UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
WAMBERTO ALRISTENIO MOREIRA DE ALMEIDA
DESIGN E SÍNTESE DE DERIVADOS DA RETRONECINA E
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE in vivo NO MODELO DE
Caenorhabditis elegans PARA A DOENÇA DE ALZHEIMER
NATAL – RN 2018
WAMBERTO ALRISTENIO MOREIRA DE ALMEIDA
DESIGN E SÍNTESE DE DERIVADOS DA RETRONECINA E
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE in vivo NO MODELO DE
Caenorhabditis elegans PARA A DOENÇA DE ALZHEIMER
NATAL – RN 2018
Dissertação apresentada na faculdade de farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para a obtenção do título de mestre em ciências farmacêuticas. Área de concentração produtos naturais
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Almeida, Wamberto Alristenio Moreira de.
Design e síntese de derivados da retronecina e avaliação da atividade in vivo no modelo de Caenorhabditis elegans para a doença de alzheimer / Wamberto Alristenio Moreira de Almeida. -
2018. 150f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas. Nata, RN, 2018. Orientadora: Raquel Brandt Giordani. Coorientadora: Riva de Paula Oliveira.
1. Doença de Alzheimer - Dissertação. 2. C. elegans - Dissertação. 3. Alcaloides - Dissertação. I. Giordani, Raquel
Brandt. II. Oliveira, Riva de Paula. III. Título. RN/UF/BS-CCS CDU 616.892.3
AGRADECIMENTOS
Quero agradecer primeiramente a Deus, não apenas por permitir que eu concluísse esse trabalho, mas também por ter estado comigo durante todo esse tempo me dando forças, paciência e perseverança.
À minha orientadora Profa. Raquel Brandt Giordani, por ter confiado nas minhas ideias e por ter me auxiliado de todas as formas que ela pode a concretiza-las. A profa Raquel é um exemplo de profissional e de humildade. Não preciso te desejar sucesso, profa Raquel, pois esse é o destino de pessoas como Sra.
À minha co-orientadora Profa. Riva de Paula Oliveira, por ter confiado na nossa ideia e aberto as portas do seu laboratório para mim, e por todos os ensinamentos proporcionados. Que a Sra continue sendo essa pessoa carismática, animada e comprometida com a pesquisa.
Agradeço, também, a todos que possibilitaram de alguma forma a concretização deste trabalho. Em específico ao Prof. Fernando hallwass, que analisou as amostras nos espectros de RMN, ao prof. Euzébio que me auxiliou com as ferramentas da química. computacional, a finada Joselice que ajudou no desenvolvimento da ideia deste trabalho. Tenho certeza que ela está em um bom lugar.
Aos colegas dos laboratórios PNBio e LGB que fizeram parte dos momentos de descontração, momentos esses que foram essenciais, pois as decepções eram grandes e as dificuldades maiores ainda, mas os conselhos e as conversas foram um auxílio importante em meio as adversidades. Dentre todos os integrantes destes laboratórios agradeço especialmente a Cecilia, aluna de iniciação científica da professora Raquel, que me auxiliou nos experimentos deste trabalho e foi um suporte importante para a concretização do mesmo, e a Giovana, carinhosamente conhecida como Gigi, aluna da profa Riva, que foi crucial para minha adaptação no LGB e nos experimentos com C. elegans.
À minha família que sempre torceu por mim e sabe o quanto eu me esforço para mudar a minha realidade. Em especial a minha mãe, que sempre cuida de mim, e é a razão pela qual eu me esforço todos os dias para ter um futuro melhor.
RESUMO
A doença de Alzheimer (DA) é uma patologia neurodegenerativa multifatorial e a forma mais comum de demência no idoso em todo o mundo. As principais características patológicas da DA incluem placas beta-amiloides (βA), emaranhados neurofibrilares provenientes da hiperfosforilação da proteína tau, declínio da função colinérgica, estresse oxidativo e inflamação. O peptídeo βA é o alvo mais estudado, pois o surgimento das placas senis desencadeia os demais processos, ou atua por feedback nestes. O tratamento atual da DA é baseado em inibidores da enzima acetilcolinesterase e na memantina, um antagonista dos receptores N-metil-D-Aspartato, contudo os tratamentos são paliativos, uma vez que não interrompem o curso natural da doença, por essa razão as novas abordagens são baseadas em fármacos multialvos. Dentre os produtos naturais os alcaloides são os que mais se destacam como fonte de novos fármacos, inclusive, os anticolinesterásicos utilizados no tratamento da DA são alcaloides ou derivados semi-sintéticos destes. O objetivo deste estudo é desenvolver novas moléculas a partir da condensação do núcleo alcaloídico pirrolizidínico a L-aminoácidos (fenilalanina e triptofano) e avaliar a atividade destas no modelo de Caenorhabditis elegans para a DA, isto porque um screening virtual de aminoácidos condensados a retronecina (RTN) foi realizado, e as moléculas apresentaram afinidade pela enzima acetilcolinesterase (AChE). A monocrotalina (MCT), molécula de partida para a síntese dos derivados, foi isolada a partir das sementes de Crotalaria retusa por meio de maceração em metanol seguida de extração ácido-base, posteriormente a mesma foi hidrolisada com hidróxido de bário e o núcleo pirrolizidínico, a RTN, foi obtida por isolamento em coluna de alumina básica. A RTN foi halogenada no carbono nove através de reação com cloreto de tionila, afim de favorecer reações de substituição nucleofílica nesta posição. Diversas propostas reacionais foram efetuadas objetivando condensar os L-aminoácidos ao núcleo pirrolizidínicos. Os ensaios biológicos in vivo foram realizados no modelo já bem estabelecido para a DA a cepa CL2006 de Caenorhabditis elegans, um nematoide que expressa o peptído β-amiloide (βA) humano no músculo de forma constitutiva, que o leva a uma paralisia progressiva, as moléculas foram testadas em 3 concentrações 10, 50 e 100 μmol. Os animais foram sincronizados pelo método de NaClO e no quarto dia foram submetidos a temperatura de 35 ºC, que acelera o fenótipo de paralisia. Os vermes foram analisados a cada hora através do toque com a alça de platina, e aqueles que não moviam a região posterior do corpo eram quantificados como paralisados. Como padrão utilizou-se a memantina, que é o fármaco de escolha para os quadros avançados da DA. A memantina
prolongou o tempo de paralisia no animal, o que corrobora com a literatura. A RTN na concentração de 100 µmol reduziu levemente a paralisia nos animais, enquanto que a retronecina clorada (RTNCl) não prolongou o tempo de paralisia nos animais, contudo não foi tóxica a estes mesmo em concentrações de 100 mmol. Os resultados mostram que a RTN e a RTNCl não são tóxicas como seu produto de partida, a MCT, o que é um indicativo que as modificações moleculares podem ser úteis para redução da toxicidade e ampliar os campos de atividade biológica para alcaloides pirrolizidínicos. A partir dos espectros dos produtos reacionais, estruturas foram propostas para os produtos obtidos.
ABSTRACT
Alzheimer's disease (AD) is a multifactorial neurodegenerative disease and the most common form of dementia in the elderly worldwide. Pathological characteristics of AD include amyloid beta (Aβ) plaques, neurofibrillary tangles comprising hyperphosphorylated tau protein, decline of cholinergic function, oxidative stress and inflammation. The Aβ peptide is the most studied target, since the appearance of the senile plaques is the trigger for the other processes or acts by feedback in them. The current treatment of AD is based on inhibitors of the enzyme acetylcholinesterase and memantine, an N-methyl-D-aspartate receptor antagonist, however both treatments are palliative because they do not impair the natural course of the disease, hence the new approaches are based on multi-target drugs. Among natural products alkaloids are the most outstanding as source of new drugs, including the anticholinesterasic agents used in the treatment of AD are alkaloids or their semisynthetic derivatives. The aim of this study is to develop new molecules by associating the pyrrolizidine alkaloid nucleus with L-aminoacid and to evaluate their activity in C. elegans an in vivo alternative model with targets related to AD. Because a virtual screening of condensed amino acids to retronecine (RTN) was performed, and the molecules showed affinity for the enzyme acetylcholinesterase (AChE) were selected for synthesis and biological evaluation. monocrotaline (MCT), the starting molecule for the synthesis of the derivatives, was isolated from the seeds of Crotalaria retusa by maceration in methanol followed by acid-base extraction, subsequently the same was hydrolyzed with barium hydroxide and the pyrrolizidine nucleus, retronecine (RTN), was obtained by column isolation of basic alumina. RTN was halogenated through reaction with thionyl chloride at C-9 to favor nucleophilic substitution reactions at this position. Biological assays were performed on the already well-established model for DA the strain CL2006 of Caenorhabditis elegans, which expresses the human β-amyloid (βA) peptide in the muscle in a constitutive way, which leads to progressive paralysis. The molecules were tested at 3 concentrations 10, 50 and 100 μmol. The animals were synchronized by the NaClO method and on the fourth day were submitted to a temperature of 35ºC, which accelerates the phenotype of paralysis. The worms were analyzed every hour by touching with the platinum loop, and those that did not move the posterior region of the body were quantified as paralyzed. Memantine, which is the drug of choice for advanced disease, was used as standard. Memantine prolonged the paralysis in the animal, which corroborates with the literature. RTN at the concentration of 100 μmol slightly reduced the paralysis in the animals. The results show that RTN and RTNCl are non-toxic as their
starting product, monocrotaline, which is an indication that molecular modifications may be useful for reducing toxicity and broadening the fields of biological activity for pyrrolizidine alkaloids. From the spectra of the reactional products, structures were proposed for the obtained products.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Frutos maduros de Crotalaria retusa _____________________________ 29 Figura 2 - Classificação dos alcaloides pirrolizidínicos _______________________ 31 Figura 3 -Estrutura química da Monocrotalina ______________________________ 32 Figura 4 - Conversão enzimática de alcaloides pirrolizidínicos em metabólitos tóxicos in vivo. _____________________________________________________________ 35 Figura 5 - Mecanismo de interação do DHPAkl com nucleófilos________________ 35 Figura 6 - Esquema típico de virtual screening baseado no receptor _____________ 37 Figura 7 - Modelos de C. elegans para doenças neurodegenerativas _____________ 40 Figura 8 - Derivados da monocrotalina a partir da base nécica, a retronecina MOL1: RTN-Trp; MOL2: RTN-His; MOL3: RTN-Gln; MOL4: RTN-Phe; MOL5: RTN-Pro ___________________________________________________________________ 52 Figura 9 – pKa e logP da Galantamina (literatura) e das moléculas propostas (predição em MarvinSketch). ____________________________________________________ 56 Figura 10 - Cromatografia em camada delgada do composto cristalino isolado de C. retusa. (a) placa revelada com Vanilina sulfúrica (b) placa revelada com Dragendorff. 58 Figura 11 – Mecanismos reacionais propostos para a obtenção dos derivados da
retronecina __________________________________________________________ 60 Figura 12 - Esquema reacional da hidrólise da monocrotalina _________________ 61 Figura 13 - Perfil cromatográfico das frações obtidas em coluna de alumina básica com a amostra do produto de hidrólise da MCT. (A) revelado com Dragendorff. (B) revelado com Vanilina. ________________________________________________________ 62 Figura 16 – Estrutura sugerida para os espectros provenientes da amostra F40-52 ( 400 MHz, CD3CD) _______________________________________________________ 69
Figura 17 - Estruturas químicas e massa molecular para os possíveis íons do derivado retronecina-triptofano __________________________________________________ 70 Figura 18 – Estrutura química proposta para a amostra B1RTRP-E3_____________ 75 Figura 19 - Estrutura sugerida para os espectros provenientes da amostra RT4558 _ 77 Figura 20 - Cromatograma das amostras provenientes dos comprimidos de memantina. (A) amostra hexânica após cromatografia preparativa banda 2 (B) amostra hexânica após cromatografia preparativa, banda 1 (C) amostra clorofórmica sem tratamento prévio. ______________________________________________________________ 81 Figura 21 -Espectro de massas da memantina (tr 11,28 min). __________________ 81 Figura 22 - Ensaio de paralisia com o transgênico CL2006 para Memantina
demonstrando o a porcentagem de animais sobreviventes em relação ao tempo. ____ 82 Figura 23 - Ensaio de paralisia com o transgênico CL2006 para Retronecina ______ 84 Figura 24 - Ensaio de paralisia com o transgênico CL2006 para Retronecina
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AChE Acetilcolinesterase
AINES Antiinflamatórios não esteroidais AP Alcaloides pirrolizidínicos BChE Butirilcolinesterase
CCD Cromatografia em camada delgada
CEMTDD Chinese ethnic minority traditional drug database DA Doença de alzheimer
DH Doença de Huntington
DHPAal Alcaloides dihidropirrolizidínicos DMSO Dimetilsulfóxido
DP Doença de Parkinson
EB Extrato bruto
ELA Esclerose lateral amiotrófica FDA Food and Drug Admnistration
HPLC Hight performance liquid chromatography HTS – Higth throughput screening
IAChE Inibidor da acetilcolinesterase NMDA N-methyl-d-aspartate
MCT Monocrotalina
OMS Organização Mundial de Saúde OHPAs Alcaloides pirolizidínicos hidroxilados PN Produtos naturais
RB Rendimento bruto
RMN Ressonancia magnética nuclear
RTN Retronecina RTN-Cl Retronecina clorada RTN-Trp Retronecina-triptofano RTN-His Retronecina-histidina RTN-Gln Retronecina-glutamina RTN-Phe Retronecina-fenilalanina RTN-Pro Retronecina-prolina RTN-TsCl Retronecina tosilada SAR Solução aquosa residual TCM Traditional chinese medicine
TCMID traditional Chinese medicine integrative database THF Tetrahidrofurano
TsCl Cloreto de tosila
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Resultado do screnning virtual para os 5 derivados propostos. _________ 54 Tabela 2 - Comparação entre os dados de RMN ¹³C e ¹H obtidos entre o o alcaloide isolado de C. retusa com dados da literatura para a monocrotalina (400 MHz, CDCl3) 59
Tabela 3 - Comparação entre os dados de RMN ¹³C e ¹H obtidos entre o produto da hidrólise da monocrotalina com dados da literatura para a retronecina. (400 MHz, CD3OD) ____________________________________________________________ 63
Tabela 4 - Comparação entre os dados de RMN ¹H obtidos entre o produto da halogenação da retronecina com dados da literatura para a retronecina-Cl (300 MHz, CDCl3) _____________________________________________________________ 66
Tabela 5 - Comparação entre os dados experimentais (400 MHz, CD3OD) de ¹H
obtidos entre o produto da esterificação com dados da literatura para o éster da
fenilalanina __________________________________________________________ 72 Tabela 6 - Comparação entre os dados experimentais (400 MHz, CD3OD) de ¹H
obtidos entre o produto da esterificação com dados da literatura para o éster do
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ___________________________________________________ 16 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA _____________________________________ 19 2.1. DEMÊNCIA _______________________________________________________ 19 2.1.1. Demência e Alzheimer: aspectos gerais _______________________________ 19 2.1.2. A fisiopatologia da DA ____________________________________________ 20 2.1.3. Tratamento da DA _______________________________________________ 23 2.2. PRODUTOS NATURAIS E SUA IMPORTÂNCIA COMO FONTE DE NOVOS FÁRMACOS __ 26 2.3. O GÊNERO CROTALARIA ______________________________________________ 28 2.3.1. Aspectos botânicos _______________________________________________ 29 2.4. ALCALOIDES PIRROLIZIDÍNICOS _______________________________________ 30 2.4.1. Aspectos gerais __________________________________________________ 30 2.4.2. Aspectos químicos _______________________________________________ 30 2.4.3. Aspectos farmacológicos __________________________________________ 33 2.4.4. Aspectos toxicológicos ____________________________________________ 34 2.5. QUÍMICA COMPUTACIONAL COMO UMA FERRAMENTA AUXILIAR NO
DESENVOLVIMENTO DE NOVOS FÁRMACOS __________________________________ 36 2.6. O NEMATODO CAENORHABDITIS ELEGANS _______________________________ 39 3. OBJETIVOS ______________________________________________________ 43 3.1. OBJETIVO GERAL __________________________________________________ 43 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS _____________________________________________ 43 4. METODOLOGIAS ________________________________________________ 44 4.1. MATERIAL VEGETAL ________________________________________________ 44 4.2. EXTRAÇÃO DOS ALCALOIDES _________________________________________ 44 4.2.1. Maceração _____________________________________________________ 44 4.2.2. Partição líquido-líquido ___________________________________________ 44 4.3. HIDRÓLISE DA MONOCROTALINA (MCT) ________________________________ 45 4.4. SCREENING VIRTUAL DOS DERIVADOS DA RETRONECINA ____________________ 45
4.5. SUBSTITUIÇÃO DA HIDROXILA PRIMÁRIA DA RETRONECINA POR GRUPO
ABANDONADOR _______________________________________________________ 45 4.5.1. Tosilação da retronecina em THF ___________________________________ 45 4.5.2. Tosilação da retronecina em piridina ________________________________ 46 4.5.3. Halogenação da retronecina _______________________________________ 46 4.6. REAÇÕES DE CONDENSAÇÃO DA RETRONECINA COM L-ALFA-AMINOÁCIDOS _____ 47 4.6.1. Proposta reacional 1: tosilação e reação in situ ________________________ 47 4.6.2. Proposta reacional 2 e 3: solvente polar prótico e salinização dos aminoácidos com KOH e NaHCO3 __________________________________________________ 47
4.6.3. Proposta reacional 4: reação em piridina _____________________________ 48 4.6.4. Proposta reacional 5: esterificação previa dos aminoácidos; adição de
catalisador; em piridina ________________________________________________ 48 4.7. CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DAS MOLÉCULAS _________________________ 50 4.6.1 Ressonância Magnética Nuclear _____________________________________ 50 4.8. ISOLAMENTOECARACTERIZAÇÃODAMEMANTINA ______________ 50 4.8.1. Extração e isolamento da memantina ________________________________ 50
4.8.2. Identificação da memantina ________________________________________ 50 4.9. TESTE DE ATIVIDADE BIOLÓGICA EM CAENORHABDITIS ELEGANS ______________ 51 4.9.1. Ensaio de paralisia _______________________________________________ 51 5.1. SCREENINGVIRTUALESELEÇÃODOALVOBIOLÓGICO ____________ 52 5.2. OBTENÇÃODASMOLÉCULASDEINTERESSE ______________________ 57 5.2.1 Extração e isolamento do alcaloide monocrotalina ______________________ 57 5.3. OBTENÇÃO DOS DERIVADOS SEMI-SINTÉTICOS ____________________________ 60 5.3.1. Etapa 1: hidrólise da monocrotalina(MCT) ____________________________ 61 5.3.2. Etapa 2: Substituição da hidroxila no C9 da retronecina (RTN) por melhor grupo abandonador _________________________________________________________ 64 5.3.3. Etapa 3: obtenção dos derivados ____________________________________ 67 5.3.3.1. Propostas reacionais 2 e 3 ________________________________________ 67 5.3.3.2. Proposta reacional 4_____________________________________________ 70 5.3.3.3. Proposta reacional 5_____________________________________________ 71 5.3.3.4. Proposta reacional 6_____________________________________________ 76 5.3.3.5. Justificativas possíveis para a não ocorrência das reações _______________ 77 5.3TESTESBIOLÓGICOS _____________________________________________ 80 5.3.4. Obtenção da memantina, padrão para os testes em Caenorhabditis
elegans ______________________________________________________________80 5.4. AVALIAÇÃODAATIVIDADE INVIVO NOMODELO CAENORHABDITIS.
ELEGANS PARAADOENÇADEALZHEIMER _____________________________ 82
5.4.1. Avaliação da atividade da Memantina ________________________________ 82 5.4.2. Avaliação da atividade das moléculas obtidas a partir da monocrotalina ____ 83 6. CONCLUSÃO ___________________________________________________ 87 7. REFERENCIAS _________________________________________________ 88 ANEXO I – ESPECTROS DE RMN E MASSAS ___________________________ 1 ANEXO II – ARTIGO PARA SUBMISSÃO À PLOSONE ___________________ 1
16 1. INTRODUÇÃO
A DA é a causa mais comum de demência e engloba cerca de 60% a 80% dos casos. O sintoma mais comum se inicia com a gradual perda da memória e a capacidade de lembrar novas informações. Esses sintomas ocorrem porque os primeiros neurônios a perderem a função ou morrer estão localizados em regiões cerebrais envolvidas na formação de novas memórias (ALZHEIMER'S ASSOCIATION, 2013). Atualmente, sabe-se que 46,8 milhões de pessoas em todo o mundo vivem com demência. Estima-se que esse número duplique nos próximos 20 anos. Em 2050 esse número poderá chegar a 132,5 milhões de pessoas. O custo total com tratamento da demência no mundo em 2015 foi de US$ 818 milhões. Espera-se que em 2018 os custos diretos e indiretos cheguem a 1 trilhão de dólares e em 2030 esse valor poderá atingir 2 trilhões de dólares (PRINCE et al., 2015).
Os primeiros medicamentos utilizados para o tratamento da DA tem como mecanismo de ação a inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE) buscando aumentar a quantidade de acetilcolina disponível no SNC, a qual está diminuída na DA. Até então, quatro inibidores da enzima acetilcolinesterase (IAChE) foram aprovados para o tratamento da DA moderada: tacrina, donepezil, rivistigmina e galantamina (BELVOIR; HOSPITAL, 2013). Esses fármacos são alcaloides em sua forma natural ou derivados semi-sintéticos dessa classe de metabólitos secundários produzidos pelas plantas. Uma outra opção terapêutica para tratar a DA moderada e grave é a memantina, este fármaco é um antagonista não competitivo, com moderada afinidade aos receptores NMDA. Acredita-se que ele protege os neurônios da excitotoxicidade. Uma recente meta-análise sobre a eficácia dos IAChE e memantina indica que estes tratamentos podem resultar em melhoras estatisticamente significativas (RAINA et al., 2008). Contudo, os pacientes com DA respondem marginalmente e por um breve período aos fármacos atualmente disponíveis (BLOOM, 2014). Isso ocorre porque o tratamento é baseado na “hipótese colinérgica” da DA que propõe uma grave perda da função colinérgica e estaria associada com os sintomas cognitivos (BARTUS et al., 1982). Contudo, a patogênese, genética, biologia e biomarcadores mostram a importância do peptídeo βA no desenvolvimento da DA. As placas amiloides compostas principalmente de agregados de βA e emaranhados neurofibrilares compostos por associações de microtúbulos da proteína tau, são critérios de diagnóstico para a DA (GOURAS; OLSSON; HANSSON, 2015). Além disso, alguns estudos científicos mostram que a formação de agregados
17 neurofibrilares da porteína tau dependem do peptideo βA (BLOOM, 2014; GÖTZ et al., 2001; GOURAS; OLSSON; HANSSON, 2015; LEWIS et al., 2001). Isto demonstra a importância do peptideo βA como alvo para o tratamento da DA.
Apesar da DA não ter seu mecanismo totalmente elucidado, vários progressos possibilitaram a indentificação de novos alvos para o tratamento da doença. Devido às novas descobertas na patogênese da doença, os novos tratamentos destinam-se a impedir o curso da doença em sua fase inicial. Esta nova abordagem é chamada de “fármacos modificadores da doença”, onde se incluem vacinação com peptideo βA, inibidores da secretase, drogas para reduzir as taxas de colesterol, agentes quelantes de metal e agentes antiinflamatórios (SCARPINI; SCHELTERNS; FELDMAN, 2003; SELKOE, 2001).
Caenorhabditis elegans é um modelo biológico amplamente utilizado para estudar doenças e testar a eficiência de medicamentos, há diversos trabalhos que utilizam esse modelo para investigar: longevidade (SOLIS; PETRASCHECK, 2011), doenças neuromusculares (GAUD et al., 2004; GIACOMOTTO et al., 2012), neurociências (CALAHORRO, 2014), obesidade (ZHENG, J. , GREENWAY, 2012), desordens metabólicas (HASHMI et al., 2013) entre outras patologias. Para estudar a DA modelos transgênicos de C. elegans são utilizados desde 1995 (LINK, 1995). Esses modelos biológicos têm sido utilizados tanto para estudar os mecanismos de toxicidade da doença (LINK, 2006), bem como os genes envolvidos no seu desenvolvimento (LINK et al., 2003). Existem poucos trabalhos que utilizam modelos trangênicos de C. elegans para avaliar a atividade de alcaloides, como exemplos tem-se os estudos de Xin e seus colaboradores (2013), com alcaloides benzilfenetilamina isolados de Lycoris radiata e de Arya e colaboradores (2009), com estudos sobre o alcaloide indólico reserpina. Os alcaloides já são importantes para o tratamento da DA como inibidores da enzima AChE, e diversos trabalhos científicos reforçam o potencial e a importância dessa classe de metabólitos como IAChE (KONRATH et al., 2013; LÓPEZ et al., 2002; ORTEGA; AGNESE; CABRERA, 2004; PAGLIOSA et al., 2010).
Baseado nesse contexto, o presente trabalho visa desenvolver, através da síntese racional, novas moléculas a partir da MCT, com potencial biológico contra alvos relacionados à DA no modelo trangênicos CL2006 de C. elegans. Assim, espera-se que os resultados contribuam para que futuramente os custos do tratamento sejam
18 minimizados, os efeitos adversos reduzidos e haja melhora da qualidade de vida dos portadores da doença, bem como dos seus familiares.
19 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. DEMÊNCIA
2.1.1. Demência e Alzheimer: aspectos gerais
Demência é o termo usado para descrever uma variedade de doenças e condições quando células do sistema nervoso, os neurônios, morrem ou param de funcionar normalmente. Trata-se de uma síndrome caracterizada por perturbação de múltiplas funções cerebrais, incluindo memória, pensamento, orientação, compreensão, cálculo, capacidade de aprendizagem, linguagem e julgamento. As deficiências da função cognitiva são comumente acompanhadas, e ocasionalmente precedidas, pela deterioração do controle emocional, comportamento social ou motivação. Esses fatores são ocasionados pela morte dos neurônios ou seu mal funcionamento. A DA é a forma mais comum de demência e engloba cerca de 60-79% de todos os casos. Na DA as alterações cerebrais, quando avançadas, podem prejudicar a capacidade de um indivíduo realizar atividades básicas como caminhar e engolir. Nesta fase a DA é fatal (ALZHEIMER´S ASSOCIATION, 2013; DUTHEY, 2013; PRINCE; JACKSON, 2009).
A prevalência etária da DA varia pouco entre as regiões do mundo, sendo que a grande maioria dos acometidos são idosos com idade acima de 60 anos. Em uma estimativa feita em 2015 46,8 milhões de pessoas viviam com demência e espera-se que esse número quase duplique nos próximos 20 anos. Para 2030 espera-se que 74,7 milhões de pessoas sejam acometidas pela doença e em 2050 esse número poderá chegar a 132,5 milhões de indivíduos. O continente com o maior número de casos de demência é a Ásia (22,9 milhões), seguida da Europa (10,5 milhões), Américas (9,4 milhões) e África (4 milhões). Há uma tendência no aumento da expectativa de vida nos próximos anos em todo o mundo, no entanto grande parte dos novos casos ocorrerão em países de renda mediana, sendo que na atualidade, 58% das pessoas com DA vivem nesses países, mas em 2050 serão 68% (PRINCE et al., 2013, 2015). Na América Latina 4,6% da população com idade acima de 60 anos apresentavam algum tipo de demência no ano 2000, isso correspondia a 1,8 milhões dos casos de demência no mundo, em 2040 esse número vai aumentar para 9,1 milhões de casos. A América do Sul fica atrás apenas da China, Europa e América do Norte (BALLARD et al., 2011).
20 A DA é uma doença de progressão lenta e em estágio avançado traz grandes limitações para o portador. Devido a esses dois fatores os custos com o tratamento da DA são muito elevados. Tais custos são divididos em três subcategorias: custos com o tratamento medicamentoso (19,5%), com cuidados médico-hospitalar (40,1%) e custos com cuidados informais (40,4%). Este último é, geralmente, efetuado por familiares e compreende uma grande parcela do total dos custos, e é quantificado com base no tempo perdido com a dedicação com o paciente e redução na produtividade. Assim como o número de novos casos os custos globais com o tratamento da DA também aumentam a cada ano. Em 2010 os o valor foi de 604 milhões de dólares, em 2015 esse valor ultrapassou 817,9 milhões e em 2030 esse valor pode ultrapassar o montante de 2 trilhões de dólares (PRINCE et al., 2013, 2015; WIMO et al., 2013). Apenas nos EUA o percentual de pessoas com demência em 2010 era de 14,7% com custos que variavam de $42,746 a $69,843 dólares por ano. Esses custos individuais sugerem que o custo monetário da demência em 2010 nos EUA ficou entre $157 bilhões e $215 bilhões sendo 11 bilhões correspondente apenas a medicamentos. Esses dados mostram que os custos com o tratamento da demência é comparável àqueles efetuados com doenças cardiovasculares e câncer (HURD et al., 2013).
2.1.2. A fisiopatologia da DA
A fisiopatologia da DA está relacionada com a lesão e morte dos neurônios, iniciando na região do cérebro denominada hipocampo, que por sua vez está envolvida com a formação da memória e o aprendizado (SHAFFER et al., 2013). O desenvolvimento e progressão da DA estão associados à disfunção colinérgica, formação de placas amiloides e hiperfosforilação da proteína tau (BARTUS et al., 1982; BLOOM, 2014; GOURAS; OLSSON; HANSSON, 2015). A assinatura histopatológica da DA são as placas senis formadas pelo peptídeo βA e os emaranhados neurofiblilares da proteína tau. Existem diversas doenças neurológicas em que há emaranhados neurofibrilares da proteína tau, tais como doença de pick, Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, gliose subcortical progressiva, DA e muitas outras que são descritas como taupatias, no entanto na DA foi observado que a presença das placas senis do peptídeo βA, estimulam a formação dos emaranhados neurofibrilares da proteína tau (BLOOM, 2014; GOEDERT; KLUG, 1999; GÖTZ et al., 2001). O tempo necessário para o desenvolvimento das placas neuríticas é desconhecido, mas essas lesões provavelmente
21 evoluem muito gradualmente ao longo de um período substancial de tempo, talvez muitos meses ou anos (SELKOE, 2001).
O peptídeo βA é um peptídeo curto (42 a 43 aminoácidos em cadeia) proveniente da quebra proteolítica anormal da proteína transmembranar PPA (proteína precursora amiloide), ele é clivado primeiramente pela β-secretase e em seguida pela γ-secretase. Sua função ainda não é clara, no entanto a produção e secreção do βA são estimuladas pela atividade sináptica, a função mais singular e normal do sistema nervoso, assim a produção desse peptídeo não é inerentemente tóxica e pode, até, ter uma função fisiológica, e acredita-se que o mesmo está envolvido no desenvolvimento neural. Os monômeros β-amiloide são solúveis, porém em concentrações elevadas sofrem alterações conformacionais para formar uma estrutura terciária rica em folhas beta que se agregam para formar fibrilas amiloides. Essas fibrilas se depositam sobre os neurônios em formações densas conhecidas como placas senis ou placas neuríticas. Elas podem se depositar também em vasos sanguíneos no cérebro, em um processo chamado de angiopatia amiloide ou angiopatia congófila. Na DA a agregação anormal da proteína tau, uma proteína associada a formação e estabilização de microtúbulos expressa em neurônios, também é observada. A proteína tau atua na estabilização dos microtúbulos no citoesqueleto celular. Como a maioria das proteínas associadas a microtúbulos, tau é ativada por meio de fosforilação, e em pacientes com DA tau está hiperfosforilada (P-tau), e se acumula como filamentos helicoidais emparelhados que se agregam formando massas no interior das células nervosas formando estruturas conhecidas como emaranhados neurofibrilares ou como neurite distrófica quando associado ao peptídeo βA (GOEDERT; KLUG, 1999; GOURAS; OLSSON; HANSSON, 2015; HERRMANN et al., 2011). Além disso, há uma associação direta entre a presença do peptídeo βA e o aumento da fosforilação e toxicidade da proteína tau, esta última atua também no peptídeo βA por um mecanismo de retroalimentação (BLOOM, 2014). A influência da presença do peptídeo βA sobre a toxicidade da proteína tau já havia sido relatada por Götz e seus colaboradores (2001). Em seus estudos eles mostraram que a injeção de peptídeo βA nos cérebros de ratos transgênicos (P301L) originou aumento em cinco vezes de emaranhados neurofibrilares (GÖTZ et al., 2001). Outro achado muito importante foi relatado por Tan e seus colaboradores (1999). Eles observaram que ao tratar células da micróglia com o peptídeo βA (500 nanomolar) ocorreu o aumento da expressão de CD40 nas mesmas. Observaram também que ocorreu o aumento do fator
22 de necrose tumoral alfa e injúria neural quando essas células estimuladas pelo peptídeo foram tratadas com CD40 ligante (CD40L) mostrando que o peptídeo βA também tem papel importante no processo inflamatório da DA (TAN et al, 1999). A associação da presença do peptídeo βA com a estimulação da fosforilação a proteína tau, e com a inflamação e injúria neural, mostra a importância desse alvo para o desenvolvimento de novos fármacos contra a DA.
Outro aspecto importante da fisiopatologia da DA está relacionado com o sistema de neurotransmissores. Embora existam controvérsias sobre o sistema de neurotransmissores mais afetado com o envelhecimento, um dos achados neuroquímicos mais consistentes no cérebro humano envelhecido é que a atividade da colina acetiltransferase (CAT) é marcadamente mais reduzida nos cérebros de pacientes com a DA quando comparada com os controles pareados da mesma idade (BARTUS et al., 1982). Esse déficit na transmissão colinérgica central por degeneração dos núcleos basais do prosenséfalo é uma importante característica patológica e neuroquímica da DA. Também é descrita uma perda progressiva de receptores nicotínicos e muscarínicos ao longo do curso da doença e há evidências de que a redução desses receptores está relacionada com problemas de memória e cognição (SCARPINI; SCHELTERNS; FELDMAN, 2003). Outro fato importante mostrado por Itoh e seus colaboradores (1999) é que a sinalização nicotínica foi prejudicada em ratos infundidos com o peptídeo βA. Além disso, o potencial de longo prazo (PLP) também foi bloqueado nos ratos infundidos, o que pode estar associado ao bloqueio dos receptores nicotínicos (nAChR) pelo peptídeo βA (ITOH et al., 1999). Outro importante achado foi feito por Wang e seus coloboradores (2000). Eles reportaram que o peptideo βA, mais especificamente o fragmento 1-42 bloqueia o α7 nAChR. A ligação de βA inibe o influxo de cálcio em α7 nAChR cálcio dependente o que poderia explicar o déficit cognitivo da DA (WANG et al., 2000).
A partir dessas informações, pode-se perceber que a DA é uma doença de fisiopatologia complexa, e que um bom fármaco teria que atuar em mais de um alvo para uma melhor eficiência.
23 2.1.3. Tratamento da DA
Os mecanismos patogênicos propostos para DA geralmente compõem a base para as tentativas atuais de intervenção terapêutica. Estes incluem a perda de função colinérgica (terapia de reposição colinérgica e neurotropinas), estresse oxidativo (terapia antioxidante), cascata amiloide (vacina βA, efetores da banda γ-secretase, estatinas), mediadores inflamatórios (AINES), deficiências de hormônio esteroide (terapia de reposição hormonal), excitotoxicidade (memantina) e o papel dos fatores dietéticos (dietas com baixo teor de gorduras saturadas, consumo moderado de álcool) (SHAH, et al., 2008).
Para a perda da função colinérgica precursores da acetilcolina, tais como a colina e lecitina são ineficientes, pois eles não aumentam a atividade colinérgica central. Os agonistas dos receptores colinérgicos pós-sinápticos tiveram efeitos adversos inaceitáveis os tornando inviáveis. Já os inibidores colinesterásicos têm apresentado efeitos animadores, pois eles aumentam a atividade colinérgica por inibir a enzima responsável pela degradação da acetilcolina. Os fármacos desta classe diferem apenas em relação ao tipo de ligação com a enzima (reversível e pseudo-irreversível) e especificidade (acetilcolinesterase e butiril colinesterase), ou seja, eles diferem apenas quanto à farmacocinética (MAYEUX, 1999).
Os anticolinesterásicos atualmente utilizados para o tratamento da DA são donepezil, rivastigmina e galantamina. Donepezil interage de forma reversível e não competitiva com a enzima AChE e tem seletividade pela mesma. Há evidência que indicam que Donepezil atua contra a toxicidade do glutamato, previne a morte celular, aumenta a expressão de receptores nicotínicos e reduz a produção de βA. A Rivastigmina é inibidor pseudo-irreversível, pois sua atividade persiste mesmo quando seus níveis plasmáticos caem. Ela tem seletividade maior pela AChE, mas também inibe a BChE. A Galantamina é um alcaloide terciário, esta atua como um inibidor reversível e competitivo, no entanto, além disso ela modula alostericamente receptores nicotínicos melhorando a transmissão colinérgica (HERRMANN et al., 2011)
Essa classe de fármacos têm apresentado efeitos benéficos sobre os sintomas cognitivos, funcionais e comportamentais da doença, no entanto o seu papel na
24 patogênese da DA não é totalmente conhecido. (SCARPINI; SCHELTERNS; FELDMAN, 2003).
As abordagens para peptídeo βA são basicamente impedir sua formação, por meio da inibição da β-secretase e γ-secretase ou ativação da α-secretase, isto é impedir sua agregação, ou facilitar a remoção do peptídeo (depuração). Apesar do foco substancial das pesquisas na cascata amiloide, nenhum fármaco anti-amiloide foi aprovado pelo FDA até o presente momento, no entanto há vários em fase de teste, como, por exemplo, Babineuzumab, Solaneuzumab, Latrepirdina e epigalocatequina, além de antidiabéticos da classe das tiazolidinadiona (HERRMANN et al., 2011).
Uma abordagem terapêutica para a DA é a vacinação. Schenk e colaboradores (1999) reportaram uma redução notável de depósitos cortical de βA em ratos transgênicos, após vacinação com fibrilas do peptídeo βA1-42 humano. Os animais foram
vacinados mensalmente por 11 meses. Os dados do trabalho mostraram uma prevenção quase que total da deposição βA em ratos com 6 semanas de idade e uma redução na progressão da DA em ratos velhos. Essa evidência foi associada com o aumento de anticorpos anti-βA. Resultados semelhantes foram observados em outros trabalhos (BARD, et al. 2000; SHENK, et al 1999; WEINER, et al, 1995).
Outra forma de impedir a formação das placas amiloides é impedir a agregação dos peptídeos βA. Soto e seus colaboradores (2001) projetaram peptídeos sintéticos curtos que impediam a estabilização dos agregados fibrilares (SOTO, 2001). O mesmo grupo mostrou uma redução dos agregados amiloides em ratos transgênicos que sobreproduziam APP (amyloid precursor protein) que foram tratados com um peptídeo de 5 resíduos (PERMANNE, et al., 2002)
A inflamação associada à placa local com microglia ativada, astrócitos reativos, citocinas e componentes do complemento é uma característica patológica da DA. As citocinas pró-inflamatórias e os fatores neurotóxicos podem contribuir para a neurodegeneração e os fármacos antiinflamatórios não esteroides podem reduzir as respostas inflamatórias nas placas através da inibição da ciclo-oxigenase e ter efeitos diretos sobre o processo amiloide (SCARPINI; SCHELTERNS; FELDMAN, 2003). No trabalho de Weggen e colaboradores (2001) foi verificado que o ibuprofeno,
25 indometacina e sulindaco (mas não outros AINES) diminuíram a produção de βA1-42 em
diferentes tipos de culturas que superexpressavam a APP (WEGGEN, et al, 2001) O estresse oxidativo tem uma função importante no desenvolvimento da DA. Isso porque o cérebro é o órgão mais vulnerável ao estresse oxidativo devido à alta atividade celular dos neurônios, a presença de ácidos graxos polinsaturados e aos baixos níveis de glutationa. Muitos componentes dos neurônios podem ser oxidados, tais como proteínas, lipídios e ácidos nucleicos. Essa oxidação pode ocorrer por diversos motivos, dentre os quais se destacam a disfunção mitocondrial, aumento do nível de metais, hiperfosforilação da proteína tau, inflamação e a própria deposição do peptídeo βA (CHEN; ZHONG, 2014).
Baseado nisso, o tratamento com antioxidantes parece interessante. Ensaios in vitro e em modelos animais parecem promissores, contudo o sucesso em ensaios clínicos não é observado, e isso está relacionado com a complexidade do sistema redox in vivo, a falta de alvos antioxidantes específicos e a dificuldade de carreamento do antioxidante ao local onde são necessários, pois eles precisariam atravessar a barreira hematoencefálica, por essa razão abordagens com nanoformulações vêm sendo abordadas. Outro fator a ser considerado é que o estresse oxidativo é um processo generalizado que não possui um alvo como um receptor ou uma via metabólica específica, ou seja, existem várias formas de radicais livres serem gerados e vários tipos de ação antioxidante. Na DA há uma interconexão bem estabelecida entre estresse oxidativo e outros eventos chaves da doença, o que amplia a complexidade do desenvolvimento de um fármaco antioxidante (ROSINI et al., 2013).
A abordagem mais recente para o tratamento da DA foi a memantina, que foi o último fármaco aprovado pelo FDA para a doença. Este fármaco atua como um bloqueador dos canais NMDA e é indicado para quadros avançados da doença (SCARPINI; SCHELTERNS; FELDMAN, 2003).
Outros fármacos vêm sendo empregados na clínica para tratar os sintomas neuropsiquiátricos da demência, como antipisicóticos típicos, atípicos e antidepressivos. No entanto, de acordo com a revisão feita por Sink e colaboradores (2005) onde foram avaliados vários tipos de ensaios clínicos esses tratamentos não foram efetivos, apenas os IAChE mostraram resultados satisfatórios (SINK, 2005). A complexidade no
26 desenvolvimento de um fármaco para tratar a DA está relacionada com as diversas vias da fisiopatologia da doença e a relação que ocorre entre as mesmas.
2.2. PRODUTOS NATURAIS E SUA IMPORTÂNCIA COMO FONTE DE NOVOS FÁRMACOS
A natureza é uma fonte de um número considerável de produtos naturais (PN), com uma quase infinita variedade estrutural. PN geralmente refere-se a produtos processados ou derivados de organismos vivos, incluindo plantas, animais, insetos, microrganismos e organismos marinhos (LIU, 2011). Eles têm grande importância na sociedade como produtos farmacêuticos sob a forma de fitoterápicos, nutracêuticos ou mesmo cosmecêuticos para melhoria da saúde (BOHLIN et al., 2010). Os antibióticos (penicilinas, cefalosporinas), antiinflamatórios esteroides, analgésicos potentes (morfina), hormônios esteroides (Andrógenos e estrógenos), prostaglandinas, cardiotônicos e muitos outros isolados de produtos naturais, atestam a importância e o poder que eles têm para melhorar a sociedade e contribuir com a melhoria de todos ( MOLINSKI, 2014; RISHTON, 2008). Vale salientar que as substâncias de origem natural foram fundamentais para a formação da indústria farmacêutica moderna (RISHTON, 2008), e podem continuar contribuindo, pois há mais de 300 mil espécies de plantas e mais de um milhão de espécies de microrganismos, insetos e organismos marinhos na natureza, que continuam a ser um reservatório inigualável de diversidade biológica e química (BOHLIN et al., 2010). Várias razões podem explicar o sucesso de produtos naturais na descoberta de novos fármacos: sua diversidade química inigualável, os efeitos da pressão evolutiva para criar moléculas biologicamente ativas, bem como a semelhança estrutural dos alvos proteicos entre muitas espécies e assim por diante (HARVEY 2004). O processo de descoberta e desenvolvimento de novos fármacos, em especial aquelas derivadas de produtos naturais têm evoluído significativamente nos últimos 30 anos em abordagens cada vez mais estereotipadas (AMIRKIA; HEINRICH, 2014).
As plantas representam uma importante fonte de entidades químicas bioativas, considerando a grande diversidade de moléculas com potencial medicinal, e podem contribuir efetivamente na busca de novos fármacos, medicamentos semi-sintéticos ou de compostos de partida para a síntese de medicamentos (COWAN, 1999; YUNES; CALIXTO, 2001; ANTHONY et al., 2005; GILANI; RAHMAN, 2005). É bem
27 conhecido que, nas plantas, os produtos naturais são biossintetizados por um número pequeno de rotas metabólicas: A via do acetato, a via do mevalonato, uma via ligada ao ciclo de Krebs, alguns derivados de aminoácidos, outra via ligada aos açúcares do ciclo de Calvin e a rota do chiquimato (KAPLAM, 1991). Essas moléculas têm, frequentemente, funções específicas e muitas delas apresentam atividades biológicas que podem ser úteis para os seres humanos. Antes do desenvolvimento da medicina moderna os produtos naturais foram a única terapia disponível (QUEIROZ et al., 2012). Relatos arqueológicos e históricos mostram que pessoas em toda Ásia, Europa e África usavam plantas contendo alcaloides em 2000 a.C. (ANISEWSKI, 2015).
Dados da organização mundial de saúde (OMS) mostram que 25% dos medicamentos modernos são feitos a partir de plantas que foram primeiro utilizadas tradicionalmente. Exemplos incluem atropina, morfina, quinina, efedrina, varfarina, aspirina, digoxina, vincristina, taxol e hioscina (LIU, 2011). Dos 1355 novos medicamentos aprovados entre 1981-2010, 4% foram derivados de produtos naturais sem modificações estruturais, 22% foram derivados de produtos naturais por meio de semi-síntese, 24% foram de síntese total, porém tendo algum tipo de ligação com moléculas de origem natural, e 29% foram exclusivamente de fonte sintética, 15% foram produtos biológicos e 6% foram vacinas. Neste estudo também evidenciou-se que 68,4% de todos os fármacos registrados entre 1940-2010 utilizados no tratamento do câncer apresentavam algum tipo de relação com produtos naturais, sendo que deste total 13% eram totalmente de origem natural sem modificações, 28% eram derivados de produtos naturais por semi-síntese, 8,4% eram sintéticos, porém baseado em nucleosídeos e peptídeos miméticos, 10% eram sintéticos, porém moléculas existentes em produtos naturais, e 9% eram sintéticos que mimetizam produtos naturais (NEWMANN; CRAGG,2012).
As fontes naturais já provaram sua importância como fonte de moléculas com potencial terapêutico e ainda representam uma ilimitada fonte de moléculas ativas. Apesar disso a indústria farmacêutica tem focado suas pesquisas em bibliotecas de moléculas sintéticas como fonte de descobrimento de fármacos, e isso está relacionado com a compatibilidade dessas bases de dados com o método de triagem de fármacos já bem estabelecido, o high thoughput screening (HTS), e ao fato de que alguns compostos ativos isolados de fontes naturais são obtidos em pequenas quantidades, o que impossibilitaria o atendimento da demanda. Contudo, há novas abordagens
28 biotecnológicas que podem auxiliar no aumento da produção de compostos ativos, além da possibilidade da síntese orgânica total. Apesar de o HTS funcionar muito bem, houve um declínio no número de medicamentos atingindo o mercado, o que renovou o interesse por moléculas obtidas a partir de fontes naturais (ATANASOV et al., 2015).
Atualmente há muitas bases de dados específicas para o rastreio de produtos naturais bioativos como TCM Database@Taiwan, Traditional Chinese Medicine Integrative Database (TCMID), Chinese Ethnic Minority Traditional Drug Database (CEMTDD), SuperToxic e SuperNatural, sendo que a TCM database@taiwan é a mais completa em termos de informações, como estrutura 2D e 3D de moléculas, suas fontes, suas atividades biológicas e etc, o que facilita a triagem de novos fármacos de fontes naturais e podem ser englobados pela indústria (XIE et al., 2015).
Apesar da redução do interesse pela indústria por PN na última década, um total de 19 novas moléculas obtidas a partir de produtos naturais foram aprovadas pelo FDA entre 2005-2010 como novos fármacos, sendo que 7 são classificadas como PNs, 10 como PNs semi-sintéticos e 2 como derivados de produtos naturais, onde 4 são analgésicos, 5 antimicrobianos, 1 antiparasitário, 1 para cirurgia cardiovascular, 1 para déficit de atenção, 1 antifúngico, 1 para diabetes, 5 antitumorais. Além disso, o grande número de compostos derivados de PN em vários estágios de desenvolvimento clínico indica que os PN ainda são uma valiosa fonte de novos candidatos a drogas. Outro fato importante é que os pontos fortes dos PN são para doenças oncológicas e infecciosas, isto é, problemas de saúde graves (MISHRA; TIWARI, 2011). Baseado nesse contexto pode-se ter a certeza de que os PN permanecem como um campo vasto para exploração de moléculas de interesse médico.
2.3. O GÊNERO CROTALARIA
Plantas do gênero Crotalaria pertencem à família Fabaceae (Leguminosae) com mais de seiscentas espécies e crescem abundantemente em zonas tropicais e subtropicais sendo numerosas na África oriental e Madagascar que são considerados os mais importantes centros da diversidade do gênero. O segundo centro importante é a Índia. Dois centros adicionais existem no Brasil e no México (PALOMINO; VASQUEZ, 1991). Essas plantas são ricas em alcaloides pirrolizidínicos (APs) que são as principais
29 toxinas derivadas de plantas que acometem humanos e animais (MATTOCKS, 1986; HUXTABLE, 1990).
Esse gênero de planta, no Brasil, recebe comumente nomes como “xique-xique”, “guizo-de-cascavel”, “chocalho-de-cascavel” e possuem vagens secas que quando tocadas se assemelham ao som emitido pela cauda da cascavel (WILLIAMS & MOLYNEUX, 1987).
Figura 1 – Frutos maduros de Crotalaria retusa
Fonte: CORONADO GONZÁLES - Retirado de trópicos.org 21/10
2.3.1. Aspectos botânicos
As espécies pertencentes ao gênero Crotalaria são plantas herbáceas com cerca de 50 cm de altitude ou arbustos com até 3 m, com folhas digitado-trifolioladas, unifolioladas ou simples; flores predominantemente amarelas; androceu formando um tubo monadelfo aberto na base com anteras dimorfas e legumes inflados. As espécies do gênero possuem considerável plasticidade, adaptando-se às diferentes condições ambientais. Podem ocorrer em variados tipos de habitats, como áreas próximas de rios, morros litorâneos, restingas, orla de matas, campos e cerrados. As espécies são oportunistas, muito comuns em locais alterados como margem de estradas e como invasoras de culturas (FLORES; MIOTTO, 2005).
30 2.4. ALCALOIDES PIRROLIZIDÍNICOS
2.4.1. Aspectos gerais
Alcaloides pirrolizidínicos (APs) têm uma distribuição restrita, mas são comumente encontrados em plantas das famílias Asteraceae (tribos Eupatorieae e Senecioneae), Boraginaceae, Fabaceae (principalmente o gênero Crotalaria) e Orchidaceae (dez gêneros). Mais de 95% dos APs já conhecidos pertencem a uma destas 4 famílias (HARTMANN & WITTE, 1995; DEWICK, 2009).
2.4.2. Aspectos químicos
APs apresentam um núcleo com dois anéis de cinco membros fundidos com um átomo de nitrogênio na posição quatro. O sistema básico do anel é um aminoálcool (necina). Os APs ocorrem geralmente como ésteres compostos pelo aminoálcool necina esterificado com diferentes ácidos carboxílicos de origem terpênica denominados ácidos nécicos (WOOD; WRIGGLESWORTH, 1968), (MATTOCKS, 1986). Os ácidos nécicos dos alcaloides pirrolizidínicos podem ter fragmentos de sua estrutura derivadas do acetato ou de aminoácidos como, valina, treonina, leucina e isoleucina. Os ácidos podem formar ligações éster em C9 e diesteres quando esterificados nas posições C7 e C9 da base necina ou um longo ciclo diester pode ligar C7 e C9 simultaneamente (MATTOCKS, 1986). Após a hidrólise obtêm-se (i) a necina, que contém o esqueleto pirrolizidina, sendo retronecina, heliotridina, plaitnecina e ontonecina as mais comumente encontradas (HARTMANN; WITTE, 1995), e (ii) o ácido nécico, que são altamente substituídos e ramificados. É importante ressaltar que os alcaloides pirrolizidinicos são encontrados nas plantas em formas polares como sais e N-óxidos para facilitar o seu transporte e acima de tudo se manter na sua forma não tóxica. Os N-óxidos podem ser convertidos a aminas terciárias por redução suave, como ocorre no intestino dos herbívoros (DEWICK, 2009).
Os APs foram inicialmente classificados de acordo com a estrutura química de sua base nécica ou apenas por ordem alfabética e, posteriormente, pelas implicações filogenéticas e taxonômicas. Nesta classificação, os APs foram distribuídos em 3 grupos: (a) ésteres monocarboxilicos alifáticos típicos da família Boraginaceae; (b) diésteres macrocíclicos, comuns nas famílias Senecioneae e Asteaceae e no gênero Crotalaria (Fabaceae); (c) ésteres de ácidos aril e alquil, típicos da família Orchidaceae.
31 Outra classificação, que inclui implicações biogenéticas, sugere a classificação de tais alcaloides em tipos: A [A1 (grupo senecionina), A2 (grupo senecivernina), A3 (grupo nemorensina) e A4 (grupo rosmarina)], B [B1 (grupo triangularina), B2 (grupo macrofilina) e B3 (grupo senanpelina), C [C1 (grupo licopsamina), C2 (grupo isolicopsamina), C3 (grupo latifolina) e C4 (grupo parsonina)], D (grupo monocrotalina), E (grupo falaenopsina, M [M1 (ésteres incomuns da necina) e M2 (derivados simples da necina)] e L (grupo lolina) (Figura 2) (HARTMANN; WITTE, 1995).
32 A MCT é o principal AP (Figura 3) encontrado em Crotalaria retusa e assim como os demais APs, ele é bastante tóxico (MATTOCKS, 1986; RIBEIRO et al., 1993; CHEEKE, 1998; HARTMANN; WITTE, 1995) quando ingerido por via oral. A instauração na posição 1,2 e a esterificação de pelo menos um grupo hidroxila com um ácido de cadeia ramificada são necessários para a toxicidade. Apesar disso, eles são produzidos em grande quantidade por algumas plantas, por isso torna-se relevante verificar o emprego dessas moléculas em medicamentos de uso tópico assim como utilizá-las como precursoras de derivados semi-sintéticos atóxicos e bioativos, conforme discutido posteriormente.
33 2.4.3. Aspectos farmacológicos
A literatura não dispõe de muitos estudos enfocando a aplicação terapêutica dos APs. Possivelmente, esse fato está relacionado à potencial toxicidade desses compostos, pois ainda que apresentem atividade biológica importante não poderiam ser utilizados por via sistêmica devido à grande toxicidade hepática, já bem relatada em diversos trabalhos (MATTOCKS, 1968, 1971, 1986; DEWICK, 2009).
Os poucos trabalhos em que a atividade farmacológica desses alcaloides é avaliada são em testes contra microrganismos. Dentre estes trabalhos está o de Devendra e colaboradores (2012). Neste trabalho foi feita uma comparação entre 3 espécies de Crotalaria quanto aos seus constituintes químicos e quanto a sua atividade contra microrganismos. O extrato etanólico de C. retusa rico em APs apresentou atividade contra Pseudomonas aeruginosa com halo de inibição de 38 mm (DEVENDRA et al., 2012). Negreiros e colaboradores (2016) testaram a atividade de derivados da monocrotalina contra o patógeno Trichomonas vaginalis bem como a atividade antimicrobiana contra cepas de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus epidermidis, além de testar a atividade antibiofilme. De acordo com seus resultados o potencial biológico das moléculas contra os patógenos foi promissor (NEGREIROS et al., 2016).
Além de bactérias, Frascescato e colaboradores (2007) avaliaram a atividade do extrato diclorometano da espécie Senecio heterotrichius contra fungos. Tal estudo evidenciou a atividade contra C. krusei e Staphylococcus aureus por meio da técnica de difusão em caldo, onde obteve-se a concentração inibitória mínima (MIC) de 0,25 mg/mL para o primeiro e 2,5 mg/mL para o segundo. As plantas do Senecio são conhecidas pela abundância em PAs (FRASCESCATO et al., 2007). Outro trabalho em que a atividade farmacológica foi testada contra microrganismos foi realizado por Singh e colaboradores (2002), eles descreveram que a fração clorofórmio e éter do extrato das partes aéreas de Heliotropium subulatum, rica em alcaloides pirrolizidínicos, apresentou atividade antimicrobiana contra Escherichia coli e Penicillium chrysogenum (SINGH et al., 2002).
Apenas Toma e colaboradores (2004) testaram a atividade do extrato das inflorescências do Senecio brasiliensis, rico em APs, in vivo. Utilizando modelo animal
34 eles verificaram que o extrato apresentou atividade anti-úlcera na concentração de 12,5 mg/Kg (TOMA et al., 2004).
2.4.4. Aspectos toxicológicos
Muitos alcaloides são conhecidos por sua expressiva toxicidade em animais e seres humanos. A maioria dos alcaloides letais são incluídos na classe das neurotoxinas, mas há outras propriedades tóxicas pela interação com alvos celulares e moleculares (WINK, 2008). Os APs são conhecidos por produzirem um pronunciado efeito hepatotóxico. A toxicidade desta classe de alcaloides está relacionada com a presença de instauração nos carbonos 1,2 do anel pirrolizidina e com uma função éster ligada à cadeia lateral. Mesmo não sendo originalmente tóxicos esses alcaloides são transformados em pirrol no fígado de mamíferos por meio de oxidades (MATTOCKS, 1968 1971, 1972; DEWICK,2009).
APs apresentam toxicidade aguda variada in vivo, mas sabe-se que eles sofrem um processo de intoxicação metabólica dividida em três etapas no fígado, fazendo com que tal órgão seja o primeiro alvo da toxicidade destas moléculas. Esse processo foi, principalmente, investigado por Mattocks (1968, 1972) e Culvenor e colaboradores (1969, 1971). Segundo tais estudos, após a absorção no organismo uma hidroxila pode ser introduzida nas posições C3 ou C8 através de uma monoxigenase no complexo do citocromo P-450 (Figuras Ia e IIb). Esses hidroxi-PAs (OHPAs) são instáveis e logo em seguida sofrem desidratação sendo convertido em alcaloide dehidropirrolizidínico (DHPAal) essa desidratação resulta em uma segunda dupla ligação na base necina seguida de um rearranjo espontâneo formando um sistema pirrólico aromático III (Figura 4) (MATTOCKS, 1968, 1972; CULVENOR et al., 1969; 1971).
Os pirróis são potentes agentes alquilantes e podem reagir com nucleófilos como ácidos nucleicos e proteínas, por exemplo (CULVENOR et al., 1969; DEWICK, 2009). Presume-se que a toxicidade ocorre devido à formação de ligações covalentes e, subsequentemente, à inativação de nucleófilos essenciais tais como proteínas e ácidos nucleicos que podem alterar suas funções na célula e levar ao dano e morte celular ou até mesmo levar à formação de tumores (HARTMANN; WITTE, 1995).
35 Figura 4 - Conversão enzimática de alcaloides pirrolizidínicos em metabólitos tóxicos in vivo.
Os N-óxidos não são transformados pela oxidases, apenas as bases livres. A presença de APs no confrei enfatizou os perigos do uso desta planta medicinal e fitoterápico com uso tradicional como anti-inflamatório, antirreumático e contra distúrbios gastrointestinais (DEWICK, 2009; WIEDENFELD, 2011a, 2011b) O III DHPAlk (Figura 5) se converte na estrutura IV, após uma descarboxilação. O ataque do nucleófilo promove a ressonância nas ligações duplas do anel promovendo outra descarboxilação no carbono 1. Essa segunda descarboxilação promove a ativação do carbono nove que é atacado por outro nucleófilo biológico, formando a estrutura VII (Figura 5).
36
Fonte: Adaptado de WIEDENFELD, 2011a
2.5. QUÍMICA COMPUTACIONAL COMO UMA FERRAMENTA AUXILIAR NO DESENVOLVIMENTO DE NOVOS FÁRMACOS
Historicamente, numerosos fármacos úteis têm sido desenvolvidos a partir de compostos isolados de plantas medicinais (LEE, 1993). Três abordagens de pesquisas sãoutilizadas no processo e desenvolvimento de novos medicamentos: (1) bioatividade e mecanismo de ação, isolamento e caracterização dos compostos ativos; (2) design racional defármacos baseado em modificações e sínteses de análogos, e (3) estudo de mecanismos deação. Outros quatro tipos de estudos ajudam a refinar a estrutura ativa: (1) Relação estrutura atividade [Structure-activity relationship (SAR)] qualitativa e quantitativa; (2) Estudos de mecanismo de ação, incluindo interação droga receptor e inibição de enzimas; (3) Estudos demetabolismo de drogas, incluindo identificação de metabólitos bioativos e bloqueio deinativação metabólica, e, finalmente, (4) estudos de modelagem molecular, incluindo a determinação tridimensional do farmacóforo. A modificação molecular tem como objetivoaumentar a atividade, diminuir a toxicidade ou melhorar outros perfis farmacológicos(DHOLWANI et al., 2008).
37 Métodos de triagem virtual têm contribuído para o desenvolvimento de novos fármacos. Eles podem ser utilizados tanto para selecionar como para excluir moléculas e estão cada vez mais robustos através de algoritmos que preveem propriedades físicoquímicas, a capacidade de penetração na barreira hematoencefálica, sinalizadores de toxicidade, viabilidade sintética, labilidade frente ao citocromo P450, entre outros. Essessistemas são conhecidos como “filtros gerais”, isto é, eles podem ser utilizados para todos osprojetos de desenvolvimento de novas drogas e exigem apenas a estrutura molecular docandidato. Se a estrutura 3D do ligante estiver disponível os métodos de docking molecular e scoring podem ser utilizados para selecionar ainda melhor o alvo (SCHNEIDER; BÖHN,2002).
No Screening virtual baseado no receptor o estudo começa com a estrutura 3D de uma proteína alvo e uma base de dados com a estrutura 3D dos ligantes. Posteriormente faz-se uma filtragem virtual seguida de Docking e Scoring para identificar os potenciais candidatos de partida. A filtragem gera um subconjunto de compostos com maior afinidade pelo alvoprevendo seu modo de ligação. Um esquema típico de um Screning virtual baseado noreceptor encontra-se na Figura 6 (GHOSH et al., 2006).
Figura 6 - Esquema típico de virtual screening baseado no receptor
38 A eficiência do uso de tal ferramenta pode ser observada, por exemplo, no trabalho deTakaia e colaboradores (2005) onde o alvo molecular escolhido foi a β-1,4-galactosiltransferase, uma enzima responsável por processos biológicos importantes nas modificações pós-traducionais das proteínas e lipídeos que influencia em diversos processos de reconhecimentos moleculares tais como de infecções, resposta imune, diferenciação celulare muitas outras comunicações intercelulares e transdução de sinal. A partir da simulação do docking 3D uma nova molécula foi proposta e sintetizada e apresentou uma forte inibição(Ki=1,86 µM) sobre a enzima (TAKAIA et al., 2005).
Yan e colaboradores (2009), também obtiveram excelentes resultados através do método. O alvo molecular escolhido pelo grupo foi a AChE e a molécula em que as modificações moleculares foram propostas foi a Huperzina A, um alcaloide já conhecido porinibir seletivamente a enzima. O resultado do teste in vitro mostrou que 9 das 13 moléculas propostas tiveram atividade maior que o próprio alcaloide, e todas foram mais potentes que o controle, a Tacrina. Foi através do uso da química computacional que o mesmo grupo pôdeaperfeiçoar a interação molécula-ligante. Os estudos da relação estrutura atividade permitiram identificar os grupos funcionais que não poderiam ser modificados na molécula,pois interagiam diretamente com a enzima, além de permitir avaliar as possíveis modificaçõesque aumentariam a interação com o ligante. Além de poder ser utilizado na triagem, o Docking também pode ser utilizado para entender o mecanismo de ação de algumas moléculas, e o porquê da maior atividade de algumas moléculas frente a outras. Foi isso que Mollica e colaboradores (MOLLICA et al., 2015) fizeram. Eles sintetizaram e testaram derivados da Probenecida como inibidores da anidrase carbônica e posteriormente fizeram o Docking dos análogos mais ativos para entender como as modificações molecularesaumentaram a atividade dos derivados. Outro exemplo clássico da importância da química computacional no desenvolvimento racional de novas moléculas é o Alisquireno, um inibidor da renina. A molécula foi desenvolvida com base na interação molécula-receptor e após 10 anos de pesquisa foi introduzida no mercado como um anti-hipertensivo (JENSEN; HEROLD; BRUNNER, 2008)
Sabe-se que vários fármacos utilizados atualmente tiveram como ponto de partida produtos naturais, sendo os alcaloides uma classe muito importante no processo de obtenção de novos fármacos, como os quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer e, ainda servem como uma fonte importante de protótipos protótipos
