O Efeito Raman

Quando a luz incide sobre uma substância qualquer, ela pode ser absorvida ou espalhada (53).

Figura 14: Interação da radiação óptica com o tecido biológico. Fonte: Zângaro (53).

A espectroscopia de infravermelho (IR - infrared) mede a freqüência na qual uma dada amostra absorve uma radiação IR e a intensidade desta absorção. Assim, o espectro do infravermelho representa a identificação de uma amostra com picos de absorção correspondentes à freqüência de vibração entre os átomos constituintes do material (3,7,52). A determinação desta freqüência permite identificar os componentes químicos da amostra visto que cada grupo químico é conhecido por absorver luz em uma determinada freqüência. A intensidade de certa absorção está relacionada com a concentração de um respectivo componente, fornecendo, assim, uma análise quantitativa. Os espectros Raman obtidos podem ser anulados pela fluorescência das impurezas se as amostras forem excitadas com luz visível. A espectroscopia Raman usa radiação laser com energia próxima à do infravermelho para excitar uma dada amostra e medir a luz emitida pela mesma.

A maioria das amostras orgânicas pode ser excitada com um laser na região do infravermelho próximo (40), reduzindo o efeito da fluorescência dos tecidos. Com o uso do sistema da transformada de Fourier obtém-se também a redução do efeito da fluorescência do tecido, promovendo menos degradação fotolítica das amostras que ocorre devido aos longos comprimentos de onda do laser utilizado, e permite assim uso de laser de maior potência (52). Sendo a energia da luz proporcional à freqüência, a mudança de freqüência da luz espalhada inelasticamente é igual à freqüência vibracional da molécula espalhada. Este processo de troca de energia entre a luz incidente e a molécula, resultando em alterações nas características da luz espalhada, é conhecido como efeito Raman (40,52). Pode ser descrito como uma transição da molécula de seu estado fundamental para um estado vibracional excitado.

De forma simplificada pode-se dizer que o espalhamento acontece quando os fótons se chocam com moléculas de uma amostra que pode ser de gás, líquido ou sólido. A molécula é um conjunto de átomos ligados uns aos outros por forças de origem elétrica. Essas ligações podem ser simbolizadas por pequenas “molas” entre os pares de átomos. Um fóton que atinge uma molécula pode ser espalhado, ou seja, ter sua direção modificada. Basicamente, dois tipos de espalhamento ocorrem:

1 – Se a molécula, no choque, se comporta como uma esfera rígida, sem movimentos internos, o fóton espalhado conserva a mesma energia de antes do choque. Este é dito espalhamento elástico (efeito Rayleigh) e é o mais comum quando fótons incidem sobre as moléculas.

2 – Porém a molécula não é uma esfera rígida. Alguns fótons, ao se chocarem com uma molécula, podem dar início a algum movimento dos átomos da molécula, ou seja, o fóton excita a molécula, cedendo a ela parte de sua energia inicial. A energia do fóton após o choque é, portanto, menor que a inicial, pois parte dela foi usada para provocar vibrações na molécula (efeito Stokes). Também pode ocorrer o inverso: o fóton incide sobre uma molécula que já está em estado excitado. Neste caso a molécula se excita ainda mais e depois decai ao nível fundamental, dando mais energia ao fóton (efeito anti-Stokes). Estes efeitos definem o espalhamento inelástico, onde há troca de energia entre o fóton e a molécula, e é o que define o efeito Raman (54).

(a) (b)

Figura 15: O espalhamento (a) elástico e (b) inelástico.

Nota: (a) espalhamento elástico (Rayleigh), onde não há troca de energia mostra o fóton simbolizado em verde. (b) espalhamento inelástico (Raman), onde o fóton (verde) excita a molécula (amarelo) e deixa parte de sua energia.

A luz Raman espalhada pela molécula pode ser coletada por um espectrofotômetro, que identifica as bandas da freqüência de deslocamento Raman. Uma série de picos, cada qual deslocado pela freqüência vibracional própria daquela molécula, compõe o espectro Raman, fornecendo assim a identificação para a molécula que está sendo estudada (52). O espectro Raman é como uma impressão digital da molécula, fornecendo informação bioquímica específica, não encontrada em outras técnicas ópticas (22). O deslocamento Raman é freqüentemente medido em número de onda (cm^-1). Na Figura 16 o exemplo de um espectro Raman no infravermelho próximo onde se observa a curva característica da presença de cálcio no tecido estudado. Calcificação 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 800 1000 1200 1400 1600 1800 Intensi dade ( un. ar b.)

Figura 16: Exemplo de espectro Raman de uma amostra de tecido coronariano calcificado. (Laser de excitação: 830 nm, tempo de aquisição: 60s).

As trocas energéticas entre os níveis de energia de um sistema molecular são demonstradas no diagrama abaixo (Diagrama de Jablonski). A transição do nível S0 para o nível S1, pela excitação do material com radiação ultravioleta e radiação visível, é acompanhada pela absorção de um fóton; a transição do material do nível S1 para o nível S0 é

acompanhada pela emissão de um fóton. Este fóton emitido é denominado fóton fluorescente. A excitação do material com radiação no infravermelho permite que apenas os níveis vibracionais sejam excitados, evitando-se a ocorrência da fluorescência.

Figura 17: Efeito Raman: excitação com UV, luz visível e infravermelho próximo. Fonte: Adaptado de Manoharan, Wang e Feld (1996) e Hanlon et al. (2000).

Nota: Efeito Raman: excitação utilizando UV, luz visível e infravermelho próximo. S0 - estado

fundamental; S1 e S2 - estados eletrônicos excitados. As linhas horizontais indicam os níveis vibracionais

de energia. ν_Ex indica a freqüência de excitação do laser enquanto que, ν_R indica a freqüência da luz

espalhada (Raman).

Flutuações espontâneas chamadas ruídos podem impor um limite na transmissão da informação. Referem-se a sinais espúrios ou não desejados presentes no sistema. Sua compreensão á fundamental para entender as limitações impostas num sistema infravermelho (55). A informação necessária para identificar o tecido analisado é a posição correta das bandas Raman, mas se o espectro não for obtido nas condições ideais o ruído estará sempre presente e poderá mascará-lo (56).

Dentre os diferentes ruídos há o ruído de fóton, causado pela flutuação aleatória quando da chegada dos elétrons no eletrodo de coleta (shot noise), o ruído cósmico e o ruído térmico (56,57). Os ruídos shot e térmico podem perturbar e confundir o espectro. Já o ruído cósmico manifesta-se como picos de intensidade elevada e base muito estreita, o que torna fácil seu reconhecimento. Os ruídos exigem uso de uma ferramenta que possa minimizar sua interferência no espectro para uma melhor leitura deste. Técnicas de filtragem digital tais como transformada de Fourier, método de entropia máxima (MEM), filtros digitais do tipo

Butterworth e outros têm sido propostos. A junção de diferentes técnicas de processamento do sinal permite obter melhores resultados (57).