Figura 2.12 – Difratograma padrões para o titânio comercialmente puro: (a) fase α, (b) fase β (Pinto, 2005).
2.2 – Interação do Titânio com o Meio Biológico – O Titânio como Biomaterial
O titânio e suas ligas são os biomateriais metálicos mais indicados para aplicações biomédicas devido às combinações de propriedades, como: biocompatibilidade, alta resistência à biocorrosão, relação tensão/deformação e relação resistência/peso entre outros. Muitos trabalhos na literatura relatam o comportamento do titânio quando aplicado em meio biológico (Macêdo, 2008; Sá, 2009; Alves Jr, 2005).
O termo biomaterial foi definido na Conferência do Instituto Nacional de Desenvolvimento de Consenso em Saúde em 1982 como: “Qualquer
(a)
(b)
Fase α
substância (outra que não fármaco) ou combinação de substâncias, sintética ou natural em origem, que possa ser usada por um período de tempo, completa ou parcialmente como parte de um sistema que trate, aumente ou substitua qualquer tecido, órgão ou função do corpo” (Vaz, 2007). Os biomateriais devem ser isentos de produzir qualquer resposta biológica adversa local ou sistêmica, ou seja: o material deve ser não-tóxico, não-carcinogênico, não-antigênico e não-mutagênico. Sendo classificados como: bioinertes, bioativos e bioreativos. Os bioinertes são menos susceptíveis a causar uma reação biológica adversa devido a sua estabilidade química em comparação com outros materiais. Os materiais bioativos têm como propriedade formar tecido sobre a sua superfície e estabelecer uma interface capaz de suportar cargas funcionais. Os materiais bioreativos ficam no limite entre os materiais bioinertes e os bioativos (Trota Filho, 2007).
Quando o biomaterial entra em contato com o meio biológico ocorre uma série de reações físicas, químicas e biológicas que dependem principalmente das propriedades da superfície do biomaterial. Estas propriedades determinam a biocompatibilidade de um material, a figura 2.13 relaciona algumas destas propriedades (Spencer e Textor, 2007).
Figura 2.13 – Propriedades dos materiais que estão relacionadas à biocompatibilidade
(Spencer e Textor, 2007).
Os pesquisadores estudam o comportamento dos biomateriais com diferentes focos. Alguns destes grupos estudam células isoladas sobre a
superfície do material através de técnicas que quantificam a força de adesão celular (Anselme, 2000a; Bao e Suresh, 2003). Outros grupos, no entanto, focam seus trabalhos na interação do material com populações de células após alguns minutos ou horas de contato material/células (Thoumine et al., 1996; García et al., 1997; Rezania et al., 1997; Yamamoto et al., 1998; Myrdycz et al., 2002; Anselme e Bigerelle, 2005). Outros ainda consideram todas as fases da diferenciação, proliferação e adesão em curto prazo e longo prazo (Hunter et
al., 1995; Anselme et al., 2000b; Nishio et al., 2000; Mustafa et al., 2001; Suh et al., 2003; Lee et al., 2004).
Estudos in vivo e in vitro realizados com implantes têm demonstrado que as propriedades físicas e químicas dos biomateriais são capazes de regular a resposta tecidual inicial. Portanto, a interação biomaterial-célula depende das propriedades superficiais incluindo microestrutura, topografia, rugosidade e molhabilidade (Walboomers e Al, 1999; Ponsonnet et al., 2003; Winkelmann et
al., 2003).
Sabe-se que quando um biomaterial entra em contato com o meio biológico, as primeiras moléculas a alcançarem a sua superfície (escala de tempo de nanosegundos) são as de água. Em seguida, uma série de diferentes substâncias encontradas nos fluidos teciduais tais como: íons e proteínas, assim como células do tipo condroblastos, fibroblastos e osteoblastos reagem com a superfície conforme mostrado na figura 2.14 (Ellingsen, 1998).
Figura 2.14 – Representação da superfície do implante e sua interação com as moléculas do
fluido tecidual. (A) Implante. (B) Moléculas de água. (C) Camada glicoprotéica. (D) Célula (Adaptado de Kasemo, 2002).
Tem-se, portanto inicialmente, a formação de uma camada de proteínas sobre a superfície do biomaterial, nos primeiros instantes após o contato com o meio biológico. Essa camada é fruto das reações iniciais entre os constituintes teciduais e a superfície do implante e governará as futuras reações, determinando o tipo de resposta celular (Ellingsen, 1998).
Quando as células chegam à superfície, elas “encontram” uma superfície coberta de proteínas cuja camada tem propriedades que foram inicialmente determinadas pelas camadas de água pré-formada. Assim, quando se fala de interações superfície-célula, é em ultima análise a interação entre as células e as proteínas ligadas à superfície (Kasemo, 2002).
As propriedades da superfície do biomaterial irão proporcionar uma maior ou menor interação com a água e, por consequência, influenciarão as proteínas e outras moléculas que chegarão logo em seguida. A figura 2.15 esquematiza a interação de biomoléculas com a superfície de diferentes materiais, e suas influencias para a adsorção de proteínas e adesão celular (Kasemo, 2002).
Figura 2.15 – (1) Interação da superfície do material com a água. (2) Comportamento das proteínas de acordo com o conjunto superfície-água. (3) Células em crescimento na superfície ativa e em desnaturação na superfície inativa (adaptado de Kasemo, 2002).
As características da superfície determinarão quais moléculas irão adsorver, ao passo que a natureza e orientação dessas biomoléculas terão consequências diretas no recrutamento, ancoragem, proliferação e diferenciação das células (Vaz, 2007).
As ligações células-superfície são da ordem de 10 a 15 nm e recebem o nome de sítios de adesão ou contatos focais. Os contatos focais formam-se essencialmente em células com baixa mobilidade, devido ao fato destas células apresentarem receptores de superfície que reconhecem proteínas da matriz se associar a elas e, por conseguinte fixam as células. A arquitetura do
citoesqueleto celular é essencial na manutenção da forma e na adesão das células (Anselme et al., 2000c).
A interação osteoblasto-biomaterial depende de aspectos fundamentais do material, tais como topografia, química e energia de superfície. Estas características do material determinam como as moléculas serão adsorvidas e, mais particularmente, determinam a orientação das moléculas adsorvidas, bem como o comportamento da célula durante o contato (Boyan et al., 1996).
Células quando em contato com uma superfície primeiramente se ligam para em seguida aderir e espraiar. A primeira etapa, ou seja, a ligação depende de proteínas de adesão, tais como: selectinas, imunoglobulinas, caderinas e integrinas. A qualidade da adesão influenciará a morfologia e a capacidade da célula proliferar e diferenciar (Anselme et al., 2000b).
As integrinas são receptores transmembranicos e agem como uma interface entre o compartimento intra e extracelular. Deste modo auxiliam a troca de informações entre o meio externo e interno atuando na indução da adesão, propagação e migração celular e, por consequência, participam do crescimento e diferenciação celular (figura 2.16).
Figura 2.16 – Representação das proteínas celulares envolvidas na adesão do biomaterial
Osteoblastos humanos cultivados expressaram altos índices de integrinas α1β1, α3β1, α5β1 e α7β5 e níveis muito menores de integrinas α2β1, α4β1, α7β1 e α7β3 (Hughes et al., 1993). Ao que tudo indica a integrina β1 é um receptor predominante envolvido na adesão de osteoblastos (Gronthos et
al., 1997).
Comparando diferentes tipos de células em materiais semelhantes verificou-se que a resposta celular é diretamente relacionada à rugosidade superficial (Chesmel et al., 1995; Healy et al., 1996; Thomas et al., 1997). Observações por microscopia eletrônica de células ósseas em materiais com várias rugosidades tem demonstrado que as células se espraiam e formam uma camada celular contínua de melhor forma em superfícies rugosas que em superfícies lisas (Kieswetter et al., 1996; Anselme et al., 2000c).
O fenômeno de orientação de células osteoblasticas tem sido descrito. Em superfícies lisas as células orientam-se aleatoriamente enquanto que em superfícies rugosas, com rugosidade Ra acima de 0,5 µm as células orientam- se paralelamente à direção da rugosidade (Chesmel et al., 1995). Eisenbarth et al (2002) e Huang et al (2004) mostraram que células osteoblásticas seguem a orientação da rugosidade, conforme pode ser observado na figura 2.17 (Eisenbarth et al., 2002a; Huang et al., 2004).
Figura 2.17 – Morfologia celular em discos de titânio após 2 dias de cultura. (a) superfície
rugosa e (b) superfície polida (Eisenbarth et al., 2002a).
Estas células alinhadas, mostrando orientação com as ranhuras, tem melhor comportamento de adesão quando comparadas às células menos orientadas e às células de forma arredondada (Eisenbarth et al., 2002a).
As células orientadas tiveram alta densidade de contatos focais onde tinham contato com a borda das ranhuras da rugosidade, tendo mostrado melhor organização do citoesqueleto. Estas mudanças, na orientação das células podem levar a uma maior aderência em superfícies rugosas que em superfícies polidas (Eisenbarth et al., 2002b).
A distribuição dos contatos focais indica o modo de adesão de osteoblastos em diferentes rugosidades. Em superfícies lisas, os contatos focais ficam uniformemente distribuídos em toda a superfície da membrana os quais estão em contato com o substrato. Nas superfícies rugosas os contatos focais restringem-se às extremidades das extensões das células, onde a membrana celular está em contato com o substrato (Anselme, 2000a).
Para a adesão celular um outro parâmetro de grande importância são as características de hidrofilicidade e hidrofobicidade (Kieswetter et al., 1996; Rupp et al., 2006), uma vez que a energia de superfície pode influenciar a adsorção de proteínas e a reorganização estrutural das proteínas no material (Boyan et al., 1996). Segundo Altankov (1994) a adesão celular é melhor em superfícies hidrofílicas (Altankov e Groth, 1994).
Ponsonnet et al (2003) mostraram que a componente polar da energia de superfície, ou um baixo valor da fração de polaridade, foram os melhores parâmetros para a proliferação de fibroblastos (Ponsonnet et al., 2003). Mostraram ainda, que embora a energia de superfície tenha sido o fator dominante, a rugosidade pode afetar de forma considerável a relação energia de superfície e proliferação.
Assim pode-se constatar que os processos biológicos são fortemente influenciados pelas propriedades do material. A fim de melhorar estas interações muitas ligas de Ti foram desenvolvidas ao longo do tempo. Portanto este trabalho foi realizado com a finalidade de melhorar a interação do Ti-cp com células. A utilização deste tipo de Ti se deu com o intuito de diminuir os riscos futuros provenientes de elementos ligantes.
Capítulo 3
Metodologia
3 – Metodologia
O presente trabalho foi dividido em duas partes. A primeira parte consiste na preparação e caracterização de amostras de titânio com diferentes tratamentos térmicos. A segunda parte consiste na realização de ensaios biológicos para determinar a adesão e a proliferação de células pré- osteoblásticas sobre as superfícies previamente preparadas. A seguir na figura 3.1 é apresentado o organograma da realização do trabalho.
Figura 3.1 – Organograma da realização do trabalho
Tratamentos Térmicos Parte 1: Metalografia Parte 1: Caracterizações do Titânio Parte 2: Cultura de Células Parte 2: Caracterizações Biológica • MO • MEV (EBS, EDS, EBSD) • DRX / GIDRX • Ângulo de Contato • Energia de Superfície • Microdureza (HV) • Rugosidade • Análise de Imagens • MTT • Adesão • Expressão da integrina β1 • Lixamento • Polimento • Ataque químico
3.1 – Material de partida
Neste trabalho foram utilizados discos de titânio comercialmente puro (Ti-cp grau 2), com 15mm x 1,5mm (diâmetro x espessura) e composição química de acordo com a tabela 3.1 fornecidos pela empresa Realum Ind. Com. de Metais Puros e Ligas LTDA.
Tabela 3.1 – Composição química do titânio utilizado segundo o fornecedor. Discos de Ti ASTM F67 GR1Φ 15x1,50mm.
Elementos N C H Fe O Ti
% 0,011 0,011 0,004 0,04 0,085 Balanço
3.2 – Tratamentos térmicos dos discos de titânio
Os tratamentos térmicos foram realizados em forno resistivo (figura 3.2) utilizando o ar ambiente como atmosfera estática de trabalho. Colocou-se 15 amostras por vez para a realização da têmpera em 1100°C, 1000°C e 950°C respectivamente, mantendo-se essa temperatura por 1h (uma hora) e em seguida resfriando-se em água (volume de 6L) à temperatura ambiente, aproximadamente 25°C. Estas temperaturas foram utilizadas por estarem acima da temperatura beta transus e por possibilitarem a obtenção de diferentes microestruturas (Macêdo, 2008).
Das 15 amostras temperadas de cada condição anteriormente descrita, 5 permaneceram no estado temperado, 5 foram envelhecidas a 500°C e 5 foram envelhecidas a 700°C, todas por 4h. No caso do envelhecimento, o forno permaneceu fechado até atingir a temperatura ambiente de aproximadamente 25°C, conforme o esquema apresentado na figura 3.3 e descrição dada na tabela 3.2.
Figura 3.2 – Fotografia do forno utilizado para realização dos tratamentos térmicos – Laboratório de Tratamentos Térmicos do IFRN – Natal/RN
Tabela 3.2 – Simbologia e descrição dos tratamentos térmicos realizados. Simbologia Tratamento 11 Têmpera 1100°C (1h) 11R5 Têmpera 1100°C (1h) + Envelhecimento 500°C (4h) 11R7 Têmpera 1100°C (1h) + Envelhecimento 700°C (4h) 10 Têmpera 1000°C (1h) 10R5 Têmpera 1000°C (1h) + Envelhecimento 500°C (4h) 10R7 Têmpera 1000°C (1h) + Envelhecimento 700°C (4h) 95 Têmpera 950°C (1h) 95R5 Têmpera 950°C (1h) + Envelhecimento 500°C (4h) 95R7 Têmpera 950°C (1h) + Envelhecimento 700°C (4h)
ST Sem Tratamento (comercial)
3.3 – Preparação metalográfica
Uma amostra tratada de cada condição foi cortada transversalmente utilizando disco diamantado. Em seguida essa amostra, assim como todos os demais, foram embutidas em resina de poliéster e preparadas metalograficamente, passando pelas etapas de lixamento (lixas de granulometria variando de 80 # a 2000 #) até remover toda a camada formada durante a têmpera e polimento utilizando uma solução de 40% de sílica coloidal (1 micra) com 60% de peróxido de hidrogênio (30%).
Terminada a etapa de polimento os discos foram atacados quimicamente para revelação microestrutural, utilizando a solução Kroll (95mL de H2O + 10mL de HF + 5mL de HNO3). Em seguida os discos foram limpos
em banho ultrassônico utilizando detergente enzimático, álcool e água destilada, nesta ordem, sendo 10min de lavagem para cada líquido. Devidamente limpas as amostras foram secas e acondicionadas em embalagens apropriadas para uso posterior.
3.4 – Caracterizações das amostras
3.4.1 – Microscopia Ótica e Análise de Imagens da superfície
A técnica de microscopia ótica foi utilizada para análise da superfície e do perfil dos discos, bem como para a observação e análise das células aderidas à superfície dos discos. Para tanto foi utilizado um microscópio ótico de luz refletida da marca Olympus modelo BX 60M com uma câmera digital acoplada e conectada a um computador.
Para aquisição das fotomicrografias utilizou-se o software Image Pro
Plus versão 6.0. As fotomicrografias da superfície das amostras foram obtidas
em seis regiões do disco distribuídas conforme ilustra a figura 3.4. A delimitação dessas regiões foi feita utilizando microdureza Vickers (HV), de forma que a cada conjunto de 3 marcações de microdureza representa uma região a ser analisada (quadrantes e centro).
Figura 3.4 – Ilustração dos locais marcados para as análises das células sobre os discos.
3.4.2 – Microscopia eletrônica de Varredura (BSE, EDS e EBSD)
Foram utilizados dois microscópios eletrônicos de varredura – MEV, ambos de marca PHILLIPS e modelo XL30. O primeiro equipado com detetores de elétrons secundários (SE) e de elétrons retro-espalhados (BSE),
pertencente ao Núcleo de Estudos de Petróleo e Gás Natural – NEPGN da UFRN. Este equipamento foi utilizado no modo BSE para aquisição de imagens da microestrutura da borda dos discos temperados.
O segundo MEV utilizado pertence ao LACAM/DEMM da UFC e possui além dos detetores SE e BSE, os detetores de energia dispersiva de raios-x (EDS) de marca EDAX e de difração de elétrons retro-espalhados (EBSD) de marca HKL. Este ultimo detetor foi utilizado para análise das fases presentes após os tratamentos térmicos. O software utilizado na aquisição foi o Flamenco
Channel 5, já o processamento dos resultados foi realizado com os softwares Tango e o Mango.
Para utilização da técnica de EBSD o porta amostra foi rotacionado de 70°. Esta técnica consiste em analisar a difração de elétrons retro-espalhados. Como resultado obtém-se: mapas de orientação cristalográfica, no qual cada orientação tem uma cor associada, mapas de contornos de grãos e de fases, figuras de polo e figuras de polo inversa. Neste trabalho somente foi utilizado os mapas de orientação e o de fases.
Para análise de EBSD foi delimitado uma área de aproximadamente 50% do campo de visão referente a um aumento de 100x, representada pela área colorida da Figura 3.5. Durante o processamento dos resultados foi definido que estruturas cristalinas hexagonais (referentes às fases α e α’ do titânio) fossem coloridas de vermelho, estruturas ortorrômbicas (referentes à fase α’’) de amarelo e estruturas cúbicas de corpo centrado (referentes à fase β do titânio) de azul, para identificação das fases presentes.
Figura 3.5 – Região de análise de EBSD. A imagem cinza refere-se a uma ampliação de 100x e a colorida refere-se somente a parte analisada por EBSD.
3.4.3 – Difração de Raios-X (DRX)
Utilizou-se um difratômetro de raios-X da SHIMADZU modelo XRD-6000 pertencente ao Núcleo de Estudos de Petróleo e Gás Natural – NEPGN da UFRN. Foram utilizadas duas configurações de incidência do feixe. A primeira configuração utilizada foi a Brag-Bretano, ou θ~2θ para varredura entre 20° e 80° numa velocidade de 2°/min e para varredura de 33° a 43° numa velocidade de 0,25°/min. A segunda configuração foi a de incidência rasante (GIDRX) para o ângulo de 6° e varredura entre 20° e 80° numa velocidade de 2°/min esta configuração foi utilizada com a finalidade de obter informações mais superficiais possível.
3.4.4 – Microdureza Vickers
O equipamento utilizado neste ensaio foi um microdurômetro digital HVS 1000 da PANAMBRA. Foram realizadas 18 identações (impressões de microdureza) distribuídas por toda a superfície da amostra conforme a figura 3.4 A carga aplicada foi de 100g durante 15s. Essas impressões de
microdureza na superfície também foram utilizadas para localização das regiões de análise celular (figura 3.6a).
Testes de microdureza foram ainda realizados na secção transversal da amostra. As impressões neste caso foram realizadas de forma a se ter uma média para comparação do valor da microdureza na microestrutura da camada figura 3.6b e na microestrutura do núcleo figura 3.6c.
Figura 3.6 – Micrografias das marcações de microdureza: (a) marcações na superfície que
delimitam a área de análises futuras, (b) marcação na camada externa e (c) marcação no núcleo.
3.4.5 – Rugosidade
Para análise da rugosidade foi utilizado um rugosímetro TIME modelo TR300 do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Piauí – IFPI. Foram analisados os parâmetros: rugosidade média aritmética (Ra), altura máxima do pico (Rp), profundidade máxima do vale (Rv), rugosidade média entre os cinco maiores picos e os cinco maiores vales (Rz), distancia vertical máxima entre o pico mais alto e o vale mais profundo (Rt). Calculou-se a razão Rp/Rz para saber se os picos na superfície eram pontiagudos ou arredondados. Os valores apresentados nos resultados foram uma média de 5 (cinco) medições paralelas aproximadamente equidistantes de 2 mm.
3.4.6 – Molhabilidade
Para o estudo da molhabilidade, utilizou-se o método da gota séssil. Os líquidos utilizados foram água, formamida, glicerol e meio de cultura ALFA- MEM, o volume das gotas foi de 10 µL. O goniômetro utilizado nesta análise foi
(a) (b) (c)
desenvolvido no Laboratório de Processamento de Materiais por Plasma - LabPlasma/UFRN e o esquema do mesmo é apresentado na figura 3.7.
Figura 3.7 – Esquema do goniômetro utilizado para medição do ângulo de contato.
3.4.6.1 – Ângulo de Contato
Para determinar o ângulo de contato, colocou-se a amostra sobre a base do goniômetro e em seguida gotejou-se água e meio de cultura, enriquecido com soro fetal bovino, sobre a superfície dos discos. Este procedimento foi acompanhado em tempo real e os resultados foram armazenados através do software Pinnacle Studio QuickStart versão 8. Em seguida, ainda usando o
Pinnacle Studio, isolou-se uma imagem referente ao instante de 60 segundos.
De posse destas imagens passou-se então a utilizar outro software, o
Surftens (versão demo). Com auxílio deste programa foram feitas 5 (cinco)
marcações gerando-se um circulo e sua respectiva tangente, conforme é mostrado na figura 3.8. Os valores de ângulo de contato que serão apresentados neste trabalho representam uma média das medições de três imagens sendo que foram feitas cinco medidas para cada imagem, ou seja, uma média de 15 medições.
Figura 3.8 – Gota de 10 µL de água depositada sobre um disco de titânio. Medição do ângulo de contato por meio do Surftens.
3.4.6.2 – Energia de Superfície
A Energia de superfície foi calculada utilizando a equação de Fowkes (Equação 1) (Rajendra e Narendra, 2003). Para tanto, foram utilizados os valores dos ângulos de contato medidos anteriormente e os valores das componentes polar e dispersiva de cada uma dos líquidos, estes dados são apresentados na tabela 3.3.
[ ] [
√ ] √ √ √ (1)
Tabela 3.3 – Energia superficial dos líquidos usados.
Líquidos ( ⁄ ) ( ⁄ ) ( ⁄ ) Água 72,8 51,0 21,8 Formamida 58,2 18,7 39,5 Glicerol 63,4 26,2 37,2 θ
3.5 – Ensaios em Cultura de Células
Após o processamento metalográfico reservou-se três amostras de cada condição de tratamento e três não tratadas para realização das análises biológicas. Estas amostras foram então levadas ao Laboratório de Biotecnologia e Polímeros Naturais – BIOPOL no Centro de Biociências da UFRN, para esterilização por autoclavagem a 120°C por 30min e realização dos ensaios biológicos.
Posteriormente, às etapas de limpeza, o experimento seguiu em ambiente estéril numa câmara de fluxo laminar. Os discos foram colocados numa placa de cultura de 24 poços, sendo um disco por poço. Em seguida adicionou-se 1mL de meio de cultura celular (ALFA-MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico juntamente com células pré- osteoblásticas de linhagem MC3T3-E1 ( células por poço), figura 3.9. As placas permaneceram em condição de cultura celular em câmara de CO2 a
37°C.
Figura 3.9 – Fotografia ilustrativa da placa de 24 poços
3.5.1 – Proliferação por microscopia ótica e análise de imagens
Para realização do teste de proliferação analisado por microscopia ótica de luz refletida os discos com as células permaneceram em condição de cultura conforme descrito anteriormente por 24h. Após este período o meio de cultura foi retirado, sendo então adicionado paraformaldeido a 4% por 15min, em seguida foi realizado três lavagens com PBS e só então as células foram fixadas em metanol.
As análises óticas das células aderidas ao substrato foram realizadas a partir de imagens adquiridas nas mesmas regiões marcadas previamente. O software Image Pro Plus foi novamente utilizado, desta vez para quantificar as células sobre cada disco, analisar suas morfologias e área ocupada pelas células. Tais medidas foram realizadas para cada uma das imagens referentes às 6 regiões marcadas e, como estão em triplicata, totalizam 18 imagens para cada condição de tratamento.