Universidade Comunitária Regional de Chapecó
Programa de Mestrado Interinstitucional em Engenharia Biomédica
MARINES BERTOLO PERES
IDENTIFICAÇÃO DO TECIDO ARTERIAL CORONARIANO NORMAL E ATEROMATOSO POR ESPECTROSCOPIA RAMAN DISPERSIVA NO
INFRAVERMELHO PRÓXIMO ATRAVÉS DA CONSTRUÇÃO DE UM MODELO DOS ESPECTROS DOS CONSTITUINTES BÁSICOS
São José dos Campos, SP. 2008
IDENTIFICAÇÃO DO TECIDO ARTERIAL CORONARIANO NORMAL E ATEROMATOSO POR ESPECTROSCOPIA RAMAN DISPERSIVA NO
INFRAVERMELHO PRÓXIMO ATRAVÉS DA CONSTRUÇÃO DE UM MODELO DOS ESPECTROS DOS CONSTITUINTES BÁSICOS
Dissertação apresentada no Programa de Pós-graduação em Engenharia Biomédica, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
Orientador: Prof. Dr. Landulfo Silveira Junior. Orientador: Prof. Dr. Renato Amaro Zângaro
São José dos Campos, SP. 2008
especfuoscopia Raman dispersiva no infravermelho próximo através da consfução de um modelo dos espectros dos constituintes básicos / Marines Bertolo Peres; Orientadores: Prof. Dr. Landulfo Silveira Junioro Prof. Dr. Renato Amaro 7-angwo. São José dos Campos; Chapecó,2008.
I Disco laser: color.
Dissertação apresentada ao Proglarna de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimenúo da Universidade do Vale do Paruíba, modalidade Minter Univap / Unochapeó. 2008.
l. Aterosclerose 2. Espectrosoopia Raman 3. Anatise Espechal - métodos 4. Especfioscopia óe Lvz no Infravermelho Próximo I. Silveira Junioro Ladulfo, Orient. II. Zangno,Renato Amaro, Orient. III. Título
CDU:616-003.9
Autorizo exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta dissertação, por processos fotocopiadores ou transmissão eletrônica, desde que
citadaa fonte.
Assinatura do aluno tr' (*
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Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomedica, do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraiba, São Jose dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora:
Prof. Dr. Prof. Dr. Prof. Dr.
EGBERTO MUNIN (UNIVAP LANDULFO SILVEIRA JUNIO EMILIO MORIGUCHI (UNISINOS)
Prof. Dra. Sandra Maria Fonseca da Costa Diretor do IP&D - UniVap
Aos meus filhos amados e ao meu marido, incansáveis no amor incondicional. À minha mãe (in memóriam) que me transmitiu a humildade e a aceitação das intempéries da vida.
Aos Diretores da Univap e Unochapecó, pela iniciativa em promover o Minter que permitiu o aperfeiçoamento do Corpo Docente Unochapecó.
Ao colega Marcelo, que me incentivou a cursar o Mestrado.
Ao meu orientador, Professor Landulfo, amigo e mestre compreensivo nas dificuldades da aprendiz.
Ao Professor Carlos Pasqualluci, pela coleta das amostras biológicas no SVOC-SP. À Rubia, pelo sempre gentil desprendimento e apoio na biblioteca Univap.
Aos meus colegas, por dividirmos as angústias nestes dois anos.
Aos meus filhos, pela paciência e compreensão nos longos momentos de ausência materna.
Ao meu esposo Paulo, pelo incentivo, apoio e carinho nos mais difíceis momentos. A todos os que contribuíram direta ou indiretamente com atos, pensamentos ou ações para este trabalho fosse concluído.
Aos que me apresentaram obstáculos, pela certeza que as adversidades fazem parte do crescimento de cada um de nós.
À Deus, pela força e inspiração de seguir em frente, mesmo em face das maiores incertezas e dificuldades.
“Nunca ande pelo caminho traçado. Ele conduz somente até onde os outros já foram”.
(Alexander Gran Bell)
“Encontrar dificuldades no caminho é inevitável, ser vencido por elas é opcional”.
INFRAVERMELHO PRÓXIMO ATRAVÉS DA CONSTRUÇÃO DE UM MODELO DOS ESPECTROS DOS CONSTITUINTES BÁSICOS
RESUMO
Progressos no diagnóstico, tratamento e prevenção da doença coronariana aterosclerótica dependem de um maior entendimento dos mecanismos de início e progressão da placa aterosclerótica. A caracterização da composição da placa aterosclerótica pela análise histopatológica permanece limitada a amostras seccionadas das artérias. Estudos diversos têm destacado a relevância da identificação da placa vulnerável, atualmente indicada como responsável pelos eventos coronarianos agudos. Diversos métodos invasivos e não invasivos têm sido propostos para análise destas variáveis buscando identificar o paciente com risco de eventos coronarianos agudos, incluindo morte súbita. Estudos de autopsia têm permitido a identificação de características moleculares das placas ateroscleróticas utilizando a espectroscopia Raman no infravermelho e infravermelho próximo, que permite análise das placas com precisão molecular, não destrutiva, com excelente correlação histopatológica. O presente estudo destina-se à construção de um modelo bioquímico simplificado dos espectros referentes aos diversos componentes da placa ateromatosa. Foram utilizados espectros dos constituintes básicos dos tecidos arteriais e das placas ateromatosas (tecido muscular liso (CML), tecido colagenoso (CLG), colesterol (CO), tecido calcificado (CA) e gordura da adventícia(AD)) para construir um banco de espectros. Estes foram posteriormente sobrepostos aos espectros obtidos de amostras de coronárias normais e ateromatosas. Os espectros foram combinados entre si a fim de identificar quais as combinações melhor identificavam os tecidos estudados e os resultados foram processados por cálculo da distância Euclidiana, visando identificar qual combinação possui correlação com o tipo de placa. Foi possível identificar e classificar corretamente as amostras estudadas em normal, ateromatosa não calcificada e ateromatosa calcificada, com alta sensibilidade e especificidade,
sendo que para os tecidos normais a maior sensibilidade (80%) foi obtida quando utilizada a combinação dos espectros CLG X CML e maior especificidade (94%) com CMLxAD e COxCLG. Para os tecidos ateromatosos obteve-se maior sensibilidade (89%) com combinação dos espectros COcAD maior especificidade (94%) com CLGxCO. Os tecidos calcificados foram identificados com sensibilidade e especificidade máxima (100%) em todas as combinações onde o espectro de cálcio está presente.
PALAVRAS-CHAVE: Aterosclerose; vulnerabilidade; diagnóstico; espectroscopia Raman;
THROUGH THE DEVELOPMENT OF A MODEL BASED ON BASIC CONSTITUENTS
ABSTRACT
Progresses in the diagnosis, treatment and prevention of the coronarian atherosclerotic disease depend on a major knowledge of the mechanisms of progression of the atherosclerotic plaque. The characterization of the composition of the atherosclerotic plaque by the histopathologic analyses remains limited to seccionated samples of the arteries. Studies have shown the relevance of the identification of the vulnerable plaque, nowadays indicated guilty by the acute coronarian events. Many invasive and non- invasive methods have been presented to analyze these variables, seeking the identification of the patients who presents risks of acute coronarian events including sudden death. Autopsy studies have allowed the identification of molecular characteristics of the atherosclerotic plaques using the Raman spectroscopy using the infrared and near-infrared, which allows the analysis of the plaques with molecular precision, non-destructive, with excellent histopathologic correlation. The objective of this study is the construction of spectral models to represent the many components of the arterial and atheromatosis wall. Models of the basic elements of the arterial tissues and atheromatous plaques (soft muscle tissue, collagen tissue, cholesterol, calcified tissue and fat of the adventitious) were used in order to create a table of spectra. These were subsequently overlapped to the spectrum obtained out of samples of normal coronaries and atheromatous, and the results were processed by the calculation of Euclidean distance. It was possible identify and classify correctly the studied sample in normal, atheromatous non-calcified and calcified atheromatous, with high sensibility and specificity.
KEYWORDS: atherosclerosis, vulnerability, diagnostic, Raman spectroscopy, biochemical model.
Figura 1: Morfologia microscópica da artéria normal...16
Figura 2: Fotomicrografia da camada média de artéria normal...16
Figura 3: Formação da placa ateromatosa com recrutamento de leucócitos e alteração da permeabilidade endotelial...20
Figura 4: Formação das células espumosas...20
Figura 5: Formação do núcleo lipídico e capa fibrosa...20
Figura 6: A placa aterosclerótica complicada ou instável. ...20
Figura 7: Classificação das placas ateroscleróticas pela Histologia Virtual...22
Figura 8: Diagrama de uma placa vulnerável rica em lipídeos...24
Figura 9: Diferentes tipos de placas vulneráveis...25
Figura 10: Angiograma de um paciente com IAM inferior...28
Figura 11: Os métodos diagnósticos por imagem. ...29
Figura 12: Reconstrução tridimensional do coração e das artérias coronárias (MRI)...30
Figura 13: O físico C. V. Raman...32
Figura 14: Interação da radiação óptica com o tecido biológico...33
Figura 15: O espalhamento (a) elástico e (b) inelástico. ...35
Figura 16: Exemplo de espectro Raman de uma amostra de tecido coronariano calcificado. .35 Figura 17: Efeito Raman: excitação com UV, luz visível e infravermelho próximo. ...36
Figura 18: Diagrama esquemático do espectrômetro Raman...38
Figura 19: Equipamento de espectroscopia no IP&D da UNIVAP...38
Figura 20: Espectrógrafo utilizado por Raman na década de 20...39
Figura 21: Exemplo de espectro Raman no infravermelho-próximo do colesterol...39
Figura 22: Espectros médios obtidos da análise Raman de 111 amostras de coronárias ...52
Figura 23: Fotomicrografia de parede de artéria coronária com placa calcificada...53
Figura 24: Fotomicrografia de parede de artéria coronária com placa fibrosa...54
Figura 25: Fotomicrografia de parede de artéria coronária normal...54
Figura 26: Espectros Raman dos componentes bioquímicos estudados para o modelo...57
Figura 27: Porcentagem relativa média e desvio padrão dos constituintes bioquímicos básicos em cada classe de tecido arterial estudado. ...59
Figura 28: Gráfico de sobreposição dos espectros basais com os espectros médios dos tecidos e o resíduo da sobreposição...60
diagnóstico...50
Tabela 2: Combinação dos constituintes básicos utilizados para construção dos espectros modelo. ...51
Tabela 3: Resultados do cálculo da distância Euclidiana...62
Tabela 4: Sensibilidade e especificidade do modelo básico...63
Tabela 5: Sensibilidade e especificidade da combinação do espectro de colesterol ...66
Tabela 6: Sensibilidade e especificidade da combinação do espectro de musculares lisas...67
Tabela 7: Sensibilidade e especificidade da combinação do espectro de colágeno. ...67
Tabela 8: Sensibilidade e especificidade da combinação do espectro de cálcio. ...68
Tabela 9: Sensibilidade e especificidade da combinação do espectro de adipócitos. ...68
LISTA DE QUADROS Quadro 1: Classificação das lesões ateromatosas AHA...21
1.1 Objetivos ... 13 1.1.1 Objetivo Principal ... 13 1.2.2 Objetivo Secundário... 13 2 REVISÃO DA LITERATURA... 15 2.1 A Artéria Normal... 15 2.2 Aterosclerose ... 17 2.2.1 Histórico... 17 2.2.2 Definição... 17
2.2.3 Formação e Evolução da Placa Ateromatosa ... 18
2.2.4 Classificação das Lesões Ateromatosas ... 20
2.2.5 Descrição Molecular da Placa Ateromatosa... 22
2.2.6 A Placa Vulnerável ... 23
2.3 Os Métodos de Diagnóstico ... 28
2.4 A Espectroscopia Raman ... 30
2.4.1 Histórico da Espectroscopia Raman... 31
2.4.2 Indicações da Espectroscopia Raman ... 32
2.4.3 O Efeito Raman... 33
2.4.4 A Instrumentação Raman... 37
2.4.5 Análise Espectral: Reconhecimento de Padrões e Classificação ... 40
2.4.6 Classificação Espectral Baseada na Análise Estatística Multivariada: PCA... 41
3.1 Aprovação no Comitê de Ética ... 44
3.2 Instrumentação Raman... 44
3.3 Obtenção das Amostras de Coronárias e Análise Espectroscópica... 45
3.4 Preparação Histológica das Amostras de Coronárias ... 46
3.5 Obtenção das Amostras para o Modelo dos Componentes Bioquímicos Básicos ... 47
3.6 Calibração e Processamento dos Espectros Raman... 48
3.6.1 Calibração da Resposta Espectral ... 48
3.6.2 Calibração do Deslocamento do Número de Onda ... 48
3.6.3 Remoção da Fluorescência de Fundo (Background)... 49
3.6.4 Remoção do Ruído de Alta Freqüência ... 49
3.6.5 Correlação da Classificação Histológica dos Tecidos Coronarianos com a Espectroscopia Raman a Partir de um Modelo Baseado na Análise dos Componentes Bioquímicos ... 49
4 RESULTADOS ...52
4.1 A Análise Espectral... 52
4.2 Análise Histológica... 53
4.3 Modelo de Classificação do Tecido Arterial Baseado nos Espectros Basais dos seus Constituintes... 55
4.4 Sensibilidade e Especificidade do Diagnóstico ... 62
5 DISCUSSÃO...64
6 CONCLUSÕES...72
REFERÊNCIAS ...73
1 INTRODUÇÃO
A doença aterosclerótica tem sido a principal causa de morte nos países em desenvolvimento e permanece como uma das principais causas de óbito, afetando cerca de 1/3 da população mesmo em países desenvolvidos (1). A cada ano, mais de um milhão de pessoas nos Estados Unidos e cerca de 19 milhões de pessoas em outros países do mundo sofrem um evento cardíaco agudo (síndrome coronariana aguda e/ou morte súbita cardíaca). Uma grande parte desta população não tem sintomas prévios. Há uma considerável demanda para diagnóstico e tratamento das condições patológicas que subscrevem esses eventos cardíacos agudos (2). Métodos diagnósticos até agora disponíveis identificam a morfologia e magnitude da placa ateromatosa sem, contudo, identificar sua composição química e risco de ruptura. No contexto diagnóstico, os métodos de identificação da composição da placa ateromatosa evoluem rapidamente e a Espectroscopia Raman surge como método promissor para biópsia não invasiva das lesões ateromatosas, fornecendo conhecimento quantitativo da composição molecular dos tecidos.
1.1 Objetivos
1.1.1 Objetivo Principal
Neste trabalho pretende-se desenvolver um modelo de identificação da constituição da placa aterosclerótica e do tecido arterial normal utilizando-se de espectros Raman dos componentes bioquímicos básicos dos tecidos arteriais normais e lesões ateromatosas, obtidos das estruturas com as mesmas características morfológicas tais como tecido colagenoso, tecido muscular liso, tecido calcificado, colesterol, tecido adiposo da adventícia, propondo uma forma simplificada de identificar os componentes presentes e assim separar os tecidos em arterial normal e ateromatoso, diagnosticando o estágio da doença através do espectro obtido.
1.2.2 Objetivo Secundário
Estudar a aplicação técnica da espectroscopia Raman no infravermelho próximo (NIRS)
in vitro em artérias humanas obtidas post-mortem com a finalidade de identificar os
molecular e o risco de ruptura da placa (vulnerabilidade), com potencialidade para desencadear eventos coronarianos agudos e morte súbita.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 A Artéria Normal
O conhecimento da estrutura da parede das artérias de médio e grande calibre é de fundamental importância para a compreensão da espectroscopia Raman na doença ateromatosa. Definidas a espessura e composição das camadas, é possível correlacionar o sinal Raman coletado da parede das artérias e definir sua composição molecular.
As artérias diferem primariamente em sua secção transversal e na espessura da parede. A variação do tamanho e espessura da parede dos vasos sanguíneos depende da presença ou ausência de uma ou mais das três camadas de tecidos, chamadas túnicas, e da diferença de suas espessuras. A aorta e as artérias coronárias são geralmente referidas como artérias de grande calibre. A parede das artérias elásticas de grande calibre é composta por três camadas denominadas de camada adventícia ou externa, camada média ou muscular e camada íntima. A camada íntima, de interesse na aterosclerose, é formada por fina camada de células endoteliais, uma camada de tecido conectivo composta por fibras elásticas delicadas, alguns fibroblastos e alguns macrófagos. Essa camada é a que mantém contato direto com o fluxo sanguíneo e é a única camada presente em vasos de todos os tamanhos. A túnica média é freqüentemente espessa e é formada principalmente por múltiplas camadas de células musculares lisas entremeadas por fibras elásticas, permitindo flexibilidade e elasticidade para contração e relaxamento dos vasos. A íntima e a média são usualmente as camadas onde a ateromatose se desenvolve. A camada mais externa, a túnica adventícia, é uma camada relativamente fina de tecido conectivo contendo fibras elásticas e colagenosas que correm paralelas ao eixo do vaso. A camada adventícia dá maior suporte mecânico para a artéria e é quem supre os nutrientes para a parede arterial. Nas artérias de grande calibre como aorta e coronárias, a espessura da camada íntima é aproximadamente de 50 a 300 µm, a média 500 a 600 µm e adventícia cerca de 100 µm. A espessura das camadas íntima e média é idade dependente, usualmente aumentando durante o crescimento devido produção de elastina e colágeno e pelo acúmulo de células musculares lisas (3). O conhecimento da estrutura da artéria e variação na espessura de suas paredes é necessário para estudar as características da resposta Raman de diferentes camadas de uma referida parede arterial, diferentes profundidades das camadas e diferentes tipos de artérias.
Figura 1: Morfologia microscópica da artéria normal.
Fonte: (www.fo.usp.br/.../images/vason2b.jpg) Acesso 11 jun. 2008
Na Figura 1 estão evidentes as três túnicas ou camadas que compõem a parede vascular das artérias elásticas de médio calibre. Aqui estão evidentes os elementos fibrosos que compõem essas camadas, não estando visíveis os núcleos celulares. A camada média é ricamente composta por fibras elásticas, sendo responsável por quase 80% da espessura da parede da artéria.
Figura 2: Fotomicrografia da camada média de artéria normal.
Fonte: http://www.icb.ufg.br/histologia/endoc/open.htm
acesso:11 jun. 2008
Na Figura 2 está em destaque a camada média de artéria normal mostrando colágeno (azul) e células musculares lisas (vermelho).
2.2 Aterosclerose
2.2.1 Histórico
Em 1856, o cientista alemão Rudolf Virchow definiu que as alterações da parede das artérias hoje descritas como aterosclerose eram resultantes de três elementos fundamentais: dos componentes da parede arterial, do sangue e seus componentes responsáveis por fenômenos hemorreológicos e dos fenômenos hemodinâmicos derivados do fluxo sangüíneo. Virchow propôs que uma leve injúria à parede arterial promoveria a formação de um infiltrado inflamatório e os componentes plasmáticos poderiam assim passar à camada média do vaso. Também em 1852, Rokitanski, e em 1947, Duguid, sugeriram que a formação de um trombo na parede arterial nos sítios de injúria propiciaria o desenvolvimento de estruturas que integrariam células musculares lisas em seu interior, que se multiplicariam induzindo a progressão do processo aterosclerótico. A patogênese da aterosclerose também foi descrita por Glavind et al. em 1952, que demonstraram o acúmulo de lípides peroxidados na parede das artérias ateroscleróticas e sugeriram que esses compostos colaboravam na patogênese da aterosclerose. Em 1957 Harman propôs que a aterosclerose resulta de três processos primários: a) a oxidação dos constituintes das lipoproteínas séricas; b) o acúmulo do material oxidado na parede vascular; c) inflamação na parede induzida por esses processos oxidativos. A “teoria da resposta à injúria” foi descrita por Ross e Glomset em 1976 postulando que, após uma desnudação endotelial, a infiltração lipídica e a formação do trombo seriam os componentes críticos fundamentais na progressão do ateroma (4).
2.2.2 Definição
A aterosclerose é uma doença complexa, multicausal, resultante da civilização e da modernidade, que acompanha o homem desde sua concepção até a morte, sendo um dos grandes predadores da saúde humana e cuja exata etiopatogenia é ainda pouco conhecida. Compreende um processo inflamatório crônico, oxidativo, e pressupõe inflamação endotelial, alterações bioquímicas, morfológicas, funcionais e clínicas; a lesão aterosclerótica se refere especificamente às alterações morfológicas observadas nas artérias. Deve ser considerada uma patologia do metabolismo geral transmitida pelo sangue e tendo como órgão-alvo a parede arterial, onde uma resposta defensiva do tecido conectivo ocorre em face de agressões
permanentes em que a biologia da parede vascular, devido a alterações causadas pelos fatores de risco (agressores) produz uma resposta tecidual caracterizada por inflamação e imunidade (5).
2.2.3 Formação e Evolução da Placa Ateromatosa
Em 2002, Peter Libby (6) descreveu a formação da placa ateromatosa:
A – Partículas de LDL acumulam-se na parede dos vasos e sofrem alterações químicas estimulando as células endoteliais a produzir moléculas adesivas as quais capturam monócitos e células T da corrente sanguínea e as atraem para a íntima.
B – Nesta os monócitos transformam-se em macrófagos ativos e junto com as células T produzem mediadores inflamatórios inclusive citosinas e fatores que promovem a divisão celular. Os macrófagos também produzem outros receptores que os ajudam a ingerir as LDL modificadas.
C – Ingeridas as LDL os macrófagos ficam repletos de gotículas gordurosas e tomam o aspecto de célula espumosa. Nasce a estria gordurosa, primeira manifestação da placa ateromatosa.
D – A partir de então fenômenos inflamatórios levam à progressão do processo aterosclerótico com acúmulo de macrófagos no núcleo lipídico e a replicação das células musculares lisas. A interação de linfócitos T e células musculares lisas pode levar a intensa resposta proliferativa, com síntese de enzimas hidrolíticas, citosinas e fatores de crescimento, como também grande quantidade de tecido conjuntivo-fibroso produzido pelas células musculares lisas, as quais se mantêm em constante proliferação e migração, formando a capa fibrosa responsável por recobrir o núcleo lipídico da agora lesão avançada ou complicada. Os fatores de risco cardíaco (sedentarismo, obesidade, stress, dislipidemia, diabetes, tabagismo) não predizem como a doença poderá se comportar.
A progressão da aterosclerose é dependente da quantidade e tipo de lipídios que se acumulam na parede das artérias (7). A composição da lesão, mais do que seu tamanho ou volume determina se a placa aterosclerótica vai progredir, regredir ou romper. A transformação de uma placa silenciosa, de superfície não trombogênica, em uma placa trombogênica instável resulta na síndrome coronariana aguda e envolve interações complexas entre células musculares lisas, células endoteliais, e infiltradas de células inflamatórias, especialmente linfócitos T e macrófagos. A ruptura da placa é o tipo mais comum de complicação, contribuindo para cerca de 70% dos IAMs não fatais e/ou morte súbita cardíaca
(8).A maioria das técnicas para detecção e tratamento das placas vulneráveis é voltada para a placa com risco de ruptura. Esse tipo de placa tem sido chamado de “fibroateroma de capa fina” (9). A trombose propriamente dita resulta de um processo de desequilíbrio entre os numerosos fatores pró-trombóticos e antitrombóticos que ocorrem, em parte, por disfunção do endotélio, tanto quanto da degradação da capa fibrosa da capa instável para expor o sub-endotélio trombogênico e o núcleo lipídico.
A manutenção do equilíbrio homeostático envolve um cuidadoso balanço entre numerosos fatores pró-trombóticos e antitrombóticos que são ambos derivados do endotélio e da corrente sanguínea. No caso da síndrome coronariana aguda, a trombose resulta de um desequilíbrio a favor da formação do trombo. Enquanto tal desequilíbrio dos fatores circulantes pode predispor à formação do trombo, uma perturbação patológica da função endotelial normal é adicionalmente requerida para a trombogênese (10). A trombose é iniciada pela ativação, adesão e agregação plaquetária. Plaquetas podem ser ativadas pela exposição ao colágeno na matriz subendotelial, ou por vários outros agonistas, incluindo trombina, colágeno, fator tecidual, tromboxane A2, fator ativador de plaquetas (PAF), adenosina-5-difosfato, vasopressina, epinefrina, e serotonina (11).
A ruptura ou fissura da capa fibrosa permite a formação do trombo, que se estende tanto para dentro da matriz da placa quanto para o lúmen da artéria em 70 a 80% dos casos, conforme vários estudos de autópsia têm demonstrado (12, 13, 14, 15). A justaposição da placa fibrosa rota com o trombo permitem a visualização angiográfica de um padrão caracterizado como “lesão complexa”. Assim, interpretamos que a ruptura da capa fibrosa leva à exposição de fatores trombogênicos desta e da corrente sanguínea determinando a formação do trombo e o comprometimento grave da luz do vaso (16).
Figura 3: Formação da placa ateromatosa com recrutamento de leucócitos e alteração da permeabilidade endotelial.
Figura 4: Formação das células espumosas.
Figura 5: Formação do núcleo lipídico e capa fibrosa.
Figura 6: A placa aterosclerótica complicada ou instável. Fonte: Esquema adaptado de Ross por Xavier(5).
2.2.4 Classificação das Lesões Ateromatosas
Publicada em 1995, a classificação proposta pela American Heart Association considera a divisão da doença ateromatosa em lesões precoces ou estrias gordurosas, tipos I e II, e lesões avançadas ou placas de ateroma, tipos III, IV, V e VI (Quadro 1) . Porém esta classificação não considera que a trombose luminal pode ocorrer em três situações: 1) a ruptura da placa que tem capa fibrosa fina; 2) erosão da placa que apresenta espessamento do núcleo lipídico 3) nódulos calcificados superficiais que podem levar à erosão da capa fibrosa na superfície luminal. Assim os critérios acima receberam modificações propostas por Virmani and Kolodgie dividindo a lesão tipo IV em placa estável - ateroma de capa fibrosa, e placa instável - fibro-ateroma de capa fibrosa fina ( Figura 7) (17).
Classificação histológica Outros termos para a mesma lesão baseados na aparência ___________________________________________________________________________ Lesão tipo I Lesão inicial
Lesão tipo II
IIa Progressão tipo II Estria gordurosa lesão precoce
IIb Lesão resistente
Lesão tipo III Pré-ateroma
Lesão tipo IV ateroma Placa ateromatosa
Va Fibroateroma Placa fibrolipídica
Vb lesão calcificada(VII) Placa calcificada lesões avançadas
Vc lesão fibrótica (VIII) Placa fibrosa
Lesão tipo VI lesão com erosão e/ou Placa complicada Hematoma/hemorragia
Intraplaca
Quadro 1:Classificação das lesões ateromatosas segundo American Heart Association Fonte: VIRMANI, Renu et al.Lessons From Sudden Coronary Death: A Comprehensive Morphological Classification Scheme for Atherosclerotic Lesions.
Figura 7 - Classificação das placas ateroscleróticas pela Histologia Virtual com base no modelo histopatológico proposto por Virmani et al. A - Espessamento adaptativo da íntima ou placa fibrosa. B - Espessamento patológico da íntima. C – Fibroateroma. C1 - Fibroateroma sem cálcio. C2 - Fibroateroma com cálcio D - Placa fibrocalcificada.
Fonte: (www.rbci.org.br/imagens/14-02-07-figura8.jpg)
2.2.5 Descrição Molecular da Placa Ateromatosa
Em elegante estudo publicado em 1995, Libby descreveu as bases moleculares das síndromes coronarianas agudas (18). A capa fibrosa consiste de matriz extracelular densa e fibrosa (tecido conectivo) que contém macromoléculas responsáveis pela resistência da capa. Seus principais constituintes proteináceos incluem colágeno intersticial e elastina (19,20). Várias classes de proteoglicans também contribuem para a estrutura, porém com menor importância na resistência da parede. O colágeno tem muitas formas e na capa fibrosa a forma fibrilar assume particular importância. Os tipos I e III, formados de tríplice hélice helicoidal derivados de precursores pró-colágeno específicos são encontrados nas fibrilas da placa. Células musculares lisas podem sintetizar e também manter essas macromoléculas. O interferon-γ pode inibir a proliferação das células musculares lisas e também ativar sua morte ou apoptose, o que pode explicar a presença de poucas destas células e a redução da produção
de colágeno nas regiões vulneráveis da placa. Em adição à redução da produção de colágeno, sua degradação acelerada e a de outros componentes da placa podem contribuir para fragilizar a capa fibrosa. As macromoléculas que formam a matriz extra-celular geralmente exibem considerável estabilidade metabólica. Porém quando ativadas enzimas proteolíticas da super-família das matriz-metaloproteinases, incluindo a colagenase intersticial e as gelatinases, pode haver a “clivagem”do colágeno intersticial ocasionando a fragilidade da capa fibrosa (18). O núcleo lipídico é abundante em colesterol, e pode ser caracterizado pela identificação de moléculas relativas aos ésteres de colesterol, colesterol livre, fosfolipídios, e beta-carotenóides (19, 20). Células espumosas, compostas por macrófagos repletos de gordura fagocitada, e outras células inflamatórias que podem desempenhar um importante papel na fragilidade da placa também compõem o cor necrótico (21). A calcificação que ocorre na progressão da placa pode ser identificada pela presença dos sais de cálcio, principalmente hidroxiapatita. (19, 20, 22, 23, 24).
2.2.6 A Placa Vulnerável
O termo “placa vulnerável” descreve um grupo de placas em geral modestamente estenóticas, mas prontas para ruptura ou erosão, que facilmente resultam em evento agudo cardíaco ou cerebral, podendo chegar a morte súbita (25). Estudos post-mortem tem mostrado que a placa rota tem certas características: uma camada fibrosa fina (< 65 µm); um espesso núcleo lipídico; e elevada atividade de macrófagos. (25, 26, 27). O núcleo necrótico é também um importante componente da placa vulnerável e pode funcionar como um abscesso. A Figura 8 mostra de forma esquemática uma placa vulnerável rica em lipídeos. A fina capa fibrosa (FC) e o núcleo lipídico (LC) são característicos da placa coronariana vulnerável (Fig. 8).
Figura 8: Diagrama de uma placa vulnerável rica em lipídeos.
Atualmente novos estudos têm evidenciado uma nova visão em relação à vulnerabilidade da placa aterosclerótica, quanto à sua composição. Em 2003 Naghavi e col. publicaram um consenso colocando em evidência a vulnerabilidade do paciente cardiopata, destacando os métodos já existentes na área de diagnóstico e terapia e sugerindo a busca de novos marcadores para o risco de morte súbita cardíaca, incluindo a identificação da doença coronariana ateromatosa (28). Os autores do Consenso suportam as seguintes considerações:
1) Placas suscetíveis à ruptura não são somente as hoje consideradas “placas vulneráveis”. Todos os tipos de placas ateroscleróticas com alta probabilidade de complicações trombóticas e rápida progressão devem ser considerados como placas vulneráveis.
2) Placas vulneráveis não são as únicas culpadas pelo evento coronariano agudo. Devem ser considerados os fatores sanguíneos e os desarranjos do miocárdio como integrantes da avaliação do “paciente vulnerável”.
3) Um método quantitativo que avalie os riscos cumulativos do “paciente vulnerável” deve ser desenvolvido, de modo a avaliar os aspectos baseados na identificação da placa, dos desarranjos sanguíneos e da vulnerabilidade do miocárdio.
endotélio Células T
Células espumosas
Capa fibrosa rota causando trombose
Núcleo
necrótico Núcleo lipídico na placa
ateromatosa
Cristais de colesterol
Íntima com cél. musculares ativadas
A Figura 9 mostra diferentes tipos de placas vulneráveis como causa de eventos coronarianos agudos (SCA) e morte súbita cardíaca (MSC). A, placa pré-ruptura com grande núcleo lipídico e capa fibrosa fina com infiltrado de macrófagos. B, placa rota com trombo suboclusivo e organização precoce. C, placa pré-erosão com matriz de proteoglicans em uma placa rica em células musculares lisas. D, placa erodida com trombo suboclusivo. E, hemorragia intra-placa secundária a ruptura de vasa-vasorum. F, nódulo calcificado protruindo para a luz do vaso. G, placa cronicamente estenótica com severa calcificação,
trombo antigo e lúmen excêntrico.
Figura 9: Diferentes tipos de placas vulneráveis. Fonte: NAGHAVI, Morteza From Vulnerable Plaque to Vulnerable Patient: A Call for New Definitions and Risk Assessment Strategies: Part I. Review .Circulation. v.108, n.14,p.1664-1672, October 7, 2003.
No quadro 2, adaptado de Naghavi et al (28), estão descritos os principais marcadores de vulnerabilidade da placa ateromatosa, quanto à morfologia, estrutura, atividade e função.
Morfologia/estrutura
• Placa de capa fina
• Tamanho do núcleo lipídico
• Grau de estenose da placa (estreitamento luminal) • Remodelamento (expansivo vs constritivo) • Cor (amarela, amarelo brilhante, vermelha, etc)
• Conteúdo colágeno X conteúdo lipídico, estabilidade mecânica (espessura e elasticidade • Grau e padrão de calcificação (nodular X espalhada, superficial x profunda etc.).
• Stress de parede (padrão de fluxo através da artéria coronária)
Atividade e função
• Desnudação ou disfunção endotelial (produção local de NO, propriedades anti/pró-coagulação do endotélio).
• Stress oxidativo das plaquetas e inflamação da placa (densidade de macrófagos, infiltração monocitária e densidade de células T ativadas).
• Agregação plaquetária superficial e deposição de fibrina (trombo mural residual). • Índice de apoptose.
• Angiogênese, ruptura de vasa vasorum, e hemorragia intra-placa. • Atividade de digestão da matriz na capa (MMPs 2, 3, 9, etc). • Certos antígenos microbianos (exemplo:HSP60, C. pneumoniae). • Gradientes transcoronarianos de marcadores séricos de vulnerabilidade. • Quantidade de cálcio total coronário.
• Vasorreatividade coronária total (função endotelial). • Extensão da placa incluindo periferia (ex. IMT carotídea).
(MMP, matriz metaloproteinase; NO, óxido nítrico; e IMT, espessura médio-intimal.
Quadro 2: Marcadores de vulnerabilidade da placa ateromatosa. Fonte: Naghavi et al. Circulation, v.108, p.1664-1672, 2003.
Os mecanismos celulares que predispõe à vulnerabilidade da placa incluem redução na síntese de colágeno, alta expressão local de colagenase, e apoptose de células musculares lisas. Essas mudanças moleculares parecem ser mais evidentes no dorso da placa, onde o mecanismo de tensão é maximizado. Tem sido sugerido que a ruptura da integridade da placa
libera fatores pró-coagulantes, particularmente fatores teciduais, criando o nicho para a formação do trombo e desencadeando o evento coronariano agudo. Embora a ruptura de placas vulneráveis seja um evento relativamente comum na vasculatura, somente certas placas formam trombos oclusivos (25).
Estudo publicado pelo Dr. Peter Libby, em 1995 (18), descreve detalhadamente as bases moleculares das Síndromes Coronarianas Agudas (SCA). Este estudo já afirmava a presença de um processo inflamatório crônico como característica da aterosclerose, sugerindo que lipoproteínas e seus derivados (ex. lipoproteínas oxidadas) são fatores contribuintes para o fenômeno inflamatório das placas ateroscleróticas. De forma mais detalhada, Libby demonstrou outros estímulos inflamatórios potenciais, incluindo agentes infecciosos e auto-antígenos, e outros possíveis ativadores das células T (linfócitos). As células T ativadas secretam interferon–γ, a qual pode impedir a síntese de colágeno. Estudos histopatológicos têm demonstrado que no sítio de ruptura da placa há redução do conteúdo de colágeno. A elevada expressão da colagenase altera as propriedades mecânicas da placa por tornar as fibras colágenas finas e desorganizadas. Devido o importante papel que o colágeno desempenha em determinar a estabilidade da placa, métodos que possibilitem avaliar o conteúdo de colágeno são importantes em detectar placas ateroscleróticas instáveis (29).
Atualmente está claro que as artérias coronárias podem responder ao crescimento da placa por duas formas: por expansão extrínseca da parede do vaso (remodelamento positivo) ou por invasão da luz do vaso (remodelamento negativo) (30). Há evidências de que o remodelamento positivo tem suas vantagens, pois diminui o risco da estenose luminal, porém devido ao marcado remodelamento compensatório há maior vulnerabilidade para ruptura da placa, pois estas são compostas por grande núcleo lipídico e maior número de macrófagos, e possuem capa fibrosa mais fina. Já lesões com remodelamento negativo podem estar associadas a alto grau de estenose, mas parecem ser mais estáveis. As placas com remodelamento negativo, segundo estudos de Varnava-2001, têm em geral distribuição circunferencial e são predominantemente fibrosas e de baixo conteúdo lipídico, o que as torna menos vulneráveis. Este estudo, com análise pós-morten de segmentos de artérias coronárias, conclui que a ruptura da placa freqüentemente ocorre em sítios onde a estenose luminal parece modesta (31).
2.3 Os Métodos de Diagnóstico
As técnicas de diagnóstico atualmente em uso não dão informações precisas sobre a composição da lesão ateromatosa. Técnicas angiográficas (Fig. 10) podem quantificar o lúmen do vaso, estimar o volume da lesão, e reconhecer placas muito densas ou trombose, mas não fornecem informações detalhadas quanto à composição da lesão (32).
Figura 10: Angiograma de um paciente com infarto agudo do miocárdio inferior.
Fonte: GOLDSTEIN, James A. et al. Multiple Complex Coronary Plaques in Patients with Acute Myocardial Infarction,N Engl J Méd., v. 343, p.915-922, 2000.
Nota: A Figura mostra angiograma de um paciente com IAM inferior. A) Lesão culpada na artéria caracterizada por estenose ulcerada com oclusão total justa- distal. B) Visão cranial da artéria descendente anterior do mesmo paciente, com lesões múltiplas com complexa estenose ulcerada.
O manejo médico geralmente é requerido quando a placa é sintomática e já levou a comprometimento importante dos órgãos que necessitam de suprimento sangüíneo, tais como coração e cérebro (22). Para melhorar o manejo destes pacientes um melhor entendimento da progressão e regressão da placa aterosclerótica in vivo, a nível celular, é requerido. Avaliar características estruturais (morfologia) tanto quanto propriedades funcionais (atividade) das placas é o desafio da junção das técnicas disponíveis a fim de identificar os diferentes tipos de placas vulneráveis, proporcionando assim melhor valor preditivo que o que ocorre em uma pesquisa isolada (8).
Vários métodos têm sido utilizados para tentar definir identificar a placa vulnerável (25) : 1- Ultrassom intravascular (IVUS);
3- Tomografia de coerência óptica (OCT); 4- Termografia;
5- Ressonância Magnética Intravascular. (MRI); 6- Espectroscopia;
7- MEMS (Sistema microeletromecânico).
Figura 11: Os métodos diagnósticos por imagem. Fonte: Naghavi et al. (28).
Nota: Placas com morfologia similar em termos de capa fibrosa e núcleo lipídica (no centro do painel) podem ser semelhantes no diagnóstico por imagem onde se analisa somente a morfologia. Entretanto elas se tornam diferentes quando métodos capazes de identificar atividade e fisiologia da placa são utilizados. Na figura superior esquerda o uso da termografia mostra uma “placa quente” enquanto à direita está uma placa inativa, dita “placa fria”.
A Ultrassonografia Intravascular com Histologia Virtual (IVUS) faz análise com técnica acurada proporcionando uma vista das artérias coronárias que mostra alta correlação com amostras histológicas na validação dos estudos in vitro (33,34), entretanto não traz ainda a adequada caracterização da composição da placa, particularmente no que se refere ao núcleo lipídico. Tal informação tem sido obtida através do uso de Histologia Virtual (Figura 11),
Morfologia X Imagem
Termografia, espectroscopia, imagem molecular, MRI, CTMorfologia
similar
Atividade
diferente
Placa inflamada e ativaPlaca inativa e não inflamada
obtida por sinais de radiofreqüência (VH-IVUS) que tem demonstrado potencial para detalhar a composição da placa (35,36).
A Elastografia por Ultrasson Intravascular e Palpografia permite a avaliação das propriedades mecânicas dos tecidos, porém não quantifica os componentes da placa ateromatosa. Parte do princípio que os componentes da placa sofrem mais deformações quanto mais “moles” são (37). Análises biomecânicas demonstram os pontos de máximo stress circunferencial das placas sujeitas a ruptura (18,37).
A Ressonância Magnética de Alta Resolução (MRI) tem emergido como método promissor para avaliar a placa aterosclerótica, permitindo também a diferenciação de componentes da placa como núcleo lipídico, capa fibrosa, hemorragia intra-placa e calcificações (Fig. 12). Não há dados ainda quanto à possibilidade de calcular o stress de parede nas artérias coronárias, o que já é possível nos estudos em carótidas (36, 38, 39).
Figura 12: Reconstrução tridimensional do coração e das artérias coronárias, que deu origem a imagens que reproduzem a área de secção transversal das artérias coronárias (setas), demonstrando a presença de meio de contraste (sinal cinza claro – luz do vaso) e de placas lipídicas, excêntricas (sinal cinza escuro).
Fonte: www.rbci.org.br/detalhe_artigo.asp?id=85 (consulta web 11 ago. 2008.
Todas as doenças são causadas, sem exceção, por mudanças na bioquímica celular e/ou dos tecidos. A espectroscopia Raman está emergindo como método poderoso para diagnóstico médico, visto que alterações microscópicas podem ser detectadas por espectroscopia óptica pelos sinais característicos das doenças, resultando em um diagnóstico in vivo não invasivo. A técnica pode ser utilizada através de fibras ópticas, e a remoção da amostra não é necessária, representando grande avanço sobre as técnicas convencionais (22, 40, 41).
Recentemente tem havido interesse crescente do uso da espectroscopia laser para identificação e quantificação da placa ateromatosa (19, 20, 22, 23). A espectroscopia Raman, uma técnica de excelência para realizar a análise bioquímica sem remoção de tecido pode dar essa informação, proporcionando conhecimento quantitativo da composição molecular e a avaliação não destrutiva das amostras (22). Pelo método Raman é possível quantificar proteínas, colesterol, gordura adventícia, e cristais de cálcio nas artérias. A análise macroscópica e microscópica pelo método tem grande potencial para os estudos bioquímicos e podem fornecer informações sobre a estrutura, concentração e interação da bioquímica das moléculas em seus respectivos micro ambientes sem extração do tecido, homogeneização, marcas, etiquetas ou uso de agentes de contraste (20). Estudos com cateteres com fibra óptica já foram realizados em animais, no arco aórtico de ovelhas, em presença de fluxo sangüíneo. Estudos ex vivo tem permitido o estudo da placa em sua composição molecular, mantendo a placa intacta (7, 22, 32). Recentemente Motz et al. realizaram estudos in vivo durante procedimentos cirúrgicos, utilizando cateter de fibra óptica, e obtendo espectros Raman em artérias carótidas e femorais. Os resultados são bastante confiáveis, uma vez que se consiga adequar a técnica espectroscópica às informações necessárias para uma análise precisa da amostra (42).
2.4.1 Histórico da Espectroscopia Raman
O efeito Raman foi verificado experimentalmente em 1928, pelo físico indiano Chandrasekhara Venkata Raman, e publicado na revista Nature em co-autoria com K.S. Krishnan (1928). Raman foi contemplado com o prêmio Nobel de Física por este efeito, em 1930 (43). Após verificar o espalhamento da luz solar na água do oceano, ele notou que se tratava de um fenômeno comum que pode ser visto não somente em gases ou vapores como também em líquidos e estruturas sólidas amorfas e cristalinas.
Com o advento do laser, em 1960, a técnica teve impulso e nas últimas décadas vem sendo utilizada para análises biológicas (22).
Figura 13: O físico C. V. Raman.
2.4.2 Indicações da Espectroscopia Raman
A espectroscopia Raman é apropriada para investigar amostras de quase todos os materiais, incluindo gases, soluções, sólidos e outros meios turvos ou transparentes. O inconveniente do método é a estreita faixa de espectros da maioria dos tecidos e a dependência dos avanços tecnológicos que permitam aperfeiçoar a aquisição dos sinais. Com o advento dos detectores multi-canais (câmeras CCD) refrigerados por nitrogênio líquido, é possível realizar estudos de uma única célula biológica, usando tempos de coleção da ordem de segundos (22).
A espectroscopia Raman no infravermelho próximo (NIRS - near-infrared Raman
spectroscopy) é uma técnica de espectroscopia vibracional usada para determinação de
estrutura molecular e para a identificação e quantificação de materiais. As principais aplicações desta técnica na área químico-farmacêutica tem sido a análise não destrutiva de produtos acabados sólidos, líquidos e gases, e a rápida identificação de amostras (40).
Na área biomédica a caracterização dos tecidos e de condições patológicas utilizando a espectroscopia Raman tem recebido muita atenção da comunidade científica nos últimos anos, visto que este método permite caracterizar a composição molecular do tecido de forma não invasiva (44).
Diversos trabalhos têm sido publicados sobre as aplicações desta técnica descrevendo seu uso para diagnóstico de patologias urológicas (45) câncer gástrico e esofágico (46, 47), avaliações físicas, câncer de pele (40,48), patologias dentárias (49,50). No estudo da ateromatose há diversos trabalhos na área diagnóstica (22, 41, 42, 51, 52), com ênfase em determinar as diferenças espectrais entre os diversos tipos de alterações patológicas e uma classificação baseada em análise discriminante.
2.4.3 O Efeito Raman
Quando a luz incide sobre uma substância qualquer, ela pode ser absorvida ou espalhada (53).
Figura 14: Interação da radiação óptica com o tecido biológico. Fonte: Zângaro (53).
A espectroscopia de infravermelho (IR - infrared) mede a freqüência na qual uma dada amostra absorve uma radiação IR e a intensidade desta absorção. Assim, o espectro do infravermelho representa a identificação de uma amostra com picos de absorção correspondentes à freqüência de vibração entre os átomos constituintes do material (3,7,52). A determinação desta freqüência permite identificar os componentes químicos da amostra visto que cada grupo químico é conhecido por absorver luz em uma determinada freqüência. A intensidade de certa absorção está relacionada com a concentração de um respectivo componente, fornecendo, assim, uma análise quantitativa. Os espectros Raman obtidos podem ser anulados pela fluorescência das impurezas se as amostras forem excitadas com luz visível. A espectroscopia Raman usa radiação laser com energia próxima à do infravermelho para excitar uma dada amostra e medir a luz emitida pela mesma.
A maioria das amostras orgânicas pode ser excitada com um laser na região do infravermelho próximo (40), reduzindo o efeito da fluorescência dos tecidos. Com o uso do sistema da transformada de Fourier obtém-se também a redução do efeito da fluorescência do tecido, promovendo menos degradação fotolítica das amostras que ocorre devido aos longos comprimentos de onda do laser utilizado, e permite assim uso de laser de maior potência (52). Sendo a energia da luz proporcional à freqüência, a mudança de freqüência da luz espalhada inelasticamente é igual à freqüência vibracional da molécula espalhada. Este processo de troca de energia entre a luz incidente e a molécula, resultando em alterações nas características da luz espalhada, é conhecido como efeito Raman (40,52). Pode ser descrito como uma transição da molécula de seu estado fundamental para um estado vibracional excitado.
De forma simplificada pode-se dizer que o espalhamento acontece quando os fótons se chocam com moléculas de uma amostra que pode ser de gás, líquido ou sólido. A molécula é um conjunto de átomos ligados uns aos outros por forças de origem elétrica. Essas ligações podem ser simbolizadas por pequenas “molas” entre os pares de átomos. Um fóton que atinge uma molécula pode ser espalhado, ou seja, ter sua direção modificada. Basicamente, dois tipos de espalhamento ocorrem:
1 – Se a molécula, no choque, se comporta como uma esfera rígida, sem movimentos internos, o fóton espalhado conserva a mesma energia de antes do choque. Este é dito espalhamento elástico (efeito Rayleigh) e é o mais comum quando fótons incidem sobre as moléculas.
2 – Porém a molécula não é uma esfera rígida. Alguns fótons, ao se chocarem com uma molécula, podem dar início a algum movimento dos átomos da molécula, ou seja, o fóton excita a molécula, cedendo a ela parte de sua energia inicial. A energia do fóton após o choque é, portanto, menor que a inicial, pois parte dela foi usada para provocar vibrações na molécula (efeito Stokes). Também pode ocorrer o inverso: o fóton incide sobre uma molécula que já está em estado excitado. Neste caso a molécula se excita ainda mais e depois decai ao nível fundamental, dando mais energia ao fóton (efeito anti-Stokes). Estes efeitos definem o espalhamento inelástico, onde há troca de energia entre o fóton e a molécula, e é o que define o efeito Raman (54).
(a) (b)
Figura 15: O espalhamento (a) elástico e (b) inelástico.
Nota: (a) espalhamento elástico (Rayleigh), onde não há troca de energia mostra o fóton simbolizado em verde. (b) espalhamento inelástico (Raman), onde o fóton (verde) excita a molécula (amarelo) e deixa parte de sua energia.
A luz Raman espalhada pela molécula pode ser coletada por um espectrofotômetro, que identifica as bandas da freqüência de deslocamento Raman. Uma série de picos, cada qual deslocado pela freqüência vibracional própria daquela molécula, compõe o espectro Raman, fornecendo assim a identificação para a molécula que está sendo estudada (52). O espectro Raman é como uma impressão digital da molécula, fornecendo informação bioquímica específica, não encontrada em outras técnicas ópticas (22). O deslocamento Raman é freqüentemente medido em número de onda (cm-1). Na Figura 16 o exemplo de um espectro Raman no infravermelho próximo onde se observa a curva característica da presença de cálcio no tecido estudado. Calcificação 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 800 1000 1200 1400 1600 1800 Intensi dade ( un. ar b.)
Figura 16: Exemplo de espectro Raman de uma amostra de tecido coronariano calcificado. (Laser de excitação: 830 nm, tempo de aquisição: 60s).
As trocas energéticas entre os níveis de energia de um sistema molecular são demonstradas no diagrama abaixo (Diagrama de Jablonski). A transição do nível S0 para o
nível S1, pela excitação do material com radiação ultravioleta e radiação visível, é
acompanhada pela emissão de um fóton. Este fóton emitido é denominado fóton fluorescente. A excitação do material com radiação no infravermelho permite que apenas os níveis vibracionais sejam excitados, evitando-se a ocorrência da fluorescência.
Figura 17: Efeito Raman: excitação com UV, luz visível e infravermelho próximo. Fonte: Adaptado de Manoharan, Wang e Feld (1996) e Hanlon et al. (2000).
Nota: Efeito Raman: excitação utilizando UV, luz visível e infravermelho próximo. S0 - estado
fundamental; S1 e S2 - estados eletrônicos excitados. As linhas horizontais indicam os níveis vibracionais
de energia. νEx indica a freqüência de excitação do laser enquanto que, νR indica a freqüência da luz
espalhada (Raman).
Flutuações espontâneas chamadas ruídos podem impor um limite na transmissão da informação. Referem-se a sinais espúrios ou não desejados presentes no sistema. Sua compreensão á fundamental para entender as limitações impostas num sistema infravermelho (55). A informação necessária para identificar o tecido analisado é a posição correta das bandas Raman, mas se o espectro não for obtido nas condições ideais o ruído estará sempre presente e poderá mascará-lo (56).
Dentre os diferentes ruídos há o ruído de fóton, causado pela flutuação aleatória quando da chegada dos elétrons no eletrodo de coleta (shot noise), o ruído cósmico e o ruído térmico (56,57). Os ruídos shot e térmico podem perturbar e confundir o espectro. Já o ruído cósmico manifesta-se como picos de intensidade elevada e base muito estreita, o que torna fácil seu reconhecimento. Os ruídos exigem uso de uma ferramenta que possa minimizar sua interferência no espectro para uma melhor leitura deste. Técnicas de filtragem digital tais como transformada de Fourier, método de entropia máxima (MEM), filtros digitais do tipo
Butterworth e outros têm sido propostos. A junção de diferentes técnicas de processamento do sinal permite obter melhores resultados (57).
2.4.4 A Instrumentação Raman
Para a excitação do material que se queira analisar espectralmente pode-se utilizar um sistema que forneça radiação monocromática (ex. o laser), um espectrógrafo que faça a dispersão da luz e um detector que converta este sinal luminoso em elétrico, e estudar os movimentos vibracionais das moléculas dos diferentes materiais, permitindo a sua identificação. Deste modo, através desta técnica, é possível determinar as substâncias presentes em tecido normal bem como as alterações patológicas.
Um espectro Raman pode ser obtido dirigindo uma luz monocromática de um laser à amostra que se quer estudar. A luz espalhada é dispersa por uma rede de difração no espectrômetro e seus componentes são captados por um detector que converte a intensidade da luz em sinais elétricos, registrados num programa de computador na forma de espectros.
A parte óptica do detector é composta por filtros de rejeição de comprimentos de onda não desejados e grade holográfica para dispersão da luz, instalados no espectroscópio compacto. A câmera CCD (Charge Coupled Device) do espectrógrafo em equipamentos Raman dispersivos é refrigerada por nitrogênio líquido com a finalidade de reduzir o ruído térmico. Um sistema de interface com um computador registra e analisa os espectros Raman. As Figuras 18 e 19 mostram o diagrama do espectrômetro Raman e o laboratório de espectroscopia Raman da Univap. Na Figura 20 foto do primeiro sistema utilizado por Raman para processar espectros utilizando como fonte a luz solar.
Figura 18: Diagrama esquemático do espectrômetro Raman.
Nota: Diagrama esquemático do espectrômetro Raman no infravermelho próximo. L1 e L2 – lentes.
Figura 19: Equipamento de espectroscopia no IP&D da UNIVAP. A - laser de argônio; B - laser de
Ti:Safira; C - espectrógrafo; D - câmera CCD; E - conjunto de lentes; F - filtro notch; G - porta-amostras. (gentilmente cedido por Silveira Jr.).
Figura 20: Espectrógrafo utilizado por Raman na década de 20.
Fonte: (www.seara.ufc.br/fisica/raman/raman4.htm)
A Figura 21 apresenta como exemplo um espectro Raman normalizado obtido do colesterol indicando as principais bandas das ligações entre os elementos moleculares que o identificam, e a molécula de colesterol (área pontilhada).
Figura 21: Exemplo de espectro Raman no infravermelho-próximo do colesterol indicando as curvas (bandas) das ligações entre os elementos moleculares.
Fonte: Adaptado de Hanlon et al. (2000).
A análise Raman tem como fator complicador a auto-fluorescência e absorbância dos cromóforos (componentes absorvedores) dos tecidos. A fluorescência de ácidos amino-aromáticos (em especial o triptofano), elastina, colágeno, flavoproteinas, etc., dificultam a obtenção dos espectros na região do visível e do ultra-violeta. O sinal Raman fica encoberto pela fluorescência. O uso do laser no infravermelho próximo (NIR) é a alternativa para evitar,
ou pelo menos diminuir, os efeitos da fluorescência e tem a vantagem adicional de evitar a foto-decomposição dos materiais biológicos. As fontes de excitação laser na região do infravermelho próximo, que incluem o laser de Titânio:Safira bombeado por laser de argônio (comprimento de onda (λ) na faixa entre 785 a 830 nm) e o laser diodo (λ mais utilizados em 785 e 830nm), onde a intensidade da fluorescência é bastante fraca, são empregadas para excitação dos materiais (22). O ruído de fundo é também uma limitação importante para obtenção do sinal Raman. Ele ocorre principalmente quando a entrega e coleta da luz se dão através de fibras ópticas e tem a possibilidade de ocultar e até de degradar o sinal coletado, o que ocorre de forma mais significativa quando o tecido estudado é altamente espalhador. O uso de fibras ópticas especiais, em que o sinal Raman da sílica é pequeno (58); a aplicação de filtros ópticos na extremidade dos cabos de fibras (58, 59, 60); a utilização de uma disposição geométrica mais eficiente das fibras, aumentando a coleta do sinal Raman do tecido (58) e diminuindo a coleta da radiação laser de excitação (61) e a diminuição da abertura numérica das fibras de excitação (62) são alternativas que podem ser usadas isoladamente ou em conjunto para a melhoria da relação sinal-ruído do espectro Raman.
2.4.5 Análise Espectral: Reconhecimento de Padrões e Classificação
A potencialidade da técnica Raman está fortemente relacionada à correta análise e interpretação da informação espectral. A posição, largura e intensidade relativa das bandas Raman podem ser utilizadas em um modelo de diagnóstico, classificando as alterações em diferentes categorias histopatológicas de acordo com as diferenças espectrais observadas. Para a melhor exploração das informações presentes no espectro, a análise deve levar em conta todo o espectro, e não apenas bandas proeminentes. Diferenças relativas muito pequenas entre bandas e sobreposições podem passar despercebidas, porém com uma análise criteriosa de todo o espectro pode-se obter resultados interessantes.
A análise espectral atualmente utiliza técnicas computacionais de reconhecimento de padrões. O processo é dividido em etapas bem definidas que incluem a aquisição do espectro, a filtragem de ruídos, segmentação do espectro e subtração do background, a extração das características e a classificação dos espectros.
Atualmente, as formas de análise do conteúdo espectral estão separadas em três classes: análise estatística, análise química e análise morfológica. Na análise estatística, a informação espectral mais relevante de um conjunto de dados é obtida matematicamente, utilizando principalmente a Análise dos Componentes Principais (PCA - Principal Components
Analysis), e os componentes principais podem ser usados para o critério de identificação do
tecido, bem como para a identificação dos componentes bioquímicos mais importantes, desde que cada componente principal é, por definição, um espectro. Na análise química, o espectro Raman do tecido pode ser modelado como uma sobreposição linear dos espectros dos constituintes químicos básicos do tecido, podendo fornecer, desta forma, informação quantitativa sobre cada componente. Isto é importante, pois as doenças, no seu estágio inicial, caracterizam-se por leves mudanças bioquímicas e, portanto, seria possível a detecção precoce. A análise morfológica baseia-se no modelamento da informação espectral dos constituintes microscópicos do tecido, ou seja, das estruturas morfológicas, como células, fibras, depósitos minerais, etc., obtidos via espectroscopia microscópica. Resumindo, todas estas informações podem ser extraídas do espectro Raman, em tempo real, sem a necessidade de destruição da amostra, ou de remoção do tecido (22).
2.4.6 Classificação Espectral Baseada na Análise Estatística Multivariada: PCA
O estudo e interpretação dos resultados de um determinado conjunto de dados muitas vezes envolve a análise de uma infinidade de variáveis, constituindo-se desta forma um trabalho que, além de complicado e demorado, é suscetível a interpretações errôneas e a perda de informações relevantes. Desta forma, o emprego de métodos multivariados, tais como a Análise de Componentes Principais (PCA) destaca-se como uma importante ferramenta para o tratamento de um grande número de dados (63, 64).
O objetivo principal da PCA é a obtenção de um pequeno número de combinações lineares (componentes principais) de um conjunto de variáveis, que retenham um máximo da informação contida nas variáveis originais. Freqüentemente, um pequeno número de componentes pode ser usado, em lugar das variáveis originais, nas análises de regressões, análises de grupamentos, etc. Os componentes podem ser extraídos na ordem do mais explicativo para o menos explicativo. Teoricamente o número de componentes é sempre igual ao número de variáveis. Entretanto, alguns poucos componentes são responsáveis por grande parte da explicação total. Em um conjunto de dados espectrais, normalmente uma série de condições alteram o perfil de cada um dos espectros. Fatores como a diferença nos constituintes das amostras, o ruído de fundo, o ruído de fóton, variações no espectrômetro, o manuseio da amostra, entre outros, afetam a aparência do espectro final. Mesmo com todas estas variações e alterações acontecendo simultaneamente, somente poucas variáveis independentes são as responsáveis pelas diferenças espectrais observadas. As variáveis que se
repetem em todos os espectros, ou seja, apresentam alta correlação, possuem redundância de informação. Desta forma, pode-se utilizar ferramentas para simplificar a informação redundante, ou seja, reduzir o número de variáveis para facilitar a análise. Uma destas ferramentas é a técnica PCA (19, 63, 65, 66). Por causa da minimização no número de variáveis necessárias à caracterização do espectro, esta técnica é freqüentemente denominada de técnica de compressão de dados.
A técnica PCA utiliza um conjunto de espectros de treinamento, os decompõe em espectros matemáticos, chamados de fatores ou componentes principais (PC), que representam as variações que mais ocorrem em todos os espectros. Um conjunto de coeficientes de escala, os escores (ES), são calculados para cada componente principal. Quando os componentes principais são multiplicados pelos escores e então somados, temos a reconstrução do espectro original. Portanto, conhecendo-se os vetores dos componentes principais, podemos estabelecer a importância de cada um deles na formação do espectro de uma amostra desconhecida que se queira classificar. Podemos, então, utilizar esta informação para a classificação dos espectros dentro de categorias pré-determinadas. Uma análise mais detalhada do PCA poderá ser encontrada em Silveira Jr. (22).
2.4.7 Classificação Espectral Baseada nos Componentes Bioquímicos
Estudos já publicados têm mostrado que a análise bioquímica por espectroscopia Raman pode ser usada como base de um algoritmo diagnóstico que classifique acuradamente os tecidos em normais e patológicos, através do conhecimento dos espectros dos componentes bioquímicos básicos (basais) que ocorrem nestes tecidos. Os tecidos arteriais poderiam ser então classificados em não aterosclerótico, aterosclerótico não calcificado e aterosclerótico calcificado (19, 22, 32, 51, 52). A composição bioquímica das estruturas morfológicas microscópicas pode ser determinada a partir da combinação dos espectros Raman basais dos constituintes básicos dos tecidos, obtidos de estruturas isoladas, descrita no estudo publicado por Buschman et al. (19). Tal estudo concluiu que o espectro Raman varia pouco de estrutura para estrutura ou de artéria para artéria, o que permite que um banco de espectros obtido dos componentes bioquímicos basais seja usado como base para realizar uma comparação relativa da morfologia dos tecidos normais e ateroscleróticos.
A técnica da classificação espectral baseada nos espectros Raman utilizando os componentes bioquímicos também já foi descrita na identificação de patologias da bexiga e próstata em estudo pioneiro neste segmento publicado em 2007 por Stone et al. (76). Neste estudo, os autores utilizaram os espectros obtidos dos diferentes constituintes bioquímicos identificados em patologias da bexiga e próstata para formar um banco de espectros. Amostras biológicas de diferentes estágios histológicos destas patologias foram coletadas dos pacientes por b iópsia. Os espectros dos constituintes bioquímicos foram sobrepostos aos espectros das amostras biológicas e os autores concluíram que é possível utilizar a espectroscopia Raman para obter-se informação da base bioquímica das diferentes patologias da bexiga e próstata a partir da classificação espectral dos constituintes bioquímicos da doença.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Aprovação no Comitê de Ética
O projeto teve a sua execução aprovada pelo Comitê de Ética da Universidade Comunitária de Chapecó – SC, para obter as amostras para experimentação utilizando espectroscopia Raman. Registro número: CEP/045/07.
3.2 Instrumentação Raman
Para o desenvolvimento deste trabalho de pesquisa foi utilizado um espectrômetro Raman dispersivo no infravermelho próximo (Figuras 18 e 19) descrito por Silveira Jr. et al. (22). O sistema utiliza um laser de diodo com λ = 830 nm(Lepton IV Turnkey Series of Diode Lasers, Micro Laser Systems – USA) com potência de 70mW. Os diodos laseres são dispositivos eletrônicos relativamente simples e de custo reduzido, sendo que os mais utilizados possuem como meio ativo o GaA1As com comprimento de onda entre 650-850nm, com potências variando entre 10 e 60mW.
O sistema também pode utilizar um laser de Titânio:safira (Spectra Physics, CA, USA, modelo 3900S) sintonizado em 830nm bombeado por um laser de íon de argônio de 6W (Spectra Physics, CA, USA, modelo Stabilite 2017), cujo feixe laser de saída é composto de diversas linhas espectrais discretas, sendo as mais importantes em 488 e 514 nm. O cristal de Titânio:safira apresenta alta absorção em uma faixa espectral relativamente larga, entre 450 a 550 nm, fazendo do laser de argônio a fonte ideal de bombeamento para este laser (68). Um sistema óptico composto por um filtro passa-banda holográfico (Kaiser Optical Systems, MI, USA, modelo HLBF 830-1.0) para o comprimento de onda de 830 nm, dois prismas de ângulo reto de sílica fundida, um filtro espacial (pinhole) de alumínio anodizado com abertura de 2 mm e uma lente de distância focal de 100 mm foram usados para filtragem, direcionamento e focalização do feixe laser no porta amostras. A opção para o uso do laser de diodo em alguns experimentos ocorre em função da manutenção periódica a que o laser de argônio é submetido, sendo o laser de diodo seu substituto neste período de manutenção.
Cada amostra era colocada em um porta-amostras constituído basicamente por um suporte de alumínio fosco medindo 10 mm de largura por 20 mm de altura, adaptado a um posicionador com deslocamento micrométrico nos 3 eixos (x, y, z). Este porta-amostras foi arranjado de forma a fazer um ângulo de aproximadamente 45° com relação ao feixe laser
