6 – Otimização do Procedimento Analítico

Os parâmetros analíticos normalmente encontrados para a validação de métodos de separação são: precisão; exatidão; linearidade e faixa de aplicação; seletividade; limite de detecção; limite de quantificação e robustez. Estes termos são conhecidos como parâmetros de desempenho analítico, características de desempenho e, algumas vezes, como figuras analíticas de mérito[194-196].

Embora não existam ainda sistemas de validação que assegurem a confiabilidade dos procedimentos analíticos que vem sendo empregados na determinação de IE e PFHP em amostras ambientais, procurou-se seguir, quando viável, os critérios e recomendações de alguns órgãos nacionais de avaliação da qualidade de laboratórios de análise, como o Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial - INMETRO e a Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, bem como de especialistas na área. Portanto, os critérios adotados neste trabalho tiveram como principais referências os seguintes documentos: Guia de Orientações sobre Validação de Métodos de Ensaios

Químicos[197]_{, do INMETRO; Resolução n}o _{899 de 29/05/03}[198]_{, da ANVISA; os artigos}

científicos publicados por Ribani et alli[196] e Shabir[199]; e ainda os livros “Validação de

Métodos Cromatográficos de Análise”[195], de Fernando M. Lanças, e “Validação em Análise

Química”[194], de Flávio Leite.

Neste trabalho a precisão instrumental foi determinada com base nas áreas dos padrões injetando-se em quintuplicata duas das soluções-padrão empregadas na calibração, com as seguintes concentrações: 1,2 µg/mL para os compostos dietilftalato e dibutilftalato; 6 µg/mL para androstano, diclofenaco, estrona, estradiol, etinilestradiol, levonorgestrel e progesterona; 12 µg/mL para 4-nonilfenol, bisfenol A e benzo[a]pireno; 21 µg/mL para coprostanol e 30 µg/mL para cafeína, colesterol, colestanol e estigmasterol.

A seletividade do método cromatográfico foi determinada através da avaliação da pureza dos picos cromatográficos obtidos, tanto para os padrões como para os compostos presentes nas amostras, comparando-se os espectros de massas obtidos para os padrões empregados na calibração do GC/MS com os espectros disponibilizados na biblioteca do próprio instrumento (NIST).

Brancos de laboratório também foram obtidos, para a verificação de possíveis contaminações durante o procedimento analítico. Para tanto, dois tipos de branco foram empregados: água mineral da Prata, obtida comercialmente em frascos de 1,5 L e água deionizada. Foram gastos no total 10 L de água, sendo 2 L para cada tipo de extração emrpegada (ELL, SPE com C18 e eluição com MeOH, SPE com C18 e eluição com

EtOAc/Acet, SPE com Cgraf e SPE com OasisHLB), já que foram adotadas análises em

duplicata. Todas as etapas envolvendo o preparo da amostra, extração dos compostos e a quantificação dos mesmos foram realizadas para os brancos exatamente como procedido para as amostras, obtendo-se uma situação bastante fiel. Um branco do equipamento também foi feito injetando-se 1µL de MeOH.

A recuperação ou fator de recuperação, uma medida da eficiência do processo de isolamento do composto de interesse, também foi obtida para todas as extrações avaliadas empregando-se 2 níveis de concentração. Na análise das amostras coletadas nas campanhas 4-6 trabalhou-se com 0,80 e 40 µg/L dos compostos de interesse, enquanto que na análise das amostras coletadas na campanha 7 trabalhou-se com 0,54 e 12 µg/L dos compostos 4-nonilfenol, androstano, diclofenaco, bisfenol A, estrona, estradiol, etinilestradiol, levonorgestrel, progesterona e benzo[a]pireno, 0,80 e 50 µg/L de cafeína, coprostanol, colesterol, colestanol e estigmasterol, e 1,35 e 30 µg/L de dietilftalto e dibutilftalato. Utilizou-se água deionizada fortificada em laboratório, adicionando-se volumes conhecidos das soluções dos padrões, preparadas em metanol. As alíquotas usadas foram pipetadas empregando-se micropipetas semi-automáticas. Mais uma vez os 4 tipos de extração foram empregados, fazendo-se análise em duplicata.

Após todas as etapas de extração e concentração terem sido efetuadas, determinou-se quanto do composto adicionado ao branco foi quantificado (ou recuperado), através da relação:

Por fim, foram também determinados os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ). O limite de detecção representa a menor quantidade do composto de interesse que

pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada como um valor exato. Já o limite de quantificação corresponde à menor quantidade do composto de interesse que pode ser quantificada com exatidão, utilizando-se um determinado procedimento experimental. Ambos os limites podem ser determinados de 3 maneiras diferentes: empregando-se o método visual, o método da relação sinal-ruído e o método baseado nos parâmetros da curva analítica[194-196].

No método baseado nos parâmetros da curva analítica, os limites de detecção e quantificação são expressos como[196]:

onde: sé o desvio-padrão da resposta, que pode ser de um branco, da equação da

linha de regressão linear ou do coeficiente linear da curva analítica obtida; e S é a inclinação da reta (“slope”) ou coeficiente angular da curva analítica obtida.

Segundo Ribani et alli[196], o método mais utilizado para a determinação dos LD e LQ é o da relação sinal-ruído para técnicas analíticas em geral. Porém, em técnicas analíticas de separação como as cromatográficas e eletroforéticas, a medição do ruído não é tão trivial, sendo às vezes bastante subjetiva. Além disso, tanto o LD quanto o LQ podem ser afetados pelas condições cromatográficas, devendo-se considerar o tipo e o tempo de uso da coluna cromatográfica. Assim sendo, o melhor caminho para resolver o problema de cálculo destes limites é utilizar o método baseado nos parâmetros da curva analítica, estatisticamente mais confiável, sendo que a curva analítica deve conter a concentração correspondente ao LQ.

Neste trabalho ambos os limites de detecção e quantificação foram determinados utilizando-se o método baseado nos parâmetros da curva analítica, utilizando-se como desvio-padrão da resposta (s) o desvio-padrão da equação de regressão linear, calculado pelo Software Microcal Origin.