obtidos por infusão e decocção) e hidro-alcoólicos (extração com metanol: água, 80:20,

v/v).

Finalmente, o extrato mais bioativo (infusão) foi estabilizado por microencapsulação (técnica de atomização/coagulação), tendo-se procedido à caracterização das microesferas obtidas por microscopia ótica (OM – optical microscopy), microscopia electrónica de varrimento (SEM – Scanning electron microscopy) e espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR – Fourier transform infrared spectroscopy), bem como à avaliação da eficiência de encapsulação, esta baseada na quantificação dos compostos identificados na água de coagulação (quercetina-O-glucorónido) por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O extrato foi posteriormente incorporado, na forma livre e microencapsulada, numa matriz alimentar (gelatina) com vista ao desenvolvimento de nutracêuticos e alimentos funcionais.