O sistema de expressão induzível por tetraciclina é o sistema de operador naturalmente encontrado em bactérias Gram-negativas resistentes ao antibiótico de mesmo nome. Esse sistema induzível foi desenvolvido por dois pesquisadores da Universidade de Heidelberg em 1992. Hermann Bujard e Manfred Gossen foram os primeiros pesquisadores que conseguiram isolar a sequência genética do promotor e operador de resistência à tetraciclina de bactérias Escherichia coli e utiliza-lo em células eucarióticas (Gossen, 1992).
Os dois sistemas de expressão induzível mais comuns disponíveis hoje são baseados nesse primeiro modelo descrito, mas que foram modificados para serem mais efetivos em células de mamíferos. Esses dois sistemas são denominados de Tet-On e Tet-Off e como o nome mesmo sugere ligam e desligam a expressão do gene de interesse de acordo com a presença ou ausência da tetraciclina, respectivamente.
O sistema Tet-Off baseia-se em uma proteína transativadora (tTA) fusionada à uma proteína repressora (TetR). A proteína tTA naturalmente possui afinidade a ligar-se ao DNA, mais especificamente na região operadora TetO que é associada à um promotor viral mínimo CMV, sendo esse complexo denominado pTRE (Tetracycline Transactivator Element). Dessa forma sempre a proteína TetR liga-se às regiões TetO presentes no pTRE resultando na expressão do gene downstream à ele. Na presença de tetraciclina (ou o seu análogo mais estável doxiciclina) ocorre uma ligação entre o antibiótico e o tTA que modifica a estrutura da proteína tornando-a incapaz de ligar-se ao promotor pTRE, e assim desativando a expressão gênica (Berens, 2003).
O sistema Tet-On funciona de maneira muito similar ao descrito, porém de maneira oposta. Enquanto no sistema Tet-Off o complexo TetR liga-se espontaneamente à região TetO, no sistema Tet-On houve uma modificação na estrutura da proteína transativadora tTA (agora chamada rTA e rTetR) que se liga à região TetO somente quando ligada à doxiciclina, ou seja, a ativação da expressão ocorre somente na presença do antibiótico. Apesar da similaridade entre os dois sistemas, muitas vezes o sistema Tet-On é preferível, pois na ausência de
doxicilcina a expressão do gene de interesse é praticamente zero, enquanto no sistema Tet-Off, na presença de doxiciclina a desativação do gene de interesse não é total (Berens, 2003). A esquematização dos sistemas de expressão podem ser observados na figura 31.
Figura 31- Ilustração esquemática dos sistemas de expressão induzíveis por tetraciclina ou o seu análogo doxiciclina. (A) O sistema Tet-Off é caracterizado pela interrupção da expressão do gene de interesse (vermelho) quando na presença de doxiciclina (DOX). O gene transativador TetR (amarelo) é expresso de maneira constitutiva produzindo proteínas sensíveis à doxiciclina. Na ausência do antibiótico a proteína TetR possui afinidade pelas regiões TetO (azul) presente dentro do promotor pTRE (verde) ativando assim a expressão do gene de interesse. Na presença de doxiciclina a proteína TetR perde a afinidade pelo DNA interrompendo assim a expressão do gene de interesse. (B) O sistema Tet-On é similiar ao Tet-Off, porém funcionando de maneira oposta. O gene transativador rTetR (amarelo) produz proteínas sensíveis à doxiciclina. Na ausência do antibiótico a proteína rTetR não possui afinidade pelas regiões TetO (azul) presente dentro do promotor pTRE (verde) não ativando assim a expressão do gene de interesse. Na presença de doxiciclina a proteína rTetR ganha afinidade pelo DNA iniciando assim a expressão do gene de interesse.
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O sistema Tet-On é comercializado pela empresa Clontech® que disponibiliza o sistema de expressão induzível em dois diferentes vetores plasmideais, sendo que um deles contém o sistema de expressão da proteína ativadora rTetR e o outro o promotor induzível pTRE, com sítios de clonagem. A empresa constantemente vem aperfeiçoando o sistema, sendo disponível atualmente a sua terceira geração do sistema, sempre visando melhorar a resposta mediante a doxiciclina, mas principalmente na ausência, pois é muito importante que na ausência da droga a expressão do gene de interesse seja a menor possível (Figura 32A-B) (Loew, 2010).
Outro fator importante que vem sido constantemente aperfeiçoado é o estímulo de expressão do gene de interesse em baixas doses de doxiciclina. Estudos in vitro com o sistema atual mostram que com apenas 10ng/mL já é possível detectar expressão do gene de interesse (LOEW, 2010). Esse sistema de expressão induzido vem sido empregado amplamente na tecnologia de animais geneticamente modificados, nas mais diversas estratégicas. Uma das grandes aplicações, sendo uma ferramenta poderosa, é no sistema de animais knockouts condicionais, onde o sistema induzível regula a expressão da proteína recombinase Cre, resultado na excisão do gene de interesse de maneira temporal (Chaible, 2010; Cox, 2012; Gama-Sousa, 2010).
A obtenção desses animais não é simples, por que os animais são duplos knockouts e para estabilizar a linhagem e cruzamentos, os fundadores devem apresentar os trangenes em homozigose. Cada vetor contendo uma parte do sistema de expressão induzido irá originar um animai transgênico, que por acasalamentos deve ser fixada a homozigose. Posteriormente esses dois animais são acasalados gerando um F1 duplo transgênico em hemizigose, que por acasalamentos são fixados novamente em homozigose, esse animal será considerado o fundador e passará para as gerações o genótipo desejado (Zhang, 2012).
A administração da doxiciclina para os animais é um fator crucial, trabalhos relatam que se pode utilizar praticamente qualquer via de administração, sendo a intraperitonial, por gavagem ou na água de consumo as técnicas mais utilizadas. Na administração intraperitonial usualmente utiliza-se a dosagem de 1 mg/kg de animal (Chen, 2008), na gavagem utiliza-se 1,5 mg/kg de animal (Hojman, 2007), e na água
de consumo na dosagem de 0,2mg/mL de água (Hojman, 2007). A doxiciclina também possui a capacidade de atravessar a barreira placentária e ativar o complexo de expressão ainda em embriões até em fetos (Kolber, 2010).
Figura 32- (A) Quantificação da proteína repórter LacZ expressa sobre o controle induzido do sistema Tet-Off e Tet-On. O primeiro sistema na ausência de Dox produz níveis significativos da proteína repórter, e é desativado pelo fármaco, a situação inversa ocorre no sistema Tet-On. (B) Evolução dos sistemas induzíveis comercializados pela empresa Clontech®. O atual sistema de terceira geração (Tet-On3G) possui menor background de expressão na ausência de Dox, e também possui ativação mais sensível em menores doses do fármaco ativador. (C) O sistema Tet-On3G in vitro é ativado com apenas 10ng/mL e a força da transcrição é proporcional à dose de fármaco.
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3 OBJETIVOS