Testes in vitro do vetor pCx43-Tet3G

Após a confirmação da estrutura do nosso vetor de transgênese pCx43-Tet3G o próximo passo foi verificar sua funcionalidade. Esse vetor deve ser funcional, ou seja, expressar a proteína ativadora rTetR nas células em que naturalmente o gene Cx43 é expresso, já que sua expressão é modulada pelo promotor pCx43.

Com esse objetivo testamos três dos clones positivos ilustrados na figura 52 em duas diferentes linhagens celulares, células HeLa e células E10. As células HeLa são uma linhagem neoplásica de carcinoma uterino humano que sabidamente não expressam nenhum tipo de conexina, entre elas a Cx43; já as células E10 fazem parte de uma linhagem celular murina, imortalizada, não tumoral e proveniente de pneumócitos do tipo II, que sabidamente expressam Cx43.

Sendo assim, nesses testes in vitro utilizamos as células HeLa como controle de seletividade de expressão por parte do promotor pCx43 e utilizamos o vetor original pCMV—Tet3G que contém o promotor viral pCMV regulando a expressão da proteína ativadora rTetR como controle positivo de expressão e de detecção.

Depois da transfecção das células com os vetores realizamos as reações de imunodetecção, tanto in situ pela imunofluorecência como por Western blot. Ambas as linhagens que receberam o vetor de controle pCMV-Tet3G expressaram a proteína rTetR e conseguimos detecta-las tanto na região citoplasmática, quanto no complexo de Golgi (Figura 53C-D). Já o nosso vetor de interesse quando transfectado para as células HeLa não apresentaram expressão, esse resultado corresponde com o esperado pois essas células não apresentam expressão do gene Cx43 (Figura 53E). O mesmo vetor pCx43-Tet3G quando transfectado para células E10 apresentaram altos níveis de expressão do gene rTetR, comprovando mais uma vez a sua correta funcionalidade (Figura 53F).

Os resultados ilustrados na figura 53 são referentes à apenas um dos clones pCx43-Tet3G, porém todos os clones foram analisados e apresentaram resultados semelhantes. Nós ainda realizamos as análises da deteção da proteína rTetR por meio da técnica de Western blot. Os resultados obtidos nessa técnica foram compatíveis com os encontrados na imunofluorecência. Os vetores de controle pCMV-Tet3G apresentaram expressão e tradução do gene rTEtR em ambas as

linhagens celulares, HeLa e E10; já os clones dos vetores pCx43-Tet3G expressaram o mesmo gene somente na linhagem E10 (Figura 54).

Após detectarmos a proteína rTetR expressa pelos vetores, tanto o vetor controle pCMV-Tet3G quanto o de interesse pCx43-Tet3G foram testados novamente para verificar os níveis de mRNA produzidos por cada um deles nas diferentes linhagens celulares. Precisávamos saber se fato de não detectarmos proteínas rTetR derivadas do vetor pCx43-Tet3G em células HeLa estava relacionado com processos de transcrição ou tradução dessa linhagem em específica. Para isso por meio da técnica de Real Time PCR quantificamos de maneira relativa o nível de expressão gênica do gene rTetR. Para isso normalizamos os dados absolutos obtidos desse gene de interesse com outro gene também expresso no mesmo vetor, o gene de resistência à ampicilina AmpR.

Como ilustrado nos gráficos da figura 55, nas células HeLa somente o vetor pCMV-Tet3G transcreveu mRNA referente ao gene rTetR, enquanto não obtivemos níveis significantes de transcritos pelo vetor pCx43-tet3G. Nas células E10, novamente ambos os vetores apresentaram resultados positivos. Dessa forma podemos pressupor que é um problema transcricional e que de alguma forma, nas células HeLa, o promotor pCx43 é suprimido via metilação de ilhas CpG ou condensação de cromatina.

Células HeLa Células E10 Con trole Ne gativ o pCM V -Tet3 G pCx4 3 -Tet3 G

Figura 53- Fotomicrografia do resultado da técnica de imunofluorecência para a proteína rTetR modulada pela expressão dos vetores pCMV-Tet3G (controle positivo) e pCx43-Tet3G. Os núcleos celulares estão marcados com o fluoróforo DAPI (azul) enquanto as proteínas rTetR marcadas com FITC (verde). (A) Controle negativo da reação, células HeLa transfectadas com o vetor pCMV-Tet3G que não foram incubadas com o anticorpo primário anti-rTetR. (B) Controle negativo da reação, células E10 transfectadas com o vetor pCMV-Tet3G que não foram incubadas com o anticorpo primário anti-rTetR. (C) Células HeLa com pCMV-Tet3G

A B

C D

expressando rTerR. (D) Células E10 com pCMV-Tet3G expressando rTetR. (E) Ausência da expressão de rTetR em células HeLa com pCx43- Tet3G. (F) Células E10 com pCx43-Tet3G expressando rTetR. Barra de escala 5um.

Figura 54- Fotografia do resultado da imunomarcação da proteína rTetR pela técnica de Western blot utilizando o sistema de revelação ECL-Plus. (A) Nas células HeLa, somente o vetor pCMV-Tet3G expressou o gene rTetR, não havendo detecção nas células HeLa transfectadas pelo vetor pCx43-Tet3G. (B) Detecção em células E10 transfectadas, sendo que ambos os vetores expressaram a gene rTetR.

Figura 55- Gráficos resultantes do estudo da expressão do gene rTetR pela técnica de Real Time PCR. O gene de interesse rTetR foi quantificado relativamente, e para isso utilizamos o gene AmpR como normalizador. (A) Quantificação dos níveis de mRNA do gene rTetR nas células HeLa em

função dos diferentes clones de vetores, utilizamos os vetores pCMV- Tet3G como controle e testamos a expressão nos vetores pCx43-Tet3G. (B) Quantificação dos níveis de mRNA do gene rTetR nas células E10 em função dos diferentes clones de vetores, utilizamos os vetores pCMV- Tet3G como controle e testamos a expressão nos vetores pCx43-Tet3G. Esses resultados indicam a correta funcionalidade dos vetores e que acertamos na escolha da região genômica que o pCx43 está naturalmente localizado. Os vetores presentes nos clones analisados apresentaram expressão satisfatória do gene ativador rTetR e a detecção da sua proteína correspondente foi detectada em quantidade adequada ao esperado. Além disso, a seletividade da expressão modulada pelo promotor pCx43 aparentemente foi mantida, pois nenhum traço da proteína rTetR foi detectada nas técnica de western blot e de Real Time PCR . Com esses resultados ainda não é possível afirmarmos categoricamente que o promotor pCx43 por nós clonado apresenta a mesma seletividade biológica do pCx43 original, esses resultados serão obtidos apenas estudando a expressão in vivo no animal geneticamente modificado aqui proposto.