Caenorhabiditis elegans é um nematoide de vida livre naturalmente encontrado em solos de regiões de clima temperado alimentando-se de diferentes bactérias incluindo Escherichia coli. Ele existe em duas formas sexuais, como hermafrodita ou como macho. O primeiro é auto-fértil, capaz de produzir seus próprios espermatozoides e ovos, e é a forma adulta predominante. Embora os machos sejam raros (cerca de 0,02%), sua abundância na prole pode ser aumentada para 50% por acasalamento com hermafroditas. O animal apresenta um rápido ciclo de vida e reprodução, pequeno tamanho (1,5 mm quando adulto), corpo transparente, e pelo seu fácil cultivo e manuseio, além do grande potencial para análises gênicas, este nematoide se tornou um excelente modelo biológico para estudos de biologia do desenvolvimento, genética, envelhecimento e de ecotoxicologia (BRENNER, 1974; WHITE et al 1986; WORMBOOK, 2006).
Nas últimas décadas, muitas descobertas importantes com relevância para os mamíferos foram feitas utilizando esse organismo, e isso foi possível porque há uma forte conservação entre eles quanto aos princípios celulares e moleculares (GOLSTEIN et al., 2003). Sabe-se que de 60% a 80% dos genes humanos possuem homólogos em C. elegans (EQUENCE et al., 1998). Além disso, o nematodo apresenta a maioria dos tecidos presentes em vertebrados superiores, tais como sistema nervoso, músculo estriado, intestino, além de estruturas relacionadas ao sistema imune (STIERNAGLE, 2006).
O sistema nervoso de C. elegans é composto de 302 neurônios, que utilizam a maioria dos neurotransmissores conhecidos no sistema nervoso de mamíferos, incluindo ácido γ-aminobutírico (GABA), dopamina, glutamato, serotonina e acetilcolina. Estima- se que cerca de 42% dos genes de doenças humanas têm um ortólogo no genoma de C. elegans (MARKAKI; TAVERNARAKIS, 2010). Além disso, as manipulações genéticas podem ser facilmente realizadas e os neurônios específicos marcados com
40 fluorescência podem ser visualizados in vivo, o que torna o C. elegans um excelente modelo para estudo de doenças neurodegenerativas. Assim, tem sido utilizado como modelo para várias doenças incluindo DA associado ao βA, Doença de Parkinson (DP) ligada a α-sinucleína, Esclerose lateral amiotrófica (ELA) ligada a SOD1 e Doença de Huntington (DH) relacionada com poliQ (LI; LE, 2013). Na Figura 7 tem-se a representação dos genes e modelos para algumas doenças neurodegenerativas em C. elegans.
O estudo da DA usando C. elegans como modelo biológico é feito através de diversas formas, sendo que os modelos utilizados são os transgênicos para o peptídeo βA e proteína tau. As abordagens mais comuns são as gênicas, onde são avaliados os genes envolvidos com o desenvolvimento e modulação da doença (ALEXANDER; MARFIL; LI, 2014; CHEN; BURGOYNE, 2012; LI; LE, 2013; LINK et al., 2003), bem como a expressão desses após o animal ter sido exposto a determinadas substâncias tais como, moléculas semi-sintéticas (XIN et al., 2013), fármacos (ARYA; DWIVEDI; SUBRAMANIAM, 2009), extratos (DOSTAL; ROBERTS; LINK, 2010; PAIVA et al., 2015; SMITH; LUO, 2003) entre outros. Há também abordagens para a DA que utilizam o nematoide para análises de metaboloma (ASSCHE; TEMMERMAN, 2015) e proteômica (BOYD-KIMBALL et al., 2006).
Figura 7- Modelos de C. elegans para doenças neurodegenerativas
Fonte: ADAPTADO de LI; LE, 2013
A utilização de C. elegans como modelo biológico para a triagem de novas moléculas candidatas a fármaco é uma alternativa que vem sendo utilizada em
41 laboratórios de pesquisa e, inclusive, pela indústria devido as vantagens do animal em comparação ao Mus musculus, para técnicas de triagem como, por exemplo, o Hight throughput screening (HTS). O nematódeo pode ser utilizado para essa abordagem de duas formas básicas: Expor o animal selvagem as novas moléculas e verificar o seu comportamento e fenótipo (crescimento, morte, defeitos morfológicos, defeito na ovoposição, paralisia...), ou expor o animal mutante, transgênico ou manipulado através de RNAi com um fenótipo/desordem a novas entidades químicas e verificar se ocorre regressão ou retardamento do fenótipo (GIACOMOTTO; SÉGALAT, 2010).
A literatura relata alguns trabalhos que utilizam modelos de C. elegans para avaliar a atividade de produtos naturais, sendo que as avaliações mais comuns são a antioxidante e aumento da longevidade, onde são utilizados principalmente compostos fenólicos, especialmente flavonoides (GRÜNZ et al., 2012; KAMPKÖTTER et al., 2008; SMITH; LUO, 2003) e os principais genes estudados são DAF-16, SOD-3 e GST- 4. O trabalho de Koch e colaboradores (2014) traz uma revisão ampla, onde são apresentados diversos trabalhos onde são utilizados flavonoides isolados, bem como extratos enriquecidos com estes, e sua atividade antioxidante em modelos de C. elegans (KOCH et al., 2014). Os trabalhos que utilizam extratos ou frações enriquecidas avaliam, principalmente, a longevidade do animal (GUHA et al., 2013; KUMAR et al., 2013; LIU et al., 2013; YANG et al., 2012) e o efeito nematicida (RODRIGUES et al., 2015). O trabalho de Liu e colaboradores (2011) além de mostrar o efeito nematicida do extrado de Ficus carica L. identificou que a atividade estava relacionada a uma cumarina, o psoraleno (LIU et al., 2011). Há, também, trabalhos com carotenoides, mostrando sua atividade na redução da paralisia em cepas transgênicas para o peptideo βA, bem como a atividade antioxidante (CHEN et al., 2015; YOU et al., 2015).
Para alcaloides também há trabalhos relatados utilizando modelos do nematoide, no entanto devido a variedade estrutural dessa classe de metabólitos, as abordagens são mais variadas. Xin e colaboradores (2013) utilizou o transgênico CL4176 para avaliar o efeito de derivados de alcaloides na redução da paralisia e inibição da enzima acetilcolinesterase (XIN et al., 2013). Khadijah (2016) também mostrou em seu trabalho a capacidade da Fenserina, um outro alcaloide com atividade anticolinesterásica, proteger C. elegans da toxicidade promovida pelo peptídeo βA e a capacidade antioxidante do óleo de Nigella sativa (KHADIJAH, 2016). Huang e colaboradores (2017), sintetizaram 14 derivados do grupo de alcaloides oxoisoaporfina e verificaram
42 que um dos compostos reduziu significativamente a secreção do peptídeo βA em células SH-SY5Y, que superexpressão a proteína precursora para o peptídeo β-amiloide humano, verificaram também que a mesma molécula reduziu a paralisia na cepa GMC101 [unc-54p::A-beta-1-42::unc-54 3’-UTR +mtl-2p::GFP], que expressa o peptídeo βA humano na parede do músculo que se agrega in vivo e isso poderia estar associado a atividade anticolinesterásica e antioxidante (HUANG et el., 2017). Arya e colaboradores (2009) utilizando o alcaloide reserpina, um fármaco anti-hipertensivo inibidor do transportador vesicular de monoaminas (VMAT), mostraram a capacidade do mesmo em aumentar a longevidade e reduzir a paralisia nos modelos modelos CL2006 (dvIs2 [pCL12(unc-54/human Abeta peptide 1-42 minigene) + pRF4) e CL2355 (dvIs50 [pCL45 (snb-1::Abeta 1-42::3' UTR(long) + mtl-2::GFP]), onde o primeiro expressa o peptídeo βA na parede do músculo e o segundo expressa o peptídeo βA neural. Além disso, mostrou que este alcaloide promoveu um aumento termotolerância no verme. Contudo, a expressão do βA permaneceu inalterada (ARYA; DWIVEDI; SUBRAMANIAM, 2009). Jakonsen e colaboradores (2013) testaram o alcaloide β-carbolínico, Harmano, em modelos de infecção de C. elegans e verificaram que este alcaloide teve a capacidade de aumentar o tempo de vida do animal, não por ter atividade antimicrobiana, mas sim por modular a resposta imune no nematoide (JAKOBSEN et al., 2013). Zhu e colaboradores (2016) testaram 6 alcaloides bromopirrólicos isolados de Agelas sp. Em modelos de C. elegans de infecção fúngica (SC5314) por Candida albicans e verificaram que estes tiveram atividade contra o fungo, no entanto nenhum deles teve atividade superior ao padrão, fluconazol (YU et al., 2016). How e Ato (2013), também fizeram estudos de atividades de alcaloides em modelos de C. elegans para avaliar o metabolismo de lipídeos. No trabalho deles foram testados 5 alcaloides isoquinolínicos (sanguinarina, magnoflorina, isotetrandrina, tetrandrina e aromolina). Como padrão eles utilizaram a Berberina, um alcaloide que reduz a acumulação de lipídios por meio da ativação da AMP quinase. Nos resultados observou-se que apenas a sanguinarina teve efeito na redução da acumulação de lipídos, no entanto sua ação foi muito maior que a da berberina, mesmo aquela estando em concentrações menores. Os demais alcaloides não apresentaram atividade significante (HOW; ATO, 2013).
43 3. OBJETIVOS