Podem ainda dar entrada no Sector de Microbiologia amostras de exsudados ou pus de feridas e abcessos, exsudados auriculares e oculares ou ainda biópsias de tecidos sólidos. As feridas são, por excelência, uma via de entrada de microrganismos que podem causar infeções com grande risco de virem a atingir proporções sistémicas, nomeadamente em meio hospitalar.
As amostras purulentas são semeadas em Gelose Sangue, Gelose Chocolate, MacConkey e Sabouraud, de modo a abranger o possível crescimento do maior número de agentes patogénicos possível.
Caso estas amostras venham acondicionadas em meio de transporte adequado à pesquisa de microrganismos anaeróbios, são também semeadas em meio Schaedler líquido e sólido. As biópsias de tecidos sólidos, após maceradas em almofariz esterilizado, são inoculadas nos mesmos meios sólidos e ainda no meio líquido de enriquecimento BHI, que é posteriormente repicado nos meios sólidos.
Nos exsudados nasais faz-se também a pesquisa de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA).
Micobacteriologia
As micobactérias são bacilos álcool-ácido resistentes, aeróbios estritos e fastidiosos no seu crescimento. O género Mycobacterium engloba cerca de 170 espécies, sendo que Mycobacterium tuberculosis é considerada a mais patogénica, associada ao desenvolvimento de tuberculose, uma doença de notificação obrigatória quando detetada.
25 Dadas as suas características microbiológicas, o Mycobacterium tuberculosis aparece em número reduzido nas lâminas coradas por Ziehl-Neelsen e nas culturas, o que justifica a importância de descontaminar a amostra da sua flora comensal e concentrá-la, isolando o mais possível o agente causador da tuberculose. Para o efeito, é utilizado o kit Mycoprosafe®, baseado na ação da N-acetil-L-cisteína e hidróxido de sódio (NaOH) em elevadas concentrações, e adiciona-se ainda um suplemento antibiótico. Este método permite aumentar a eficiência do isolamento de micobactérias, ao eliminar seletivamente outros microrganismos e liquefazer a amostra para uma melhor recuperação das micobactérias presentes - a N-acetil-L-cisteína permite dissolver a amostra e libertar os bacilos, enquanto o NaOH descontamina a amostra da restante flora.
Após concentração e centrifugação a 4000 rotações por minutos (rpm) durante 20 minutos, ao sedimento obtido é ajustado o pH com tampão fosfato para 6,8 – 7,4. Este é então distribuído: são inoculados 0,3 mL para o meio sólido de Lowenstein-Jensen, 0,1 mL para uma lâmina para coloração Ziehl-Neelsen do concentrado obtido e 0,5 mL para um fraco de hemocultura para micobactérias que será incubado no aparelho BacT/Alert, no módulo MB. A incubação do meio de Lowenstein-Jensen é bastante prolongada – só se conseguem resultados definitivos negativos após seis a oito semanas de incubação a 37°C. Neste meio, as colónias sugestivas de Mycobacterium tuberculosis apresentam um aspeto típico, semelhante ao topo de uma couve-flor. Se o BacT/Alert detetar crescimento de micobactérias, o frasco é retirado e executam-se duas lâminas para coloração de Gram e Ziehl-Neelsen para confirmar a presença das micobactérias.
A identificação e antibiograma são efetuados no Centro Hospitalar de Vila Nova de Gaia/Espinho, para onde são enviadas as amostras positivas para micobactérias.
Micologia
Em qualquer amostra se pode pesquisar a presença de fungos. Caso sejam uma espécie predominante na cultura e, presumivelmente, o agente causador de infeção, são isolados em meio Sabouraud a 37ºC durante 48 horas. Se for observada a presença de colónias sugestivas deve proceder-se ao exame a fresco e posterior prova da filamentação. Esta indicia, caso se revele positiva, a presença de Candida albicans, não requerendo mais testes de identificação. Caso seja negativa, procede-se à identificação e antibiograma, através das cartas YST (identificação de fungos) e YS07 (teste de sensibilidade a antifúngicos).
26 Para a pesquisa de fungos filamentosos, cujo crescimento é mais exigente, efetua-se o designado slide de fungos, sobretudo para a pesquisa de Aspergillus spp. Este consiste em recortar um pequeno retângulo de agar Sabouraud, no qual se inocula a amostra com o auxílio de uma zaragatoa. O retângulo é então colocado entre lâmina e lamela a incubar em atmosfera húmida entre 24 e 72 horas e então observado ao microscópio ótico, onde se procuram hifas e estruturas que permitam diferenciar as diferentes espécies.
Virologia
Deteção de vírus respiratórios em idade pediátrica
Os vírus respiratórios são os únicos cuja deteção está a cargo do Sector de Microbiologia, a partir de amostras de aspirado nasofaríngeo, sendo mais predominante esta pesquisa em bebés ou crianças e nos meses de Outono e Primavera, pois é nestas estações e nesta faixa etária que as infeções víricas respiratórias atingem o seu pico. Esta determinação é particularmente importante no diagnóstico rápido, sensível e específico em idades pediátricas ou mesmo neonatais, evitando a administração desnecessária de antibióticos. Esta pesquisa é efetuada pelo método da microscopia de fluorescência, utilizando um microscópio e lâminas específicas para o efeito. A técnica utilizada permite a deteção do RSV, influenza A e B, parainfluenza 1, 2 e 3, adenovírus através de anticorpos monoclonais e anticorpos secundários marcados com FITC e azul de Evans em contacto com uma suspensão de células de aspirado nasofaríngeo.
A observação de um padrão de fluorescência intracelular específico (citoplasmático para o RSV e parainfluenza, nuclear para os vírus influenza e para o adenovírus), sempre em comparação com o controlo negativo, determina um resultado positivo.
Parasitologia
O exame morfológico direto das diferentes formas de vida do parasita nos produtos de excreção, secreção ou nos tecidos do hospedeiro, é um método direto empregue como
27 Figura 11. Ovo de Shistosoma haematobium, no exame a fresco de uma amostra de urina. Ampliação de
400x.
No laboratório, esta pesquisa faz-se, particularmente, em amostras de fezes – preferencialmente três, colhidas com um a dois dias de intervalo entre si – utiliza-se um kit que se baseia no método de Ritchie modificado para a sua concentração e pesquisa de ovos, quistos e larvas, as formas de vida parasitárias excretadas nas fezes.
Nas amostras de exsudado vaginal, pesquisa-se a presença de parasitas como Trichomonas vaginalis. O exame direto é feito a fresco, através de uma suspensão em soro fisiológico observada ao microscópio ótico.