Após a obtenção e verificação da estrutura dos vetores, escolhemos os clones positivos que apresentaram melhor fidedignidade à sequência predita pelos softwares de bioinformática. Esses vetores foram submetidos a testes in vitro para verificar a correta expressão gênica e proteica, para posterior utilização na geração de animais geneticamente modificados.
Para a verificação da expressão utilizamos duas linhagens celulares cultivadas in vitro, células E10 (pnoumócitos do tipo 2 murino imortalizado que naturalmente expressa Cx43) e células HeLa (linhagem tumoral humana que sabidamente não expressa Cx43).
4.2.1 Cultivo celular
Ambos os cultivos celulares, E10 e HeLa, foram realizados em garrafas de cultura contendo meio de cultura DMEM, ausente de antibiótico, com soro fetal bovino 10%, em ambiente estéril, com atmosfera contendo 5% de CO2 e 37oC.
As culturas confluentes foram submetidas à separação por meio de solução de PBS contendo 0,05% de tripisina e 0,53mM de EDTA, incubadas a 37oC por 5 minutos. As células foram contadas pelo sistema Countess (Invitrogen – USA) e 106
células foram plaqueadas em placas de seis poços para realização dos testes.
4.2.2 Transfecção dos vetores para as células cultivadas in vitro
Utilizamos o método de lipossomos para a transferência dos vetores do meio extracelular para o intracelular das células cultivadas in vitro. Esse método também conhecido como Lipofectamina é um lipossomo com características catiônicas que forma um complexo juntamente com o DNA que consegue burlar a natural repulsão da membrana plasmática da célula pelo DNA. Dessa forma o complexo consegue agregar-se à membrana plasmática e é transferido para o interior celular.
Dos diversos produtos comerciais disponíveis, escolhemos o reagente Xfect (Clontech – USA), pois possui grande eficiência para os tipos celulares dos quais trabalhamos, com protocolo rápido e baixa toxicidade celular. A técnica inicia-se com as placas de cultivo de seis poços contendo 1mL de meio de cultivo DMEM nas condições descritas no item 4.2.1 e com 70% de confluências entre as células. Paralelamente dois tubos são preparados, conforme o quadro 11
Quadro 11- Protocolo de transfecção dos vetores para cada poço de células in vitro Protocolo de Transfecção Tubo 1 Tubo 2 Vetor 5ug total Polímero 1,5uL
1ug vetor rTetR + 4ug vetor Cx43
Xfect Buffer 100uL q.s.p. Xfect Buffer 98,5uL
Procolo para preparação dos vetores para transfecção em células cultivadas in vitro; quantidade descrita para cada poço. Utilizamos a proporção 1:4 dos vetores pCx43Tet3G e pTRE Cx43 respectivamente e 0,3uL de polímero para cada uL de DNA utilizado.
Após a preparação dos dois tubos, eles serão misturados na proporção 1:1, agitados vigorosamente por 2 minutos em vortex e incubados por 10 minutos em temperatura ambiente. Adiciona-se 200uL do complexo em cada poço contendo 1mL de meio de cultura e incuba-se as células por 4 horas em estufa com condições padrão de cultivo. Após esse período retira-se o meio, lava-se as células com 1mL de meio DMEM e posterior adição de 2mL DMEM enriquecido com FBS 10% para continuação dos experimentos a seguir.
4.2.3 Tratamentos com doxiciclina
Para o teste da funcionalidade do sistema Cx43Tet precisamos estimular a expressão do nosso gene de interesse por meio da doxiciclina, e para isso decidimos trabalhar com três diferentes doses da droga: 0ng/mL, 10ng/mL e 1000ng/mL (ng de doxiciclina/mL de meio de cultura). Ambas as linhagens, E10 e HeLa receberam os mesmos tratamentos, conforme ilustrado na figura 38.
Figura 38- Esquema da distribuição dos tratamentos nas placas de cultivo em cada linhagem celular. Trabalhamos com 3 placas de repetição, totalizando 6 amostras experimentais.
4.2.4 Imunofluorecência
As células E10 e HeLa foram plaqueadas em placas de seis poços contendo no interior uma lamínula de vidro circular de 25mm para que as células crescessem aderidas à ela. As células receberam os tratamentos com doxiciclina até a total confluência e segui-se a técnica de imunofluorecência.
As células foram fixadas em metanol (anticorpo anti-V5) e paraformoldeído (anti-Cx43, anti-rTetR, anti-ZsGreen) por 20 minutos em temperatura ambiente. Seguiu-se a permeabilização com leite 5% em PBS contendo 0,1% de Triton por 20 minutos e posterior incubação overnight com anticorpo primário. A revelação das marcações foi feita com anticorpo secundário anti-mouse conjugado com fluoróforo e incubados de 2 horas a temperatura ambiente. Para conservar a capacidade fluorescente utilizamos o anti-fading Vectashield contendo DAPI para coloração dos núcleos celulares em azul. As lâminas foram analisadas em microscopia convencional de luz ultravioleta com filtros específicos e por microscopia confocal. O quadro 12 ilustra as concentrações dos anticorpos utilizados bem como os fluoróforos de cada um deles.
Quadro 12- Relação dos anticorpos utilizados com suas respectivas concentrações Anticorpos
Proteína Anticorpo 1ario Anticorpo 2ario
Epítopo V5 1:200 (monoclonal) – Invitrogen 1:100 (anti-mouse) TRTC – Vermelho Cx43 1:100 (monoclonal) – Dako 1:100 (anti-mouse) TRTC – Vermelho rTetR 1:100 (monoclonal) – Clontech 1:100 (anti-mouse) FITC – Verde ZsGreen 1:100 (monoclonal) - Clontech 1:150 (anti-mouse) FITC - Verde
4.2.5 Westernblot
Para a estimação das proteínas de interesse recombinantes utilizamos a técnica do Westernblot. Para tanto, foi feita a extração das proteínas das células utilizando um tampão contendo 60mM Tris-HCl, pH 6.8, SDS a 2%, glicerol a 12%, ditiotreitol 0,1M e fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) 1mM. A concentração de proteínas neste homogenato foi determinada utilizando-se kit da técnica de Bradford (Bio-Rad – USA) e a leitura realizada em espectrofotômetro à 595 nm.
As proteínas foram aquecidas à 94oC por 10 minutos para desnaturação da sua estrutura terciária, e resolvidas em eletroforese num gel de poliacrilamida a 12%, com dodecil sulfato de sódio (SDS) e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PDVF). Para a imunodetecção do epítopo V5 utilizamos o anticorpo monoclonal anti-V5 1:1000 (Invitrogen – USA) e rTetR anticorpo monoclonal anti-rTetR 1:1000 (Clontech – USA) diluído em solução de PBS contendo 5% de leite desnatado, aplicados sobre as membranas e incubados overnight a 4oC. Após a incubação a membrana foi colocada em contato com anticorpos secundários, na diluição de 1:100 por 2 horas a temperatura ambiente, a reação foi revelada com kit ECL Plus de bioluminescência (GE –USA) e a imagem capturada em fotodocumentador utilizando luz UV.
4.2.6 PCR em tempo real
O RNAm total da cultura celular foi extraído por meio da técnica fenol/clorofórimio utilizando o reagente Trizol (Invitrogen - USA) seguindo o protocolo do fabricante, e posterior quantificação no aparelho NanoDrop (Thermo – USA). No início da transformação do mRNA, 1500ng de mRNA total foram tratados com 3U de DNAse e incubados à 37oC por 1 hora. O cDNA total dos genes expressos nos tecidos foi obtido pela técnica de transcrição reversa utilizando o kit SuperScript® VILO (Invitrogen – USA) e analisados por meio de PCR em tempo real
Utilizamos o sistema de primers e sondas TaqMan (Life Technologies – USA) que foram desenhados a partir das sequência dos vetores transfectados. Todas as reações foram realizadas em um AB7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems – USA), em triplicata, utilizando um programa de detecção Sequence Detector. As sequências dos primers e sondas utilizados estão descritos no quadro 13.
Quadro 13- Sequência dos primers e sondas utilizados na técnica de PCR em tempo real
Primers e Sondas
Cx43 recombinante
Primer Foward TTCCAGCAGAGCCAGCAGC
Sonda FAM – AGATTGGTAAG
Primer Reverse CTCGGTCTCGATTCTACGT
rTetR
Primer Foward AATTACTCAATGGAGTCGGT
Sonda FAM – ACGACAAGGAA
Primer Reverse CCTGTACTGGCACGTGAAGA
ZsGreen
Primer Foward AATCTGTGTGTGGTCGAAGG
Sonda FAM - CCATTTGCCGAA