O objetivo geral do presente estudo foi avaliar o efeito do ácido zoledrônico (ZOL) na resposta inflamatória e na remodelação óssea alveolar durante a movimentação dentária induzida em ratos.
4.2 Específicos
• Analisar os efeitos do ZOL na resposta inflamatória e na remodelação óssea alveolar, por meio de:
o Quantificação dos espaços entre os primeiros molares superiores e incisicos centrais superiores de hemiarcadadas controles e submetidas à MDI e contralaterais não submetidas;
o Histomorfometria das áreas do ligamento periodontal nos lados de compressão e tração e áreas hialinas;
o Histologia da raiz distovestibular e do osso alveolar circunjacente para avaliação de reabsorções radiculares e ósseas;
o Análise da infiltração neutrofílica por meoo da dosagem da atividade da mieloperoxidase (MPO) gengival;
o Dosagens dos níveis gengivais de TNF-α e IL-1β por ELISA; o Marcação imunohistoquímica para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP;
o Avaliação do anabolismo ósseo pela dosagem sérica de Fosfatase Alcalina Óssea
• Verificar a repercussão sistêmica do ZOL mediante: o Leucograma;
5 METODOLOGIA
5.1 Seleção de animais
Foram utilizados 72 ratos Wistar (Rattus norvegicus) machos, com massa corpórea entre 180 e 220 gramas provenientes do Biotério Central do Campus do Pici da Universidade Federal do Ceará – UFC e transferidos para o Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia (FaMed, UFC-Fortaleza). Estes animais foram mantidos em gaiolas apropriadas, em número de 4 animais em cada uma delas. Os ratos receberam ração comercial balanceada própria e água à vontade, e permaneceram nas mesmas condições ambientais durante os experimentos. As coletas de sangue foram utilizadas para obtenção de valores basais bioquímicos e de leucograma.
5.2 Fármacos, reagentes e anticorpos
Como abordagem farmacológica, foi utilizado medicamento genérico, apresentado em frasco-ampola de 5 ml de solução injetável, contendo 4,264 mg de ácido zoledrônico, equivalente a 4 mg de ácido zoledrônico, produzido pelo laboratório Eurofarma (São Paulo-SP, Brasil). Antes da administração intravenosa (i.v.), o fármaco foi adequado à temperatura ambiente e diluído em água destilada (H2Od).
Para a anestesia dos animais foi utilizada a combinação de cloridrato quetamina (Cetamin, Syntec®, Hortolândia-SP, Brasil) com cloridrato de xilazina (Xilazin, Syntec®, Hortolândia-SP, Brasil), em proporções de 90 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente, administrada intramuscularmente (i.m.).
O brometo de hexadeciltrimetilamônio (H-TAB), a albumina sérica bovina (BSA), a tetrametilbenzidina (TMB), o Tween TW20 e a Carragenina lâmbda tipo IV foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis-MO, USA).
Para as dosagens de fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-1β (IL- 1β) por ELISA, foram utilizados anticorpos anti-TNF-α e anti-IL-1β da R&D Systems (Minneapolis-MS, EUA) [Anticorpos de captura: diluição em tampão fosfato-salino (PBS) 10% (1:1000); Anticorpos de detecção: diluídos em BSA 1% (1:1000)].
As marcações imunohistoquímicas foram feitas utilizando-se os anticorpos primários policlonais de cabra TNF-α, fosfatase ácida tartarato resistente (TRAP), ligante do receptor ativador do fator nuclear-κB (RANKL) e osteoprotegerina (OPG) com
o respectivo secundário anti-cabra e sistema ABC, todos fornecidos pela Santa Cruz (Dallas-TX, EUA) e diluídos no diluente de anticorpo com redução de background da Dako (Barueri-SP, Brasil). O sistema de coloração para imunohistoquímica, cromógeno 3,3’diaminobenzidine DAB/peróxido foi adquirido da Dako (Carpinteria-CA, EUA).
A quantificação dos níveis séricos da enzimas fosfastase foi utilizado o kit do fabricante LABTEST®(Labtest®, Lagoa Santa-MG, Brasil). O kit de coloração utilizado
para realização do leucograma dos animais foi obtido da Instant Prov Stain Set® (Newprov Produtos para Laboratório, Pinhais-PR, Brasil).
O formol, o álcool etílico absoluto, o EDTA e a solução pronta de hematoxilina de Harris utilizados nas diferentes análises foram obtidos da Dinâmica (Dinâmina, Diadema-SP, Brasil).
5.3 Protocolo Experimental
5.3.1 Modelo de Movimentação Dentária Induzida (MDI)
Foi utilizado o modelo de movimentação dentária induzida (MDI) por dispositivo ortodôntico descrito anteriormente por Heller e Nanda (1979), adaptado pelo nosso laboratório por Dutra (2010) e Araújo (2015). Este modelo consistiu na utilização de molas fechadas de níquel-titânio (Morelli®-ref. 35.20.064; Sorocaba-SP) fixadas aos primeiros molares superiores esquerdos e incisivos centrais superiores por meio de fio de amarrilho de aço inox de 0,008 polegadas (Morelli® - ref. 55.01.210; Sorocaba-SP) e ativadas com uma força de 50 gf mensurada por tensiômetro (Morelli®, ref: 75.02.009, Sorocaba-SP, Brasil) (KARRAS et al., 2009; KAIPATUR et al., 2013). Para fixação adicional dos amarrilhos, criou-se um sulco na região cervical dos incisivos superiores com um disco de lixa acoplado à uma microrretífica sob irrigação com soro fisiológico, e preenchido com resina fotopolimerizável (Fill Magic, Vigodent®, Rio de Janeiro-RJ, Brasil). Nenhuma ativação adicional foi feita ao longo do período experimental, no entanto, os animais foram monitorados diariamente quanto à presença ou não deste.
Demonstrou-se que o modelo de MDI causa movimentação dos dentes a partir do dia 1º dia, progredindo até o 4º dia. Do 4º ao 7º dia não é observado deslocamento importante. Porém, a partir do 7º dia, a movimentação volta a ocorrer, atingindo o pico no 11º dia da instalação da mola e, a partir de então, formando um platô até o 21º dia (ARAÚJO; 2015). Microscopicamente, as raízes retornam a uma posição mais centralizada no ligamento periodontal e apresentam maiores reabsorções, caracterizando, assim, a remodelação óssea.
Devido ao pico de movimentação dentária e a presença de remodelação óssea ocorrer no 11º dia, este foi escolhido para eutanásia e análise dos materiais coletados. Os animais foram eutanasiados após o referido período com overdose anestésica da combinação de cloridratos de quetamina e xilazina.
Figura 10 – Representação esquemática do modelo de MDI por mola fechada Ni-Ti e administração de ZOL. No dia 0 foram registrados os valores basais de massa corpórea, leucograma e fosfatase alcalina
óssea. A seguir, os animais, previamente anestesiados, receberam ZOL ou H2Od, tomaram-se os registros
das medidas dos espaços interdentários e instalou-se a mola fechada de níquel-titânio ativada com 50 gf. No 7⁰ dia, repetiram-se as administrações de ZOL. Ao 11⁰ dia, foram refeitas as coletas de amostras sanguíneas e as medidas interdentais. As gengivas submetidas à MDI e contralaterais controles foram retiradas para dosagem da atividade de MPO e dos níveis e citocinas por ELISA. Seguiu-se a eutanásia e foram as maxilas para os ensaios de microscopia. LC: lado de compressão; LT: lado de tração; RRs: reabsorções radiculares; ROs: reabsorções ósseas.
Figura 11 - Fotografia ilustrativa do modelo de movimentação dentária induzida. Posicionamento da mola fechada com fixação no primeiro molar superior esquerdo (1º MS) e incisivos superiores (ICS). A mola Ni-Ti é fixada com o fio de amarrilho e a resina na face vestibular dos incisivos superiores (Fonte: Laboratório de Osteofarmacologia).
5.3.2 Grupos Experimentais A. Grupo não tratado
Esses grupos foram constituídos por 8 ratos cada submetidos à MDI. Os animais receberam água destilada (H2Od 1 ml/kg, i.v.) 5 minutos antes da instalação do aparelho e após este, no 7º dia.