Variação de massa corpórea

A figura 26 mostra a variação de massa corpórea causada pela MDI por 11 dias, quando comparada a de animais controles, não submetidos a MDI. Observou-se que a MDI induziu significante (p<0,05) a perda de peso nos animais não tratados a partir do 1º dia (valores basais) e assim mantendo até o 5º dia. A partir do 6º dia, os animais atingem seus valores basais, ultrapassando-os a partir do 8º até o 11º dia, sem, contudo, atingir os valores de animais controles.

O tratamento com ZOL, nas três doses utilizadas, não alteraram a perda de massa corpórea vista durante os 11 dias de MDI (p>0,05).

Figura 26 - Efeito do Ácido Zoledrônico (ZOL) na variação da massa por 11 dias em animais submetidos à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. Os animais foram pesados diariamente por 11 dias. Os valores representam a média ± erro padrão da variação de massa corpórea, obtidos pela diferença entre os pesos de cada animal e o peso observado no dia 0, de animais dos grupos Controle,

Não tratado (NT) e tratados com ZOL (50, 100 e 200 µg/kg). N=8/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle;

*p<0,05 em relação ao NT. ANOVA; Bonferroni.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 -30 0 30 60 90 Va ri a ç ã o d e m a s s a c o rp ó re a ( g ) NT ZOL 50 µg/kg ZOL 100 µg/kg ZOL 200 µg/kg Controle (dias)

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7. DISCUSSÃO

Nesse estudo, foi escolhido o modelo de movimentação dentária induzida em animais por ter se mostrado útil para estudar os eventos relacionados à remodelação óssea, com a vantagem de se observar sítios distintos conforme o predomínio de cada um dos processos de reabsorção e neoformação ósseas. Além das alterações vasculares e celulares iniciais, há ainda a participação de vários mediadores, como citocinas, fatores de crescimento e neurotransmissores, os quais tornam o ambiente favorável à remodelação óssea, consequentemente, ao deslocamento dentário através do osso alveolar (KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006).

A escolha de ratos Wistar se deu pela facilidade de manuseio dos mesmos e acesso aos dentes, mas, principalmente, pela reprodutibilidade na obtenção de medidas para quantificar a MDI (ARAÚJO, 2015). Quanto à força utilizada no estudo, tem sido demonstrado que intensidades entre 10 e 50 gf induzem maiores taxas de movimentação, enquanto que forças exorbitantes são prejudiciais ao periodonto (NAKANO et al., 2014). Nakano et al. (2011) demonstraram que a MDI durante 7 e 10 dias com 50 gf favoreceu maior imunoexpressão de marcadores de reabsorção óssea, como RANK, RANKL e M-CSF. Adicionalmente, vale ressaltar que resultados do nosso laboratório também constataram um pico de movimentação dentária aos 11 dias com 50 gf, bem como aumento da imunomarcação para RANKL e TRAP no ligamento periodontal da raiz distovestibular do primeiro molar superior esquerdo (ARAÚJO, 2015). Ainda, sabe-se que o curso da movimentação dentária em animais é bastante semelhante à cronobiologia da movimentação dentária em humanos, e é dividido em três fases, inicial, latência e pós-latência (BURSTONE, 1962; FRACALOSSI et al., 2009; CHOI et al., 2010; ARAÚJO, 2015). Dessa forma, a escolha do 11º dia de MDI foi feita com base no fato de que nesse período observa-se um pico de deslocamento dentário correspondente à fase de pós-latência da MDI em animais, logo, julgamos coerente utilizar a força de 50 gf no protocolo experimental em questão, e consideramos que este modelo de MDI, com força contínua reconhecida, seja útil para melhor compreender os efeitos de fármacos antirreabsortivos, a exemplo do ácido zoledrônico, evidenciando seus mecanismos junto à resposta inflamatória esperada na MDI.

A repercussão do ácido zoledrônico no tecido ósseo tem sido abordada na literatura, tanto para prevenção de metástases ósseas do câncer (JI et al., 2014; SUMI

et al., 2014), como no tratamento da osteoporose pós-menopausa (BOONEN et al.,

2008). Mais recentemente, os efeitos macroscópicos do ácido zoledrônico foram avaliados na MDI por mola fechada de Ni-Ti, mostrando-se capaz de restringir o deslocamento dentário (SIRISOONTORN et al., 2012; FERNANDEZ-GONZÁLEZ et al., 2016). No entanto, os efeitos diretos desse fármaco no recrutamento de neutrófilos correlacionado à atividade de marcadores ósseos não estão bem elucidados. Desse modo, este estudo a avaliou o ácido zoledrônico nos eventos celulares e vasculares da inflamação relacionados à produção de marcadores ósseos durante a remodelação óssea alveolar da MDI.

Sabe-se que o emprego de fármacos antirreabsortivas, a exemplo do ácido zoledrônico, tem-se mostrado importante no manejo da quimioterapia para pacientes com alguns tipos de cânceres, como de próstata, mama e mieloma múltiplo (JI et al., 2014, SUMI et al., 2014). Entretanto, pouco se sabe acerca de seus efeitos na MDI, processo este conhecido por induzir remodelação óssea, agregando reabsorção e neoformação ósseas em sítios distintos, porém, de maneira coordenada (KRISHNAN, DAVIDOVITCH; 2006).

Para a seleção das diversas doses de ácido zoledrônico foram considerados os cálculos propostos por Reagan-Shaw; Nihal; Ahmada, em 2008, em que se observou que a dose absorvida no período de uma semana durante a quimioterapia com 4 mg de ácido zoledrônico em humanos, correspondia a 100 µg/kg em ratos. Fixou-se essa dosse como a intermediária e foram escolhidas a menor (metade) e a maior (dobro), 50 µg/kg e 200 µg/kg, respectivamente. Vale salientar que estas doses têm sido avaliadas em diferentes modelos animais e se mostraram eficazes e seguras (KHAJURIA; RAZDAN; MAHAPATRA, 2015; SILVA et al., 2015).

Nossos resultados mostram que o ácido zoledrônico, nas doses de 50, 100 e 200 µg/kg, diminuiu a MDI no 11º dia. Considerando-se o ácido zoledrônico como o bisfosfonato de efeito antirreabsortivo mais potente (ZHAO; HU, 2015), a repercussão negativa na MDI era esperada, devido ao desequilíbrio na remodelação óssea. Estudos na literatura têm evidenciado que o ácido zoledrônico é capaz de afetar a MDI, porém em variações diversas do modelo em termos de intensidade de força, tempo de experimentação e diferenças na posologia e via de administração, porém, mesmo com

diversidades de protocolos, o ácido zoledrônico mostrou-se capaz de reduzir a MDI. Sirisoontorn et al. (2012), utilizando a dose de 1,6 µg/kg de ácido zoledrônico por via intraperitoneal, administrada uma vez por semana durante 6 semanas, preveniu a MDI em ratas ovariectomizadas submetidas a instalação e ativação de uma mola fechada de Ni-Ti com 25 gf por 28 dias. Ainda, Fernandez-González et al. (2016) administraram dose única de 16 µg/kg de ácido zoledrônico na mucosa do palato e avaliaram o deslocamento mesial dos molares por ativação de mola fechada de Ni-Ti com 50 gf nos dias 7, 14 e 21, por meio de microtomografia. Em todos os períodos experimentais, foi observado que as taxas de deslocamento dentário nos animais que receberam o ácido zoledrônico foram menores quando comparadas aos animais do grupo controle.

De fato, a inatividade do citoesqueleto de osteoclastos causada pelos bisfosfonatos em geral leva à infrarregulação de fatores de crescimento liberados por osteócitos da matriz, que recrutam osteoblastos para formar um novo osso, culminando em diminuição da remodelação óssea. O processo de remodelação óssea é caracterizado pelo acoplamento relativamente harmônico entre osteoclastos e osteoblastos, e durante a movimentação dentária, qualquer intervenção nessa dinâmica, resulta em alteração no curso da MDI, explicando os resultados do presente estudo (RUCCI, 2008; RAGGAT; PARTRIDGE, 2010; JIANG et al., 2015).

Nesse contexto, a MDI pode ser reduzida tanto em decorrência da diminuição da reabsorção óssea necessária para a movimentação dentária propriamente dita, conferida por agentes antirreabsortivos ósseos, como também a um aumento no anabolismo ósseo. De fato, tem sido descrito que, em condições de elevada atividade anabólica, em detrimento da reabsortiva, como na osteopetrose, o movimento dentário eruptivo é interrompido pela intensa deposição de minerais na matriz, resultando em dentes impactados no osso basal e agenesias dentárias (BJORVATN; GILHUUS-MOE; AARSKOG, 1979; IDA-YONEMOCHI et al., 2002).

Afim de esclarecer se o efeito pelo qual o ácido zoledrônico restringiu o deslocamento dentário pode ser essencialmente causado pelo aumento do anabolismo ósseo, considerou-se avaliar os níveis séricos de fosfatase alcalina óssea (FAO), um marcador da presença de osteoblastos (WHYTE, 1994). O presente estudou mostrou que os 11 dias de MDI não alteraram os níveis séricos da fosfatase alcalina óssea (FAO), quando comparada aos valores basais. A fosfatase alcalina é composta de 3 isoformas e, dentre estas, a isoforma óssea é a predominante. Geralmente, níveis elevados de FAO são encontrados na presença de doenças de afetam o metabolismo

ósseo, como a metástase ou a doença de Paget (COLEMAN et al., 2008). Neste estudo, os níveis não alterados de FAO após a MDI indicam que o processo de remodelação óssea ocorreu em sua normalidade. Nossos achados podem ser corroborados pela literatura, onde se verificou que o tratamento ortodôntico induzido em beagles com 25 gf não repercutiu em mudanças significantes nos níveis séricos e em fluido crevicular gengival da FAO nos períodos de 7, 28, 56 e 83 dias (TENG; LIOU, 2014).

Por outro lado, o tratamento com o ácido zoledrônico diminuiu os níveis plasmáticos dessa enzima, indicando que este fármaco reduziu os mecanismos de anabolismo ósseo. A literatura tem abordado por meio de estudos in vitro que utilizaram células de linhagem de osteosarcoma e precursores de osteoblastos e osteoblastos maduros, a diminuição da FAO à medida que as concentrações de ácido zoledrônico aumentavam (VAISMAN; MCCARTHY; CORTIZO, 2005; PATNTIRAPONG et al., 2012). Ainda, foi observado que a adição de Zn2+ e Mg2+ após o tratamento com ácido zoledrônico reestabelecia as concentrações de FAO. Visto que as fosfatases são metaloenzimas que precisam desses íons divalentes como co-fatores (VAN HOOF; DE BROE, 1994), pode-se sugerir que esse fármaco atue como um agente quelante, devido aos dois átomos de fosfatos da sua estrutura química (VAISMAN; MCCARTHY, CORTIZO, 2005). Além disso, pode-se aventar que o ácido zoledrônico interfere tanto na expressão de FAO em osteoblastos ativos como em seus precursores, podendo, desta forma, afetar não só a atividade dessas células, mas também sua diferenciação.

Clinicamente, foi relatado que pacientes com câncer de mama e metástase óssea confirmada sob quimioterapia associada ao ácido zoledrônico, apresentaram diminuição dos níveis séricos de FAO em intervalos de 3 meses de um período de 18 meses, os quais são restabelecidos quando os pacientes se encontram em wash out quimioterápico por 6 meses (BARNADAS et al., 2014; PATEL et al., 2014).

O aumento dos níveis desta enzima está diretamente relacionado à presença de metástases ósseas e à maior progressão desta doença tendo consequência no aumento da incidência de mortalidade de pacientes com câncer (BARNADAS et al., 2014; NISHIZAWA et al., 2014). Ao reduzir a FAO sérica, o ácido zoledrônico se mostra efetivo como adjuvante quimioterápico. Nossos dados, em conjunto com os dados da literatura indicam que a redução da MDI pelo ácido zoledrônico não se deveu ao aumento de formação óssea, e sim, pela restrição potente da reabsorção óssea alveolar.

Uma vez que a redução da MDI não foi causada pelo aumento do anabolismo ósseo, ao passo que o ácido zoledrônico reduziu os níveis séricos de fosfatase alcalina

óssea, buscou-se investigar a repercussão desse fármaco nos aspectos reabsortivos deste modelo. A histomorfometria do ligamento periodontal mostrou que os 11 dias de MDI não mostraram alterações em ambos os lados, possivelmente por se encontrar na fase em que a remodelação inicial ocorrera anteriormente e, portanto, as raízes encontram-se centralizadas no alvéolo, bem como o tratamento com ácido zoledrônico não alterarou essas áreas no ligamento periodontal observadas durante a MDI em nenhuma das doses utilizadas. De fato, dados do nosso laboratório mostraram que a MDI causou redução significante da área de ligamento periodontal no lado de compressão e aumento correspondente na área de tração desde a 6ª h até o 4º dia. A partir de então, essas áreas retornam às suas dimensões normais, assim seguindo até os 21 dias. Ao 11º dia de MDI, as áreas do ligamento periodontal nos lados de compressão e tração não apresentam alterações de extensão uma vez que as raízes distovestibulares se encontram centralizadas no alvéolo, pois a remodelação inicial ocorrera (ARAÚJO, 2015).

A constrição de vasos sanguíneos do ligamento periodontal na fase inicial da MDI leva à formação de áreas de necrose focal caracterizadas pela redução de células, chamadas áreas hialinas da matriz extracellular. Quando a intensidade da força gera o mínimo de áreas hialinas, ocorrem, então, as reabsorções ósseas frontais. Na presença exacerbada dessas áreas devido à maior intensidade de força, ocorre a reabsorção óssea solapante, em que células distantes do ligamento são recrutadas para reabsorver as áreas hialinas, acarretando um atraso do movimento dentário devido à distância e a maior quantidade de osso à ser reabsorvida (FRACALOSSI et al., 2009).

Em quantidades diminuídas, essas áreas favorecem a liberação fatores quimiotáxicos que recrutam células multinucleadas originárias do osso basal, induzindo a sua diferenciação em osteoclastos. A partir de então, os macrófagos se deslocam para a periferia do ligamento periodontal, promovendo a reabsorção do tecido necrótico. Memo assim, esse processo gera um retardo da movimentação dentária, por isso a formação de áreas hialinas é característica da fase de latência da MDI (KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006; FRACALOSSI et al., 2009; VON BÖHL; KUIJPERS-JAGTMAN, 2009). Vale salientar que nas fases posteriores, de pós-latência, o processo de hialinização se apresenta de forma bastante discreta (VON BÖHL et al., 2004), tal como foi observado no presente estudo. De fato, embora significante, observamos que os 11 dias de MDI causaram aumento discreto dessas áreas, considerando todo o ligamento periodontal. Dados do nosso laboratório mostraram que houve um pico de áreas hialinas

ao 1º dia de MDI, se estendendo até o 4º dia. A partir do 7º dia, essas áreas se mostraram discretas, permanecendo assim até o 21º dia (ARAÚJO, 2015). No 11º dia, quando se sabe ser o dia de pico da MDI, esta ocorre concomitantemente à baixa quantidade de áreas hialinas presentes em toda a extensão do ligamento periodontal.

Ainda assim, as três doses de ácido zoledrônico utilizadas foram capazes de reduzir à metade essas áreas hialinas no ligamento, evidenciando sua formação ao mínimo. Esses achados estão de acordo com outros estudos em que o alendronato de sódio também restringiu o surgimento de áreas hialinas no ligamento periodontal em período semelhante, 11 ou 14 dias de MDI (KARRAS et al., 2009; ARAÚJO, 2015). A formação mínima de área hialina pelo ácido zoledrônico pode estar relacionada com a redução da MDI, uma vez que essas áreas são importantes no recrutamento de células que iniciariam a reabsorção óssea.

Buscando avaliar o efeito antirreabsortivo do ácido zoledrônico a nível histológico, as reabsorções presentes na raiz distovestibular e no osso alveolar circunjacente foram analisadas. A análise dos escores histológicos mostrou que houve um aumento intenso de reabsorções radiculares e ósseas após 11 dias de MDI, corroborando os achados de Fracalossi et al. (2009), que constataram a presença dessas reabsorções na raiz distovestibular e osso alveolar circunjacente a ela após 9 dias de MDI. O tratamento com ácido zoledrônico nessa pesquisa mostrou ser efetivo em prevenir as reabsorções radiculares e ósseas, o que confirma a redução da MDI devido ao efeito antirreabsortivo desse fármaco. Quanto à preservação radicular, nossos achados estão de acordo com as observações de Sirisoontorn et al. (2012), em que a administração intraperitoneal por 6 semanas com 1,6 µg/kg de ácido zoledrônico em ratas ovariectomizadas preveniu as reabsorções radiculares após 28 dias de MDI, com intensidade de força de 25 gf.

Como mencionado anteriormente, o ácido zoledrônico reduziu a MDI, possivelmente por inibir a reabsorção óssea. Assim, considerou-se importante avaliar se esse efeito poderia estar relacionado à modulação dos eventos celulares da inflamação que ocorrem durante a MDI, uma vez que a participação de mediadores inflamatórios na atividade osteoclástica já é bem estabelecida (YOSHIHARA et al., 2004; DATTA et al., 2008; RUCCI, 2008; JIANG et al., 2015). Vale ressaltar que a movimentação dentária engloba, principalmente, o ligamento periodontal e o osso alveolar, mas, também induz alterações inflamatórias no tecido mole circunjacente ao dente, que compõe o periodonto (WISE; KING, 2008).

Avaliou-se a presença de neutrófilos, células importantes da inflamação aguda, durante a MDI por meio da dosagem da atividade da mieloperoxidase gengival, uma enzima presente em abundância nos grânulos azurófilos de neutrófilos. Após 11 dias de MDI, a atividade de mieloperoxidase gengival se mostrou elevada. De fato, a ativação de um dispositivo ortodôntico favorece uma exacerbação da resposta inflamatória, caracterizada, principalmente, pela presença de neutrófilos (ARAÚJO, 2015). Ainda, estudos que avaliaram a reabsorção óssea alveolar induzida em ratos no mesmo período, também demonstraram um aumento da atividade da MPO (DE ARAÚJO-JÚNIOR et al., 2013; GÓES et al., 2014; GUIMARÃES et al., 2016). Entretanto, o ácido zoledrônico preveniu, significantemente, o aumento da atividade dessa enzima. A modulação de neutrófilos pelo ácido zoledrônico já foi abordada na literatura por Williams et al. (2000), em que o mecanismo dos bisfosfonatos, o qual consiste em inibir a atividade de GTPases, parece interferir no processo de maturação e função neutrofílica. Em outro estudo em culturas de células, Kuiper et al. (2012) observaram que o ácido zoledrônico inibiu a quimiotaxia de neutrófilos e a atividade de NADPH oxidase, uma enzima importante para a atividade fagocitária, bem como a diferenciação de células hematopoiéticas nessas células de maneira concentração-dependente.

Tem sido relatado que fármacos antirreabsortivos podem afetar o sistema imune inato, e interferir na liberação de enzimas lisossomais, a exemplo da metaloproteinase-8, por neutrófilos (TERONEN et al., 1997). Sugere-se que a alta incidência de osteonecrose dos maxilares por bisfosfonatos também pode estar relacionada à incapacidade do sistema imune inato, facilitando a instalação da infecção (KUIPER et al., 2012).

A instalação de mola Ni-Ti induz, além da migração neutrofílica, o aumento da produção de citocinas, como TNF-α e IL-1β (HAZAN-MOLINA et al., 2013; ALIKHANI et

al., 2015), as quais participam ativamente da osteoclastogênese e indução de

osteoclastos maduros (TEITELBAUM; ROSS, 2003; BASARAN et al., 2006; LE GALL, SASTRE, 2010) e estão presentes desde os estágios iniciais da MDI (ALIKHANI et al. 2015).

No presente trabalho, foi observado o aumento significante dos níveis de TNF-α e IL-1β após 11 dias de MDI, quando comparados aos tecidos gengivais contralaterais, em concordância com outros autores, os quais mostraram que a ativação de uma mola Ni-Ti é responsável pelo aumento dos níveis de TNF-α e IL-1β após em 7 e

10 dias, respectivamente (DE OLIVEIRA et al., 2014; YAN et al, 2015). Sabe-se que o TNF-α induz a produção e secreção de IL-1β por macrófagos, tendo um papel importante na remodelação óssea (DINARELLO et al., 1986; REDLICH; SMOLEN, 2012). O ácido zoledrônico, após 11 dias de MDI, não preveniu o aumento dos níveis gengivais de TNF-α e IL-1β. Observou-se, ainda, a participação de TNF-α no modelo da MDI, comparativamente à IL-1β.

De fato, ensaios in vitro observaram que a incubação de osteoclastos isolados de humanos saudáveis com ácido zoledrônico foi responsável por promover o aumento dos níveis de TNF-α e IL-1β (TSENG et al., 2015). Da mesma forma, estudos que utilizaram células da linhagem de macrófagos murinos e osteosarcomas humanos, constataram que o pré-tratamento com ácido zoledrônico aumentou a produção de TNF- α, IL-1β e IL-6 após a incubação com LPS (MURATSU et al., 2013; RIZZO et al., 2014). Embora o ácido zoledrônico não tenha prevenido o aumento dos níveis de TNF-α após 11 dias de MDI, estes se mantiveram elevados em relação ao controle.

Considerando que o ácido zoledrônico possui rápida depuração plasmática, e se liga fortemente ao osso, avaliou-se a sua presença neste tecido. A imunohistoquímica para TNF-α mostrou um aumento das imunomarcações no lado de compressão do ligamento periodontal da raiz DV dos animais não tratados (NT), estando em conformidade com os achados na literatura, que mostram a participação de TNF-α na remodelação óssea da MDI (BOAS NOGUEIRA et al., 2013; ALIKHANI et al., 2015; YAN

et al., 2015). O ácido zoledrônico (200 µg/kg), diferentemente do que foi observado na

gengiva, diminuiu significantemente o número de células positivas para TNF-α nos lados de compressão e tração do ligamento periodontal. Apesar da literatura não abordar com especificidade o efeito do ácido zoledrônico na imunohistoquímica para TNF-α durante a MDI, foi constatado que, na osteonecrose induzida por ácido zoledrônico, há um aumento das imunomarcações para TNF-α (SILVA et al., 2016). Contudo, a osteonecrose é uma condição peculiar, caracterizada por necrose propriamente dita, sequestro ósseo, associada, muitas vezes, à presença de micro-organismos (SILVA et

al,. 2015), o que favoreceu a produção de citocinas pró-inflamatórias.

Citocinas pró-inflamatórias, principalmente TNF-α, promovem reabsorção óssea por induzir a expressão de RANKL em células estromais como fibrosblastos e osteoblastos (QUINN et al., 2000; MANABE et al., 2001). (LE GALL; SASTRE, 2010), além de inibir a neoformação por estimular a apoptose de osteócitos e favorecer a

infrarregulação de OPG (AHUJA et al., 2003; TANABE et al., 2005). Nesse contexto, percebe-se que o eixo RANKL-OPG sofre uma influência relevante de mediadores da inflamação (BOYCE; XING; 2008). Nesse estudo, foi verificado o aumento da imunomarcação para RANKL no lado de compressão do ligamento periodontal da raiz DV dos animais não tratados (NT), provavelmente em decorrência do aumento de TNF- α. No lado de tração, as marcações positivas para RANKL também foram aumentadas.

Sabe-se que o movimento dentário ocorre mediante reabsorção óssea no