Define-se a sensibilidade de um teste de diagnóstico como a porcentagem de amostras com uma doença específica que apresentam um resultado de teste positivo. A especificidade está definida como a porcentagem de amostras sem a doença que tem um resultado de teste negativo. Os índices de sensibilidade e especificidade, descritos por WEISS (1986), foram calculados para os algoritmos de diagnóstico, para cada uma das categorias da análise histopatológica. Os índices sensibilidade e especificidade para três categorias de diagnóstico foram calculados a partir dos dados contidos na Tabela 4:
Tabela 4: Sensibilidade e especificidade do modelo básico. Diagnóstico Raman (% sensibilidade/especificidade) Diagnóstico Histológico CO x CML CO x CLG CO x CA CO x AD CML x CLG CML x CA CML x AD CLG x CA CLG x AD CA x AD N (48) 75/87 77/94 75/77 67/90 80/85 75/89 77/94 73/87 75/87 77/87 A (47) 72/92 74/94 56/93 89/89 62/88 85/81 79/81 83/80 77/81 83/83 C (16) 88/85 88/82 100/85 69/87 70/83 100/100 88/93 100/100 94/96 100/100
Nota: Sensibilidade e especificidade do modelo básico aplicando cálculo da distância Euclidiana. Comparativo entre espectro Raman e histologia. N – tecido normal; A – tecido ateromatoso; C – tecido calcificado.
5 DISCUSSÃO
O uso da espectroscopia Raman como método diagnóstico está em desenvolvimento nas mais diversas áreas biomédicas, com grande aplicação na área de Odontologia (75,76), patologias dentárias (49, 50), patologias urológicas (45) câncer gástrico e esofágico (47, 78), avaliações físicas (40) e câncer de pele (48). Mais recentemente, a técnica tem sido usada na identificação da doença aterosclerótica visando a construção de um método diagnóstico.
A definição e classificação das lesões ateromatosas foi descrita de forma didática em publicação da American Heart Association e uma classificação modificada foi proposta por Virmani em 2000, a fim de incluir nesta uma subclassificação contemplando o diagnóstico das placas com risco iminente de ruptura, as placas vulneráveis (8). Concomitantemente, a ciência tem buscado, através do uso do laser, métodos de diagnóstico para identificar bioquimicamente a composição da doença em questão. Assim, a espectroscopia Raman se apresenta como um método óptico capaz de identificar os tecidos de forma não invasiva, sem requerer biópsia ou homogeneização dos tecidos (20,22,26,32,51,52). Os estudos até agora publicados utilizaram diferentes algoritmos (79), entre eles a PCA, onde as componentes espectrais (ou bases espectrais) são obtidas através da variância contida nos espectros Raman, extraídas matematicamente sem nenhum ou com pouco conhecimento prévio da composição do tecido (22), o modelo bioquímico utilizando a LSM (Least Square Minimization), que traz a vantagem da identificação da composição bioquímica contida no espectro Raman, usando espectros dos constituintes bioquímicos basais extraídos dos tecidos arteriais e obtendo-se os coeficientes correspondentes à participação relativa dos constituintes bioquímicos do tecido (ou fração relativa de peso) em cada espectro real (19). A espectroscopia Raman coleta informação relativa às vibrações das ligações moleculares, permitindo de forma direta quantificar a composição química dos tecidos biológicos (26).
A arquitetura e a composição química da artéria normal e da doença aterosclerótica tem correlação estabelecida com a espectroscopia Raman (22, 44). Com espessura de 50 a 300µm na camada íntima, 500 a 600 µm camada média e cerca de 100 µm na adventícia (44), a parede arterial coronária e aórtica permitem o estudo espectroscópico de suas três camadas com precisão química e morfológica (44), visto que a espectroscopia Raman com feixe laser (830 nm) permite a realização da biópsia óptica com até 1,5 mm de profundidade e abrangendo uma área de até 4 mm3 (32). As bandas Raman são específicas para cada molécula de acordo com as ligações químicas correspondentes (22, 26, 32, 44, 52).
No estudo aqui proposto, inicialmente buscou-se desenvolver um banco de dados para montar um modelo que permita identificar a presença e o grau de severidade da doença ateromatosa através da inspeção visual do espectro, da intensidade e posição de suas bandas, a fim de correlacionar algumas variáveis espectrais com o tipo de tecido. Foram verificadas bandas relacionadas a proteínas nos tecidos normais, lípides e colesterol em tecidos ateroscleróticos sem calcificação e cristais de cálcio em espectros de placa calcificada.
Posteriormente, espectros basais obtidos dos componentes bioquímicos mais importantes, tais como cristais de colesterol, tecido muscular liso, tecido colagenoso, lesões calcificadas e adipócitos da adventícia foram processados e comparados com os estudos na literatura. Observou-se correspondência adequada do modelo processado com os dados da literatura. Então os espectros basais foram confrontados com os espectros dos tecidos e a quantidade relativa de cada constituinte foi determinada. Os cinco modelos espectrais básicos dos constituintes CO, CLG, CML, AD, CA, foram multiplicados entre si resultando em 10 combinações, conforme Tabela 2. Esta combinação de espectros foi utilizada para identificar as substancias predominantes em cada amostra de coronárias nos 111 espectros coletados destas.
A distância Euclidiana permitiu a separação em artéria não-aterosclerótica (N), aterosclerótica não calcificada (A) e aterosclerótica calcificada (C). A sensibilidade e especificidade calculadas para o método permitiram definir que utilizando o cálculo da distancia Euclidiana é possível obter para tecidos coronarianos não ateromatosos (N) índice de sensibilidade 80% com a combinação espectral de CML x CLG e especificidade de 94% com combinação CO x CLG e CML x AD (Tabela 4). Para o tecido ateromatoso (A), foi obtida sensibilidade de 89% com combinação espectral de CO x AD e especificidade de 94% para combinação CLG x AD. E finalmente para tecido calcificado (C) sensibilidade e especificidade de 100% para combinações onde o espectro do cálcio esteja presente (CA x CML, CA x CLG e CA x AD).
Em 2001, Silveira Jr. estudou a espectroscopia Raman na doença ateromatosa e utilizou o algoritmo baseado nas características espectrais da PCA para análise e classificação dos espectros nos grupos histológicos N, A e C. Neste estudo foram observadas sensibilidade e especificidade diagnóstica máximas para lesões calcificadas (100%). Para placas sem calcificação, o algoritmo apresentou sensibilidade alta de 87% e especificidade alta de 84%. Para artéria não aterosclerótica, Silveira Jr. encontrou sensibilidade relativamente alta de 79% e especificidade bastante alta de 90% (22). Comparando estes resultados da literatura utilizando o algoritmo PCA com os resultados obtidos no método aqui proposto, que utilizou
os constituintes bioquímicos e o cálculo por distância Euclidiana é possível observar que ambos apresentam sensibilidade e especificidade significativas para diagnóstico da doença ateromatosa sendo que, para a técnica utilizando a combinação dos constituintes bioquímicos proposta, observa-se sensibilidade e especificidade maior que o algoritmo PCA para diagnóstico de artéria não aterosclerótica e aterosclerótica não calcificada.
As combinações de componentes bioquímicos onde estava presente o espectro do constituinte colesterol tiveram boa correlação diagnóstica para classificar os tecidos normais e ateromatosos, e quando combinado ao cálcio foi sensível em 100% para lesões calcificadas. O colesterol apresenta bandas Raman característicasem 1668 cm-1 (ligações C=C), 1443, 1328 e 1264 cm-1 (ligações CH2 e CH3) e 1176 e 1085 cm-1 (ligações C-C). Picos abaixo de 1000 cm-1 são atribuíveis a colesterol não esterificado (71, 72, 73). Está presente nas lesões ateromatosas tanto na forma esterificada como não esterificada.
Tabela 5: Sensibilidade e especificidade (xx/xx) da combinação do espectro de colesterol
Diagnóstico Histológico CO x CML CO x CLG CO x CA CO x AD N (total: 48) 75/87 77/94 75/77 67/90 A (total: 47) 72/92 74/94 56/93 89/89 C (total: 16) 88/85 88/82 100/85 69/87
O tecido muscular liso é composto predominante na camada média da artéria normal, que é a camada mais espessa. Presente também nas lesões ateromatosas, sofre processo de apoptose na instabilização da placa quando da formação do núcleo necrótico, onde algumas células migram para a camada íntima. Por ser produtor de colágeno, quando sofre redução de seu conteúdo na área lesada também ocasiona a redução do conteúdo de colágeno na placa, sendo que sua quantificação poderá ser uma das formas de identificar a vulnerabilidade da placa ateromatosa (17, 18). O tecido muscular liso apresentou características espectrais proeminentes em 1664 e 1268 cm-1 (vibrações da amida I e III respectivamente) (73), 853, 940, 1034, 1336 e 1451 cm-1 (vibrações das ligações C-C ou C-H)(73)e 1004 cm-1 (vibração do anel da fenilalanina) (74), à semelhança do colágeno. As principais diferenças entre o espectro das CML e CLG são a variações na intensidade dos picos de fenilalanina (1104 cm-1) e desmosina/isodesmosina (1336 e 1104 cm-1) e amida III (1268 cm-1) (73). O espectro de
CML associado ao colesterol (CO) especificou 92% dos tecidos ateromatosos e, associado ao espectro de adipócitos, especificou 94% dos tecidos normais.
Tabela 6: Sensibilidade e especificidade (xx/xx) da combinação do espectro de musculares lisas.
Diagnóstico Raman Diagnóstico Histológico CO x CML CML x CLG CML x CA CML x AD N (total: 48) 75/87 80/85 75/89 77/94 A (total: 47) 72/92 62/88 85/81 79/81 C (total: 16) 88/85 70/83 100/100 88/93
O espectro do colágeno (CO) tem forte contribuição da hidroxiprolina (855 e 933 cm-1) específica para colágeno (72, 74). As vibrações atribuíveis a amida I e III (1664 e 1268 cm-1) e fenilalanina (1004cm-1) também estão presentes, sendo componentes da elastina e colágeno (72, 73, 74).O intenso pico entre 1440-1455 cm-1 representa ligações CH2 e CH3 atribuíveis a proteínas. Fibras colágenas são encontradas nas várias camadas das artérias, e na placa ateromatosa assume particular importância visto que aqui há redução da síntese de colágeno, elevada atividade das colagenases e apoptose de células musculares lisas. Sua quantificação implica no grau de vulnerabilidade da lesão (17, 18, 25). A combinação dos espectros de colágeno e de colesterol especificou 94% das amostras não ateromatosas e ateromatosas não calcificadas.
Tabela 7: Sensibilidade e especificidade (xx/xx) da combinação do espectro de colágeno.
Diagnóstico Raman Diagnóstico Histológico CLG x CO CLG x CML CLG x CA CLG x AD N (total: 48) 77/94 80/85 73/87 75/87 A (total: 47) 74/94 62/88 83/80 77/81 C (total: 16) 88/82 70/83 100/100 94/96
O tecido calcificado tem seus espectros dominados por bandas referentes à hidroxiapatita de cálcio (19, 22) com pequenas contribuições de colágeno, triglicerídeos e
apatita carbonatada. O intenso pico em 961cm-1 e outro de menor expressão em torno de 1080
cm-1, correspondente a apatita carbonatada predominam e identificam com máxima
sensibilidade e especificidade as lesões calcificadas (100%), já estando consagrado na literatura como característico da doença ateromatosa com calcificação (22, 24, 32). O estudo espectroscópico pode ser mais específico nos resultados da biópsia do tecido do que a histologia, visto que abrange área maior do que os cortes histológicos e detecta a presença de quantidades mínimas de cálcio, nem sempre possível pela histologia, uma vez que os cortes histológicos são da ordem de micrometros, enquanto a espectroscopia pode detectar o cálcio num volume de até 4 mm³ (19, 32).
Tabela 8: Sensibilidade e especificidade (xx/xx) da combinação do espectro de cálcio.
Diagnóstico Raman Diagnóstico Histológico CA x CLG CA x CML CA x CO CA x AD N (total: 48) 73/87 75/89 75/77 77/87 A (total: 47) 83/80 85/81 56/93 83/83 C (total: 16) 100/100 100/100 100/85 100/100
A presença de adipócitos nas artérias está evidente na camada adventícia. Os picos
dominantes (1747, 1440 e 1301 cm-1) (71, 72) em conjunto, indicam a presença de
triglicerídeos, que não são detectáveis no núcleo necrótico (19) onde há predominância de células espumosas e inflamatórias. A presença das bandas Raman indicativas de adipócitos pode ocorrer em todos os espectros onde a espessura da parede arterial não seja superior a 1 mm, que é a capacidade de penetração do feixe laser no tecido.
Tabela 9: Sensibilidade e especificidade (xx/xx) da combinação do espectro de adipócitos.
Diagnóstico Raman Diagnóstico Histológico AD x CO AD x CML AD x CLG AD x CA N (total: 48) 67/90 77/94 75/87 77/87 A (total: 47) 89/89 79/81 77/81 83/83 C (total: 16) 69/87 88/93 94/96 100/100
Nos tecidos normais, a maior sensibilidade ocorreu na presença de CLGxCML (80%) e a maior especificidade (94%) com CMLxAD e COxCLG. Estes dados são explicados pela penetração do laser na parede arterial (até 1,5mm da superfície) (32) sendo que a parede arterial normal, cuja composição histológica já foi descrita acima, tem na composição de seu espectro bandas referentes à amida I e III (1669 e 1253/1272 cm-1) presentes no espectro das CML e ligações C=C (1650 cm-1) que aparecem devido ao acúmulo de lípides intracelulares, e hidroxiprolina (855 e 933 cm-1) (44), cujas bandas estão presentes nas fibras de colágeno (20). Este dado explica a correlação CLGxCO. As células musculares lisas (CML) e o colágeno (CLG) são os componentes predominantes dos tecidos normais. Na artéria não aterosclerótica a íntima é fina e, portanto, a contribuição da camada adventícia (rica em tecido adiposo) para o tecido examinado pela espectroscopia é significativa, porque a luz atravessa toda a parede (20) o que explica a contribuição de ADxCML (CML na camada média).
No tecido ateromatoso onde a íntima pode ser espessa e média contem o núcleo gorduroso, a contribuição dos adipócitos pode diminuir, porém o colesterol é um componente expressivo, devido ao acúmulo de lipídios no núcleo da placa ateromatosa (20). Neste trabalho, a maior sensibilidade para identificar o tecido ateromatoso foi identificada com COxAD (89%), seguida de CMLxCA (85%). A maior especificidade (94%) foi obtida com CLGxCO, o que corrobora os dados da histologia onde há predominância de fibras de colágeno e cristais de colesterol (20, 32, 44). Uma vez que a penetração do laser em 850 nm na parede da artéria é cerca de 1,5 mm no ponto de incidência e cerca de 4 mm² de área (32), para o mesmo volume de amostra um patologista teria que fazer centenas de amostras de 5µm de espessura para encontrar os mesmos componentes que aparecem no espectro Raman. A presença de pequenas quantidades de lipídios e sais de cálcio seria difícil de localizar em cortes histológicos (32). Tal afirmação explica as discordâncias na classificação histológica versus Raman, bem observadas nos gráficos de separação por cálculo da distância Euclidiana. No tecido calcificado há excelente sensibilidade (100%) para todas as análises que incluíram o espectro do cálcio (CLGxCA, COxCA, CMLxCA, ADxCA) e especificidade (100%) para CMLxCA, CaxCLG, CAxAD, porém mantendo especificidade próximo de 100% em todos os parâmetros que utilizaram sais de cálcio associado. O espectro Raman das placas ateromatosas calcificadas são dominados pela contribuição dos sais de cálcio (19, 32, 51) com bandas proeminentes em 961 cm-1.
A sobreposição dos espectros dos constituintes bioquímicos básicos, obtidos de forma simplificada para este estudo, utilizando cinco componentes que mais ocorrem nas paredes
arteriais, com os espectros Raman obtidos das amostras de coronárias, permitiu identificar de forma adequada a maioria das amostras de coronárias quanto à presença de doença ateromatosa, como também diferenciar a doença ateromatosa em não-calcificada e calcificada. Os dados de literatura, melhor suportados nos estudos publicados por Buschman et al. (19, 20) têm boa correlação com o trabalho aqui proposto. No trabalho de Buschman, os componentes que mais diferenciaram a artéria normal da aterosclerótica foram cristais de colesterol e minerais de cálcio, que predominam no tecido ateromatoso e ateromatoso calcificado respectivamente. No tecido normal predominou a presença de adipócitos, colágeno, e celulas musculares lisas. Buschman obteve 94% de amostras corretamente classificadas com o modelo proposto.Os dados corroboram com a escolha aqui proposta, dos componentes bioquímicos CO, CA, AD, CLG e CML.
O estudo dos constituintes da parede arterial e das lesões ateromatosas é um passo importante para, uma vez identificada a doença, definir os parâmetros que indicarão o risco iminente de ruptura da placa, o que ocasiona eventos graves, potencialmente fatais, como o infarto agudo do miocárdio e a morte súbita.
A espectroscopia Raman, a exemplo de trabalhos já referendados, emerge como diagnóstico eficaz, não destrutivo, para identificação da composição dos tecidos in situ e o desenvolvimento de fibra óptica adequada para alcançar os sítios acometidos por patologia nas artérias coronárias poderá proporcionar grande avanço na compreensão do processo da doença, permitindo diagnóstico rápido e seguro e tratamento adequado e eficaz do paciente, de forma particular os portadores de lesões instáveis com alto risco de ruptura (80).
O resultado deste trabalho permite estabelecer correlação diagnóstica da espectroscopia Raman com a doença ateromatosa, validada pela histologia. Foi comprovado que com modelos simplificados é possível montar um algoritmo de identificação, com boa correlação com o resultado histológico e a literatura disponível.
Nos dados apresentados não há suporte suficiente para inferir vulnerabilidade da placa ateromatosa, visto que a leitura da espessura da capa fibrosa e do núcleo necrótico ainda não foi realizada e não foi obtido material isolado de células espumosas para a obtenção do espectro basal e a conseqüente quantificação.
5.1 Direções Futuras
Em função dos resultados obtidos neste trabalho, os próximos passos incluem a identificação da espessura da capa fibrosa e do núcleo necrótico, e a inclusão do espectro das
células espumosas, a fim de tornar o modelo capaz de identificar os aspectos de vulnerabilidade da placa ateromatosa, e sua correlação com as bandas Raman estudadas. O estudo seguinte pretende estabelecer a correlação da intensidade relativa dos constituintes no espectro com a vulnerabilidade da placa ateromatosa.
6 CONCLUSÕES
A análise baseada nos espectros Raman das artérias coronárias humanas in vitro utilizando os espectros basais dos constituintes dos tecidos arteriais permitiu concluir que:
- Os espectros Raman de tecidos normais, placas ateroscleróticas sem e com calcificação apresentam diferenças espectrais significativas, indicando a diferença de composição observável através das posições e larguras das bandas vibracionais Raman. Tecidos normais apresentaram bandas características de proteínas estruturais e células musculares lisas, enquanto que tecidos ateromatosos apresentaram características de adipócitos, colesterol e cristais de cálcio.
- Com a construção de um modelo simplificado, baseado nos espectros dos constituintes básicos presentes nos tecidos arteriais normais e na doença ateromatosa, foi possível identificar e classificar corretamente as amostras estudadas em normal, ateromatosa não calcificada e ateromatosa calcificada, com alta sensibilidade e especificidade.
- O espectro Raman do cálcio tem excelente sensibilidade e especificidade para o diagnóstico espectral das lesões calcificadas. As lesões não calcificadas e os tecidos arteriais normais são corretamente classificados com a combinação dos modelos espectrais Colesterol x Colágeno, Colesterol x Cálcio, Colesterol x Células Musculares Lisas e Colesterol x Adipócitos com especificidade acima de 90%.
- O modelo simplificado proposto tem alcance diagnóstico, sendo válido para identificação da doença ateromatosa com alta correlação com a literatura. Os resultados indicaram a possibilidade de avaliação da composição da placa utilizando os espectros Raman de poucos elementos bioquímicos (os mais importantes) presentes na lesão, simplificando a rotina matemática para uma ferramenta de diagnóstico na doença ateromatosa baseada na interpretação dos espectros Raman.
REFERÊNCIAS
1 –YUSUF, S., et al. Global burden of cardiovascular diseases, I: general considerations, the epidemiologic transition, risk factors, and impact of urbanization. Circulation., v. 104, p.2746 –2753, 2001.
2 – MYERBURG, R. J. et al. Frequency of sudden cardiac death and profiles of risk. Am J
Cardiol., v.80, p.10F–19F, 1997.
3 – YU, N.T., et al. Single-crystal Raman spectra of native insulin. Structures of insulin fibrils, glucagon fibrils, and intact calf lens. Arch Biochem Biophys., v. 160, n.2, p.614–622, 1974.
4 – ROSS, R.; GLOMSET, J.A. The pathogenesis of atherosclerosis (Second of two Parts).
New Engl J Med., v.295, p. 420-425, 1976.
5 – XAVIER, Hermes T. Manual de dislipidemias e cardiometabolismo. São Paulo: BBS Editora, 2004. 215p.
6 – LIBBY, P. Aterosclerose: um novo ponto de vista. Scientific Americam Brasil, n.3, p.55-63, 2002.
7 – VAN DE POLL, S.W.E., et al. Raman spectroscopic Evaluation of the Effects of diet and lipid-lowering therapy on atherosclerotic plaque development in mice. Arterioscl. Thromb.
Vasc. Biol., v. 21, n.10, 1630-1635, 2001.
8 – NAGHAVI, Morteza, et al. From Vulnerable Plaque to Vulnerable Patient A Call for New Definitions and Risk Assessment Strategies: Part I. Circulation, v.108, p.1664-1672, 2003. 9 – KOLODGIE, F.D., et al. The thin-cap fibroatheroma: a type of vulnerable plaque: the major precursor lesion to acute coronary syndromes. Curr Opin Cardiol., v.16, p.285–292, 2001.
10 – RUBERG, Frederick L.; LEOPOLD, Jane A.; LOSCALZO, Joseph. Atherothrombosis Plaque instability and thrombogenesis. Progress in Cardiovascular Diseases, v. 44, n. 5, p. 381-394, 2002.
11 – KROLL, M.; SULLIVAN, R. Mechanisms of platelet activation. In: LOSCALZO, J.A.; SCHAFER, A. (eds). Thrombosis and Hemorrhage. Philadelphia PA: Williams and
Wilkins, 1998, p. 261-291.
12 – LEVIN, D.C.; FALLON, J.T: Significance of the angiographic morphology of localized coronary stenosis: Histopathologic correlations. Circulation, v.66, p.316-320, 1982.
13 – DAVIES, M.J.; THOMAS. A: Thrombosis and acute coronary- artery lesions in sudden cardiac ischemic death. N Engl J Med., v.310, p.1137-1140, 1984.
14 - FALK E: Plaque rupture with severe pre-existing stenosis precipitating coronary thrombosis. Characteristics of coronary atherosclerotic plaques underlying fatal occlusive thrombi. Br Heart J, v.50, p.127-134, 1983.
15 – CONSTANTINIDES, P. Atherosclerosis--A general survey and synthesis. Surv Synth
Pathol Res., v.3, p.477-498, 1984
16 – SHAH, P.K. Pathophysiology of Coronary Thrombosis: Role of Plaque Rupture and Plaque Erosion. Progress in Cardiovascular Diseases, v. 44, n. 5, p 357-368, 2002. 17 – VIRMANI, R., et al. Pathology of the Unstable Plaque. Progress in Cardiovascular
Diseases, v. 44, n. 5, p 349-356, 2002.
18 – LIBBY, P. Molecular Bases of the Acute Coronary Syndromes. Circulation, v.91, p.2844-2850, 1995.
19 – BUSCHMAN, H. P. et al. Raman microscopy of human coronary atherosclerosis: Biochemical assessment of cellular and extra cellular morphologic structures in situ.
Cardiovasc Pathol., v.10, p. 69-82, 2001.
20 – BUSCHMAN, H. P. et al. Diagnosis of human coronary atherosclerosis by morphology-based Raman spectroscopy. Cardiovasc Pathol., v.10, p. 59-68, 2001.
21 – MATSUDA, Y.; KRAMER, J. R.; MATSUDA, M. Progression and regression of coronary artery disease-linkage of clinical, pathologic, and angiographic findings. Clin
Cardiol., v.18, p.412-417, 1995.
22 - SILVEIRA JÚNIOR, Landulfo. Correlação entre a técnica de espectroscopia Raman
e a análise histopatológica das placas ateromatosas em artérias coronárias humanas. São
Paulo, 2001 109 f. Tese (doutorado) - Faculdade de Medicina. Universidade de São Paulo, 2001.
23 – BRENNAN III, J.F. Near infrared Raman spectroscopy for human artery
histochemistry and histopathology. Cambridge (MA), 1995. Tese (doutorado).
Massachusetts Institute of technology, 1995.
24 – BRENNAN III, J.F., et al. Determination of human coronary artery composition by Raman spectroscopy. Circulation, v.96, p.99-105, 1997.
25 – MACNEIL, B.D., et al. Intravascular Modalities for detection of vulnerable plaque: current status. Arteriosclerosis, Thrombosis Vasc. Biology, v.23, p.1333-1342, 2003. 26 – MOTZ, J.T, et al. In vivo Raman spectral pathology of human atherosclerosis and vulnerable plaque. Journal of Biomedical Optics, v.11, n.2, p. 021003, 2006.
27 – VIRMANI, R., et al. Pathology of the Unstable Plaque. Progress in Cardiovascular
Diseases, v. 44, n. 5, p. 349-356, 2002.
28 – NAGHAVI, M. et al. From Vulnerable Plaque to Vulnerable Patient: A Call for New Definitions and Risk Assessment Strategies: Part II. Circulation, v.108, p.1664-1672, 2003.
29 – DEGUCHI, J.O. et al. Matrix metalloproteinase-13/collagenase-3 deletion promotes collagen accumulation and organization in mouse atherosclerotic plaques. Circulation, v.112, p.2708–2715, 2005.
30 – GLAGOV, S., et al. Compensatory enlargement of human atherosclerotic coronary arteries. N. Engl. J. Med., v.316, p.1371–1375, 1987.
31 – VARNAVA, A.M.; MILLS, P.G.; DAVIES, M.J. Relation Between Coronary Artery Remodeling and Plaque Vulnerability. Circulation, v. 105, p.939-943, 2002.
32 – ROMER, T.J. et al. Histopathology of human coronary atherosclerosis by quantifying its chemical composition with Raman spectroscopy. Circulation, v. 97, n.9, p.878-885, 1998. 33 – TOBIS, M.J., et al. Intravascular ultrasound cross-sectional arterial imaging before and after balloon. angioplasty in vitro. Circulation, v. 80, p.873-882, 1989.
34 – NISHIMURA, R.A., et al. Intravascular ultrasound imaging: in vitro validation and pathologic correlation. J Am Coll Cardiol., v.16, p.145-154, 1990;