5.3.4. Obtenção da memantina, padrão para os testes em Caenorhabditis
elegans
As principais alternativas farmacológicas para tratar a DA são os inibidores da enzima acetilcolinesterase e a memantina, sendo que a memantina é o medicamento de escolha para os quadros avançados da doença, onde as placas senis formadas pelo peptídeo βA estão em estágio avançado. O mecanismo de ação da memantina consiste no antagonismo dos receptores NMDA e sua principal resposta farmacológica está relacionada com a redução da excitotoxicidade nos neurônios. Devido a isso ela foi escolhida como padrão de referência na avaliação da atividade biológica no modelo CL2006 de C. elegans, a fim de comparar os efeitos da mesma com os dos derivados. A memantina foi isolada a partir de comprimidos comerciais da indústria Sandoz do lote GG5342 e validade 04/2018.
Para isolar a memantina foram realizados 2 processos: uma extração ácido-base com clorofórmio e uma extração ácido-base com hexano. A extração com clorofórmio gerou uma fração que ao ser analisada por CCD mostrou apenas dois alcaloides, mas devido ao seu rendimento e ao seu perfil cristalino esta foi analisada por UPLC-MS. A amostra hexânica apresentou 4 bandas características de alcaloides. A amostra foi submetida a isolamento por cromatografia em camada delgada preparativa a partir da
81 qual foram isoladas 2 bandas: o cromatograma da amostra B1 (Figura 21) apresentou apenas um pico, que ao ser analisado pelo espectrômetro de massas mostrou um íon com massa de 180,1747 m/z e um fragmento principal com massa de 163,1477 m/z (Figura 22). A partir destes achados podemos concluir que o produto isolado tratava-se da Memantina.
Figura 21 - Cromatograma das amostras provenientes dos comprimidos de memantina. (A) amostra hexânica após cromatografia preparativa banda 2 (B) amostra hexânica após cromatografia preparativa, banda 1 (C) amostra clorofórmica sem tratamento prévio. 2 x10 0 0.5 1
+ESI TIC Scan Frag=200.0V ALC WA.d Subtract
* 2171821533.26 * 475275600.62 * 181261183.98 2 x10 0 0.5 1
+ESI TIC Scan Frag=200.0V B1 R.d Subtract
* 1680827636.39 2 x10 0 0.5 1
+ESI TIC Scan Frag=200.0V B2 R.d Subtract
* 1945976595.14 * 1043973734.15 * 1461750053.12
* 3893010554.03 * 129702218.15
* 396746337.55
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)
1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16
Figura 22 -Espectro de massas da memantina (tr 11,28 min).
5 x10 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9
+ESI Scan (rt: 11.261 min) Frag=200.0V B1 R.d
163.1477 180.1743 107.0847 121.1003 150.1108 194.1886 250.2150 294.2423 352.3347 453.3423 479.2471 509.2878531.3359553.3183575.3589597.3451 641.3635 710.5055 Counts vs. Mass-to-Charge (m/z) 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 NH3 Chemical Formula: C12H22N+ Exact Mass: 180,1747 Chemical Formula: C12H19+ Exact Mass: 163,1481 A B C
82 5.4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IN VIVO NO MODELO
CAENORHABDITIS. ELEGANS PARA A DOENÇA DE ALZHEIMER 5.4.1. Avaliação da atividade da Memantina
A primeira etapa da avaliação da atividade biológica in vivo consistiu em verificar se o padrão, a Memantina (MNTN), iria promover o retardamento da paralisia no animal transgênico. A escolha da Memantina como padrão positivo para a avaliação do seu efeito na toxicidade promovida pelo peptídeo βA foi baseada em dois fatores: a Memantina é o único fármaco, até o momento aprovado pelo FDA, útil para os quadros avançados e severos da doença, portanto um novo candidato a fármaco deve ser, no mínimo, equivalente a este, e com um perfil de reações adversas menor, ou ser farmacologicamente superior; o outro fator foi a utilização da mesma como padrão no trabalho de Xin e colaboradores (2013).
No screening virtual realizado para os derivados da RTN, foi observado que as moléculas apresentaram a capacidade de interagir com a enzima AChE, que é um alvo importante no tratamento da DA. Além disso, outros trabalhos já mostraram a capacidade de alcaloides ou derivados semi-sintéticos destes reduzir a toxicidade promovida pelo peptídeo βA em modelos de C. elegans para a DA (ARYA; DWIVEDI; SUBRAMANIAM, 2009; HUANG et el., 2017; KHADIJAH, 2016).
No ensaio com a MNTN foi utilizada uma concentração de 10 mmol, de acordo com a literatura (XIN et al., 2013). O ensaio foi realizado em triplicata, o número total de animais analisados foi 90 sendo que os animais perdidos e mortos não entraram para os dados estatísticos e os resultados estão apresentados na Figura 23.
Figura 23 - Ensaio de paralisia com o transgênico CL2006 para Memantina demonstrando o a porcentagem de animais sobreviventes em relação ao tempo.
83 De acordo com os resultados a Memantina apresentou resultado estatístico significativo quando comparado ao controle (p<0,005). No entanto, os resultados não foram iguais àqueles encontrados por Xin e colaboradores (2013). Esse fato pode estar diretamente relacionado à forma de tratamento empregada, enquanto Xin tratava os animais adultos grávidos por apenas 24h, e no outro dia realizava o ensaio de paralisia, nós deixamos os animais crescerem no meio contento a MNTN, ou seja, um processo que dura 3 dias, e somente no quarto dia os animais eram transferidos para o meio NGM, onde seriam realizados os ensaios. Possivelmente, a performance menor da MNTN pode estar relacionada ao tempo de permanência da mesma no meio NGM, o que pode ter levado a degradação da MNTN e consequentemente redução da concentração e atividade. Ainda, a exposição prolongada pode ter apresentado algum efeito tóxico aos nematódeos. Além disso, o medelo de Alzheimer utilizado foi o CL4176, que diferentemente do modelo CL2006, não produz o peptideo βA de forma constitutiva, mas somente quando o animal é submetido ao aumento de temperatura de 16ºC para 20ºC. Apesar da diferença dos modelos e da forma de tratamento, a Memantina mostrou superioridade em relação ao controle não tratado, indicando que a mesma tem a capacidade de reduzir a toxicidade promovida pelo peptídeo βA, pois prolongou o tempo de paralisia nos helmintos, portanto, poderia ser utilizada como padrão positivo para as analises side by side.
5.4.2. Avaliação da atividade das moléculas obtidas a partir da monocrotalina
RTN condensada aos aminoácidos fenilalanina e triptofano, contudo nenhuma das tentativas foi eficiente considerando o rendimento e as estruturas químicas obtidas em comparação com as esperadas e avaliadas in silico, possivelmente devido a características estruturais da RTN que serão discutidas adiante. Devido a isso foram testados os intermediários sintéticos obtidos, isto é, a RTN), que é o núcleo do alcaloide de partida, e seu derivado halogenado na posição 9 com o cloro (RTN-Cl).
A escolha da faixa de concentrações a serem utilizadas para os testes em C. elegans foi a partir de outros trabalhos que utilizaram modelos do nematódeos para avaliação da atividade biológica de compostos isolados (GRÜNZ et al., 2012; HUANG et al., 2017; JAKOBSEN et al., 2013; KAMPKÖTTER et al., 2008).
A primeira molécula a ser avaliada foi a RTN (10, 50 e 100 µmol). Testar a RTN isolada é uma etapa importante, pois esta foi obtida a partir da Monocrotalina, um
84 alcaloide pirrolizidínico conhecido por sua atividade tóxica, sendo assim, torna-se essencial verificar se a RTN também apresenta atividade tóxica. Os resultados das análises para este alcaloide estão apresentados na Figura 24.
Figura 24 - Ensaio de paralisia com o transgênico CL2006 para Retronecina
A s concentrações de 10, 50 e 100 µmol não foram estatisticamente significativas em relação ao controle e nem entre si, sendo que os valores de p para cara uma das concentrações foi respectivamente 0,5799, 0,5898 e 0,0976. Apenas a Memantina apresentou valor de p<0,05 (0,0099).
O derivado halogenado da RTN também foi avaliado para o modelo de DA em C. elegans. As mesmas concentrações utilizadas para a RTN foram utilizadas para o 7- (clorometil)-2,3,5,7a-tetrahidro-1H-pirrolizin-1-ol (RTN-Cl). Os resultados da análise estão apresentados na Figura 25.
Figura 25 - Ensaio de paralisia com o transgênico CL2006 para Retronecina halogenada
85 A RTN-Cl também não apresentou efeito estatisticamente significativo em relação ao controle sobre o fenótipo de paralisia de C. elegans. Assim como para a RTN também não foi verificado efeito tóxico sobre o animal.
Apesar de a RTN e a RTN-Cl não terem apresentado resultados satisfatórios no fenótipo de paralisia no animal, os resultados foram animadores, pois a toxicidade, que é verificada na MCT não foi evidenciada com moléculas derivadas desta. Em teoria esse resultado já era esperado, pois a toxicidade da monocrotalina é caracterizada por critérios estruturais já bem estabelecidos (MATTOCKS, 1968 1971, 1972; DEWICK,2009). A presença do diéster nos carbonos 7 e 9, bem como a dupla ligação entre os carbonos 1 e 2 são essenciais para a toxicidade, e a RTN, bem como a RTN-Cl apresenta apenas a dupla ligação nos carbonos C1 e C2, mas os ésteres não estão mais presentes.
87 6. CONCLUSÃO
As cinco moléculas propostas como novas alternativas terapêuticas para o tratamento da DA apresentaram potencial biológico in silico como fármacos anticolinesterásicos. As propriedades físico-químicas importantes para a farmacocinética foram avaliadas em comparação com um fármaco padrão utilizado no tratamento da DA, a galantamina. Dos 5 derivados propostos apenas dois apresentaram características físico-químicas favoráveis a farmacocinéticas, os derivados RTN-Trp e RTN-Phe. Devido a isso as reações foram direcionadas para a obtenção destes dois compostos. Nós conseguimos isolar e caracterizar a MCT a partir das sementes de C. retusa. Obtivemos a partir da MCT o seu núcleo pirrolizidínico a RTN, que foi utilizada com protótipo para a síntese dos compostos desejados. Apesar de 6 propostas reacionais terem sido efetuadas, não conseguimos obter os produtos de interesse, algumas estruturas foram propostas a partir da análise dos espectros dos produtos reacionais, mas a caracterização inequívoca não foi possível devido ao nível de impureza dos espectros. A não obtenção dos compostos de interesse podem estar relacionadas a características estruturais da RTN, bem como a condições reacionais ineficientes. Devido a isso nós avaliamos o potencial biológico dos produtos intermediários no modelo de Alzheimer de C. elegans, mais especificamente na cepa CL2006, um mutante que expressa o peptídeo βA no músculo. As moléculas testadas não apresentaram atividade significativa neste modelo de DA, no entanto os resultados ainda são animadores, pois diferentemente da MCT, que é um alcaloide primariamente tóxico, os compostos intermediários não apresentaram toxicidade para o nematoide, indicando que o núcleo pirrolizidínico pode ser explorado como protótipo para a síntese de novas moléculas e ser avaliada para outros alvos biológicos.
88 7. REFERENCIAS
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