UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E ENGENHARIA DE MATERIAIS
TESE DE DOUTORADO
Tratamento Térmico do Titânio e suas Consequências Sobre as Propriedades Físico-químicas e de Biocompatibilidade
HAROLDO REIS ALVES DE MACÊDO
Orientador: Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior
Tese n° 99/PPGCEM
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E
ENGENHARIA DE MATERIAIS
Haroldo Reis Alves de Macêdo
Tratamento Térmico do Titânio e suas Consequências Sobre as Propriedades Físico-químicas e de Biocompatibilidade
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências e Engenharia de Materiais do Centro de Ciências Exatas e da Terra da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências e Engenharia de Materiais.
Orientador: Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior.
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede
Macêdo, Haroldo Reis Alves de.
Tratamento térmico do titânio e suas conseqüências sobre as propriedades físico-químicas e de biocompatibilidade / Haroldo Reis Alves de Macêdo. – Natal, RN, 2012.
107 f.; il.
Orientador: Clodomiro Alves Júnior.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais.
1. Biologia celular – Tese. 2. Titânio – Tratamento térmico -Tese. 3. Resposta biológica – Tese. 4. Biocompatibilidade – Tese. I. Alves Júnior, Clodomiro. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
Dedico este trabalho a minha família e à minha esposa Marina pelo amor, compreensão, carinho e incentivo nas dificuldades e a todos que direta ou indiretamente contribuíram para sua concretização.
Agradecimentos
A Deus pela sabedoria e saúde ....
A minha mãe Teresa Cristina e a meu pai Haroldo Macedo pelo incentivo e apoio.
A minha esposa, Marina, pelo seu amor e por sempre ter me ajudado na escrita dos trabalhos.
Ao professor Dr. Clodomiro Alves Júnior pela orientação deste trabalho, pelo incentivo e pela amizade.
Ao professor Dr. Hugo Alexandre por ter cedido o laboratório, as células utilizadas neste trabalho e principalmente pela orientação nos assuntos relacionados à parte biológica, a seus alunos em especial a Raniere e a Moacir pela colaboração na execução dos ensaios biológicos.
Ao professor Dr. Hamilton da UFC por ter cedido o laboratório de microscopia para a realização da caracterização por EBSD e ao Flavio, técnico deste laboratório que operou o equipamento na realização das análises.
Ao professor Dr. Jorge Lourenço do IFRN por ter cedido o forno para realização dos tratamentos térmicos.
Ao professor Dr. Carlos Eduardo e ao HEMONORTE pela realização dos ensaios com as integrinas.
Ao Erico, Artejose e Leopoldino, técnicos do NEPGN/UFRN que muito contribuíram na realização das analises de DRX e MEV.
Ao professor Dr. Wanderson Santana pelos conhecimentos repassados no que se refere às microestruturas decorrentes de tratamentos térmicos.
A todos os professores da Engenharia de Materiais pelo apoio e competência em ministrar as disciplinas do curso.
Aos amigos Professores Dr. Ayrton de Sá Brandim, Dr. Marcio Cleto e Dr. Luiz Fernando pela amizade, incentivo e apoio no meu aprimoramento acadêmico.
A todos os integrantes do LABPLASMA pela convivência fraterna durante os anos que estive no mesmo em especial aos que tive mais proximidade: Marcio Willians, Narayanna, Duciane, Raquel, Jussier, Natalia, etc.
Resumo
Macêdo, H.R.A, Tratamento Térmico do Titânio e suas Consequências Sobre as Propriedades Físico-químicas e de Biocompatibilidade. 2012. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2012.
O titânio e suas ligas são amplamente utilizados como biomaterial em dispositivos biomédicos e devido a isso pesquisas têm sido desenvolvidas visando aperfeiçoar e/ou compreender melhor a interação biomaterial/meio biológico. O processo de fabricação desses dispositivos de titânio geralmente envolve uma série de processos térmicos e mecânicos e que têm consequências no produto final. Os tratamentos térmicos são usualmente utilizados para obtenção de propriedades diferenciadas para cada aplicação. Com o intuito de entender a influência desses tratamentos sobre a resposta biológica da superfície, foram realizados, no presente trabalho, diferentes tratamentos térmicos em titânio e analisadas suas influências na morfologia, adesão e proliferação de células pré-osteoblástica (MC3T3-E1). Para tanto os discos de titânio tratados termicamente foram caracterizados por microscopia ótica, ângulo de contato, energia de superfície, rugosidade, microdureza Vickers, difração de raios-X e microscopia eletrônica de varredura através das técnicas de EBS, EDS e EBSD. Para análise da resposta biológica foram realizados teste de proliferação por MTT, adesão por cristal violeta e expressão da integrina β1 por citometria de fluxo. Foi verificado que na presença de uma microestrutura muito ordenada, definida através de um ataque químico, as células tendem a se alongar no mesmo sentido da orientação microestrutural do material. Quando essa ordem não acontece, o fator mais importante a influenciar na proliferação celular é a tensão residual, indicada pela dureza do material. Deste modo os discos que apresentaram maior estado de tensão residual apresentaram também maior proliferação celular.
Palavras-chaves: Titânio, Microestrutura, Resposta Biológica, Biocompatibilidade.
Abstract
Macêdo, H.R.A, Heat treatment of titanium and their consequence in physicochemical and biocompatibility properties. 2012. Thesis (Doctoral) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2012.
The titanium and titanium alloys are widely used as biomaterial in biomedical device and so research have been developed aiming to improve and/or better to understand interaction biomaterial/biological environment. The process for manufacturing of this titanium implants usually involves a series of thermal and mechanical processes which have consequence on the final product. The heat treatments are usually used to obtain different properties for each application. In order to understand the influence of these treatments on the biological response of the surface, it was done, in this work, different heat treatments in titanium and analyzed their influence on the morphology, adhesion and proliferation of the pre-osteoblastic cells (MC3T3-E1). For such heat-treated titanium disks were characterized by optical microscopy, contact angle, surface energy, roughness, microhardness, X-ray diffraction and scanning through the techniques (BSE, EDS and EBSD). For the analysis of biological response were tested by MTT proliferation, adhesion by crystal violet and β1 integrin expression by flow cytometry. It was found that the presence of a microstructure very orderly, defined by a chemical attack, cells tend to stretch in the same direction of orientation of the material microstructure. When this order does not happen, the most important factor influencing cell proliferation is the residual stress, indicated by the hardness of the material. This way the disks with the highest level state of residual stress also showed increased cell proliferation.
Lista de Figuras
Figura 2.1 Transformação alotrópica do titânio ... 24 Figura 2.2 Diagramas de fases do titânio de acordo com seus
elementos de liga: (a) α-estabilizador, (b) β-estabilizador do tipo eutetóide, (c) β-β-estabilizador do tipo isomorfo e (d) neutro ... 25 Figura 2.3 Diagrama de fases para as ligas de titânio mostrando as
transformações martensita em função da temperatura e da concentração de elementos estabilizadores de fase baseado nas linhas de transformação martensita ... 27 Figura 2.4 Diagrama parcial de fases de sistemas constituídos pelo
titânio e por elemento β-estabilizadores ... 29 Figura 2.5 Diagrama esquemático da formação da estrutura de
Widmanstäntten na liga Ti-6Al-4V ... 31 Figura 2.6 Diagrama TTT pra uma liga de titânio α+β ... 34 Figura 2.7 Microestrutura por microscopia ótica do titânio
comercialmente puro grau 2 sem tratamento ... 35 Figura 2.8 Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura
da liga Ti17 tratada isotermicamente a 750°C por (a) 360s e (b) 9400s. αGB – contorno de grão e αWGB – contorno de grão Widmanstätten. A morfologia αWGB é composta por colônias de placas α paralelas frequentemente com a mesma orientação, que crescem a partir de αGB ... 35 Figura 2.9 Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura
da liga Ti-6Al-2Sn-4Zr-6Mo. São mostrados grãos β delimitados por contornos de grãos α ... 36 Figura 2.10 Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura
da liga Ti-6Al-4Va. São mostrados grãos α e β ... 36 Figura 2.11 Micrografia do Ti-cp temperado em ar a partir de 900°C
recoberto por camadas de oxinitreto e de óxido de titânio ... Figura 2.12 Difratograma padrões para o titânio comercialmente
puro: (a) fase α, (b) fase β ... 38
Figura 2.13 Propriedades dos materiais que estão relacionadas à biocompatibilidade ... 39
Figura 2.14 Representação da superfície do implante e sua interação com as moléculas do fluido tecidual. (A) Implante. (B) Moléculas de água. (C) Camada glicoprotéica. (D) Célula ... 40
Figura 2.15 – (1) Interação da superfície do material com a água. (2) Comportamento das proteínas de acordo com o conjunto superfície-água. (3) Células em crescimento na superfície ativa e em desnaturação na superfície inativa 42 Figura 2.16 Representação das proteínas celulares envolvidas na adesão do biomaterial ... 43
Figura 2.17 Morfologia celular em discos de titânio após 2 dias de cultura. (a) superfície rugosa e (b) superfície polida ... 44
Figura 3.1 Organograma da realização do trabalho ... 47
Figura 3.2 Fotografia do forno utilizado – Laboratório de tratamentos térmicos do IFRN – Natal/RN ... 49
Figura 3.3 Esquema dos tratamentos térmicos realizados ... 49
Figura 3.4 Ilustração dos locais marcados para as análises ... 51
Figura 3.5 Região de análise de EBSD ... 53
Figura 3.6 Micrografias das marcações de microdureza em: (a) marcações na superfície que delimitam a área de análises futuras, (b) marcação na camada externa e (c) marcação no núcleo ... 54
Figura 3.7 Esquema do goniômetro para medição do ângulo de contato ... 55
Figura 3.8 Gota de 10 µL de água depositada sobre um disco de titânio. Medição do ângulo de contato por meio do surftens ... 56
Figura 3.9 Fotografia ilustrativa da placa de 24 poços utilizada na cultura de células... 57 Figura 3.10 Ilustração do contorno das células utilizado para
aquisição dos dados das células sobre os discos, utilizando o software Image Pro Plus ... 59 Figura 3.11 Espectrofotômetro específico para leitura de placas de
96 poços – laboratório de genética do CB/UFRN ... 60 Figura 4.1 Micrografias do disco de titânio sem tratamento. (a)
micrografia ótica e (b) micrografia por MEV com medição dos tamanhos dos grãos ... 64 Figura 4.2 Micrografia por microscopia ótica da amostra temperada
em água (1100°C). Constituída de uma estrutura de lamelas macladas e em alguns pontos uma estrutura
em forma de placas ... 65
Figura 4.3 Micrografia por microscopia ótica da microestrutura de uma amostra temperada a 950°C, em água ... 66 Figura 4.4 Micrografia por microscopia ótica das microestruturas
das amostras envelhecidas a 500°C por 4h ... 67 Figura 4.5 Micrografia por microscopia ótica das microestruturas
das amostras envelhecidas a 700°C por 4h ... 67 Figura 4.6 Microscopia ótica do corte transversal mostrando as
diferentes estruturas dos discos temperados ... 68 Figura 4.7 Medição por MEV da espessura das camadas formadas
durante a têmpera ... 69 Figura 4.8 EDS da borda dos discos temperados a 1100°C ... 70 Figura 4.9 Difratogramas para as diferentes camadas presente nos
discos. (a) núcleo martensítico (b) camada 1 – oxinitreto de titânio e (c) camada 2 – dióxido de titânio ... 71 Figura 4.10 Difratogramas do núcleo dos discos de titânio
temperados - varredura de 20° a 80° ... 73 Figura 4.11 Imagens de EBSD na interface do núcleo martensítico
com a camada 1 do disco temperado a 1100°C (a) região de análise (b) mapa de cores das estruturas 74
cristalinas, apresentando somente estrutura hexagonal compacta ... Figura 4.12 Mapas de cores para estruturas cristalográficas. Em
todas as condições de tratamento apresentaram somente estrutura hexagonal compacta ... 75 Figura 4.13 Microdureza Vickers – corte transversal ... 76 Figura 4.14 Microdureza Vickers – Superficial ... 77 Figura 4.15 Ângulo de contato na superfície dos discos de titânio
para água e para o meio de cultura celular (alfa-MEM) .. 78 Figura 4.16 Energia de superfície e suas componentes polar e
dispersiva para as diferentes condições de tratamento .. 79 Figura 4.17 Microscopia ótica das células aderida no titânio –
Orientação das células conforme a microestrutura ... 81 Figura 4.18 Número de células aderidas para as diferentes
condições, contadas a partir de análise de imagens ... 84 Figura 4.19 Porcentagem de área coberta por células ... 85 Figura 4.20 Morfologia celular. Células arredondadas (<1,5), células
parcialmente espraiadas (>1,5 e <2) e totalmente espraiadas (>2) ... 86 Figura 4.21 Proliferação por MTT ... 87 Figura 4.22 Adesão celular para 1, 2 e 3 horas de cultura ... 88 Figura 4.23 Histograma da expressão da integrina β1 para as
diferentes condições de tratamento do titânio ... 89 Figura 4.24 Razão IMF das amostras tratadas pelo controle
negativo/isotípico ... 89 Figura 4.25 Relação ângulo de contato e proliferação celular ... 90 Figura 4.26 Comparação do comportamento dos gráficos da
proliferação com as componentes da energia de
superfície 91
Figura 4.27 Comparação do comportamento dos gráficos da proliferação com a fração de polaridade ... 92 Figura 4.28 Comparação do comportamento dos gráficos da
Figura 4.29 Relação microdureza e proliferação celular ... 94 Figura 4.30 Mapa de orientação cristalográfica, onde cada cor
Lista de Tabelas
Tabela 2.1 Composição química de Ti-cp (% em peso) segundo a ASTM. O Ti-cp grau 2 está grifado para indicar o grau de pureza do Ti que foi utilizado neste trabalho ... 22 Tabela 2.2 Propriedades do titânio comercialmente puro... 23 Tabela 3.1 Composição química do titânio utilizado segundo
fornecedor. Discos de Ti ASTM F67 GR1Φ 15x1,50mm ... 48 Tabela 3.2 Simbologia e descrição dos tratamentos dos
tratamentos térmicos realizados ... 50 Tabela 3.3 Energia de superfície dos líquidos usados ... 56 Tabela 4.1 Relação das distancias interplanares e da largura a
meia altura dos principais picos comuns nos difratogramas ... 73 Tabela 4.2 Fração de polaridade calculada a partir das
componentes polar e dispersiva da energia de superfície dos discos de Ti ... 80 Tabela 4.3 Parâmetros de rugosidade dos discos de Ti ... 80 Tabela 4.4 Valores de Intensidade média de fluorescência para
todas as condições utilizadas neste trabalho. Para todas as condições tratadas o IMF é maior que o não tratado e que todos são maiores que o controle negativo/isotípico ... 88
Lista de Abreviaturas e Símbolos
ASTM – American society for testing and materials HC – Estrutura hexagonal
CCC – Estrutura cúbica de corpo centrado α – Fase alfa primaria de estrutura hexagonal α’ – Fase martensita de estrutura hexagonal α’’ – Fase martensita de estrutura ortorrômbica β – Fase beta de estrutura cúbica de corpo centrado TTT – Diagrama tempo, temperatura e transformação Ti-cp – Titânio comercialmente puro
MEV – Microscopia eletrônica de varredura ES – Elétrons secundários
BSE – Elétrons retroespalhados
EDS – Difração de elétrons secundários EBSD – Difração de elétrons retoespalhados DRX – Difratômetro de raios-X
GIDRX – Difração de raios-X em incidência rasante Ra – Rugosidade média aritmética
Rp – Altura máxima do pico
Rv – Profundidade máxima do vale
Rz – Rugosidade média entre os cinco maiores picos e os cinco maiores vales Rt – Altura máxima do pico mais alto e o vale mais profundo
θ – Ângulo de contato – Energia superficial
– Componente polar da energia de superfície – Componente dispersiva da energia de superfície FP – Fração de polaridade
ALFA-MEM – Meio de cultura celular SFB – Soro fetal bovino
β1 – Integrina de ligação célula-substrato
IMF – Intensidade média de fluorescência
Sumário
1 – Introdução ... 18
2 – Revisão Bibliográfica ... 22
2.1 – Titânio ... 22
2.1.1 – Elementos estabilizadores de alfa e beta ... 24
2.1.1.1 – Ligas α ... 26 2.1.1.2 – Ligas quase α ... 27 2.1.1.3 – Ligas α+β ... 28 2.1.1.4 – Ligas quase β ... 28 2.1.1.5 – Ligas β ... 29 2.1.2 – Tratamento Térmico ... 30 2.1.2.1 – Têmpera e Revenimento ... 31
2.1.2 – Transformação Martensita do Titânio ... 32
2.1.3 – Microestruturas do Titânio ... 33
2.2 – Interação do Titânio com o Meio Biológico – O Titânio como Biomaterial ... 38
3 – Metodologia ... 47
3.1 – Material de partida ... 48
3.2 – Tratamentos térmicos dos discos de titânio ... 48
3.3 – Preparação metalográfica ... 50
3.4 – Caracterizações das amostras ... 51
3.4.1 – Microscopia Ótica e Análise de Imagens ... 51
3.4.2 – Microscopia Eletrônica de Varredura ... 51
3.4.3 – Difração de Raios-X ... 53 3.4.4 – Microdureza Vickers ... 53 3.4.5 – Rugosidade ... 54 3.4.6 – Molhabilidade ... 54 3.4.6.1 – Ângulo de Contato ... 55 3.4.6.2 – Energia de Superfície ... 56
3.5 – Ensaio em Cultura de Células ... 57 3.5.1 – Proliferação por microscopia ótica e análise de
3.5.2 – Proliferação MTT ... 59
3.5.3 – Adesão ... 60
3.5.4 – Avaliação da Expressão de integrinas ... 61
3.6 – Análise Estatística ... 62 4 – Resultados e discussões ... 64 4.1 – Caracterizações do Titânio ... 64 4.1.1 – Microestruturas ... 64 4.1.2 – Fases ... 70 4.1.2.1 – Difração de Raios-X ... 70
4.1.2.2 – Difração de elétrons retroespalhados 73 4.1.3 – Microdureza Vickers ... 75
4.1.4 – Ângulo de Contato ... 78
4.1.5 – Energia de Superfície ... 78
4.1.6 – Rugosidade ... 80
4.2 – Caracterização da Resposta Biológica ... 81
4.2.1 – Orientação Celular ... 81
4.2.2 – Proliferação e Morfologia por Análises de Imagens ... 83
4.2.3 – Análise de Proliferação Celular ... 86
4.2.4 – Avaliação da Adesão Celular ... 87
4.2.5 – Expressão de Integrinas ... 88
4.3 – Correlação dos Resultados Biológicos com as Propriedades Obtidas para o Titânio ... 90
4.3.1 – Ângulo de Contato X Proliferação ... 90
4.3.2 – Energia de Superfície X Proliferação ... 91
4.3.3 - Rugosidade X Proliferação ... 92
4.3.4 – Microdureza Vickers X Proliferação ... 93
4.3.5 – Orientação Cristalográfica X Proliferação ... 94
5 – Conclusões e Sugestões ... 96
5.1 – Conclusões ... 97
5.2 – Sugestão de Trabalhos Futuros ... 98
Lista de Trabalhos Publicados ... 99
Capítulo 1
Introdução
1 – Introdução
Com o advento de novos dispositivos para aplicações biomédicas, é notória a utilização do titânio e suas ligas como biomaterial. Nesse sentido, o conhecimento das suas características superficiais é de fundamental importância, principalmente aquelas relacionadas com sua resposta quando inseridas num meio biológico. Sabe-se que a fabricação de qualquer dispositivo envolve uma série de processos térmicos, mecânicos e/ou químicos, que podem influenciar a sua resposta quando inserido num meio biológico. Algumas vezes esses processos são utilizados propositadamente para modificar as propriedades físicas e/ou químicas da superfície. Outras vezes eles são necessários durante a fundição, conformação, estampagem e usinagem, entre outros. Nesse último caso o estado final da peça poderá depender do processo de fabricação. Portanto, conhecer o quanto a resposta biológica de uma superfície é sensível a essas variações de propriedades é de fundamental importância para a confiabilidade do uso desses dispositivos. No caso de implantes, por exemplo, há a necessidade de se definir uma superfície compatível com uma boa resposta biológica, isto é imperativo na pesquisa básica de implantes (Amarante e Lima, 2001). Qualquer implante, uma vez em contato com o meio biológico, é caracterizado por mudanças dinâmicas em suas propriedades superficiais envolvendo uma cascata de reações que ocorre entre o meio biológico e o biomaterial formando um “filme de condicionamento” que modula as respostas celulares (Puleo e Nanci, 1999).
Segundo Schneider (1994) e Macdolnad (2002) a molhabilidade e a energia superficial exercem um importante papel na adsorção de proteínas, aumentando a formação de adesões de osteoblastos na superfície do implante (Schneider e Burridge, 1994; Macdonald et al., 2002). A rugosidade e a molhabilidade interferem nos processos de adsorção de proteínas, com isso é possível que células sejam fortemente influenciadas por ambos, se chegarem à superfície do implante (Rupp et al., 2004). Macêdo (2011) por sua vez indica a tensão residual como um forte influenciador da proliferação de células pré-osteoblásticas.
Compreender como um processo de fabricação possa influenciar, bem como quantificar o efeito de pequenas flutuações do processo sobre a resposta
biológica do dispositivo é o foco do presente trabalho. Na busca por superfícies que supram a necessidade de obter uma resposta biológica mais rápida, várias pesquisas têm sido desenvolvidas, modificando as propriedades de superfície pelos mais variados processos (Silva et al., 2006) dentre os quais se destaca os métodos mecânicos, químicos e físicos de tratamento de superfície, que permitem obter os mais variados graus de texturas (Liu et al., 2004).
Os tratamentos utilizados neste trabalho foram do tipo térmico em forno resistivo por ser um dos mais utilizados nas indústrias durante o processo de fabricação dos implantes. Estes tratamentos também possibilitam diversas combinações entre as propriedades mecânicas e de biocompatibilidade, uma vez que geram modificações na estrutura interna dos materiais que, por conseguinte modificam as propriedades se superfície afetando diretamente a resposta biológica.
O presente trabalho teve como objetivo geral modificar a microestrutura do titânio através de tratamentos térmicos e relacionar a influência dessa microestrutura e das propriedades sobre a resposta biológica. Principalmente no que se refere à proliferação de células pré-osteoblásticas, tendo para isso os seguintes objetivos específicos:
Caracterizar as microestruturas e suas respectivas fases, obtidas por meio do tratamento térmico comparativamente ao Ti na condição como recebido;
Determinar valores para as propriedades superficiais (rugosidade, ângulo de contato, energia de superfície, dureza) que favoreçam a proliferação celular;
Avaliar a adesão, proliferação e morfologia as células sobre os discos de Ti;
Identificar qual a propriedade mais influencia na proliferação de células pré-osteoblasticas.
Este estudo foi dividido em duas etapas a primeira dedicada à caracterização do material antes e após os tratamentos térmicos utilizando técnicas como: microscopia ótica, microscopia eletrônica, difração de raios-X, ângulo de contato, energia de superfície e microdureza. Já a segunda etapa foi dedicada à caracterização do comportamento das células quando cultivadas sobre esses discos nas diferentes condições de tratamento. Estas foram analisadas segundo os seguintes parâmetros: i) análise de imagens (quantidade e morfologia celular, área ocupada por células, orientações
preferenciais), proliferação por MTT, adesão por cristal violeta e expressão da integrina β1.
Capítulo 2
2 – Revisão Bibliográfica 2.1 – Titânio
O titânio é o quarto elemento metálico mais abundante no nosso planeta. Pode ser encontrado em minérios ricos em óxidos de titânio, como o rutilo que é rico em TiO2 ou como a ilmenita, rica em FeTiO3. Embora seja abundante na
natureza, relatos de sua extração e utilização são bastante recentes, tendo sido obtido na forma metálica apenas em 1910 e somente na década de 1930 foi obtido em volumes significativos com a concepção do processo Kroll e desde então a produção, o emprego do titânio e de suas ligas vem crescendo nas indústrias química, petroquímica, alimentícia, farmacêutica, aeronáutica, espacial e médica (Lütjering e Willians, 2007).
O titânio é um metal de transição pertencente à família IVB da tabela periódica, com número atômico 22, peso atômico 47,90 g/mol, raio atômico 0,1445 nm e densidade 4,45 g/cm3. Em termos de densidade, o titânio é 40% mais leve que o aço e 60% mais pesado que o alumínio. O titânio possui elevada resistência à corrosão que se deve à formação de um filme de óxido protetor junto à sua superfície. Este filme, de óxido superficial, permite que o titânio seja aplicado em condições adversas, como por exemplo, ambiente salinos e meio biológico (Lütjering e Willians, 2007).
Em termos de classificação, a American Society for Testing and Materials (ASTM) define que existem quatro classes principais de titânio comercialmente puro (Ti-cp): ASTM Grau 1 a 4. Cada grau está associado a um diferente teor de impurezas, sendo o grau 1 (um) o mais puro. Na tabela 2.1 são apresentadas as composições químicas do Ti-cp para os quatros graus de pureza e na tabela 2.2 as respectivas propriedades (Donachie, 1988).
Tabela 2.1 – Composição química de Ti-cp (% em peso) segundo a ASTM. O Ti-cp grau 2 está
grifado para indicar o grau de pureza do Ti que foi utilizado neste trabalho (Donachie, 1988).
Tipo de Ti Fe C H N O Ti Grau 1 Máx. 0,2 Máx. 0,1 Máx. 0,015 Máx. 0,03 Máx. 0,18 99,5 Grau 2 Máx. 0,3 Máx. 0,1 Máx. 0,015 Máx. 0,03 Máx. 0,25 99,2 Grau 3 Máx. 0,3 Máx. 0,1 Máx. 0,015 Máx. 0,03 Máx. 0,35 99,1 Grau 4 Máx. 0,5 Máx. 0,1 Máx. 0,015 Máx. 0,03 Máx. 0,4 99,0
Tabela 2.2 – Propriedades do titânio comercialmente puro (Mitsuo, 1998). Tipo de Ti Lim. Res. (MPa) Lim. Esc. (MPa) Along. (%) Red. área (%) Mód. Elast. (GPa) Classe de Liga Grau 1 240 170 24 24 102,7 α Grau 2 345 275 20 20 102,7 α Grau 3 450 380 18 18 103,4 α Grau 4 550 485 15 15 104,1 α
Como o titânio é um elemento de transição que tem uma camada incompleta em sua estrutura eletrônica no estado fundamental pode ocorrer a formação de solução sólida com a grande maioria de elementos que possuem raios atômicos com valores de até 15% de diferença. O processamento desse metal é complexo, principalmente devido a sua susceptibilidade a elementos intersticiais como oxigênio, nitrogênio, hidrogênio e carbono.
Quando puro, o titânio exibe duas formas alotrópicas. Até 882,5°C sua estrutura cristalina é do tipo hexagonal compacta (HC), denominada de fase α. Acima dessa temperatura, a estrutura cristalina é do tipo cúbica de corpo centrado (CCC), definida como fase β. Tal arranjo cristalino é estável até a fusão, em 1.672 °C conforme é mostrado na figura 2.1. Essa transformação de fases pode ser eventualmente alterada a partir da adição de elementos de liga ao titânio. Esses elementos podem estabilizar as fases: i) alfa, neste caso, chamados de alfa-estabilizadores uma vez que aumentam a temperatura em que é possível obter a fase alfa estável e/ou ii) beta, chamados de beta-estabilizadores, estes elementos diminuem a temperatura em que é possível obter a fase beta estável (Donachie, 1988; Lütjering e Willians, 2007).
Figura 2.1 – Transformação alotrópica do titânio (adaptado de Flower, 1990).
2.1.1 – Elementos alfa e beta-estabilizadores de fase do titânio
Os elementos classificados como α-estabilizadores envolvem metais dos grupos IIIA e IVA (Al, Ga e Sn) e elementos intersticiais C, N e O. Por outro lado, os metais de transição V, Ta, Nb, Mo, Mg, Cu, Cr, Fe e os metais nobres são classificados como elementos β-estabilizadores. Dois tipos de elementos β-estabilizadores são possíveis como resultados dos seus respectivos diagramas de fase: os definidos como β-isomorfos e os β-eutetoides. Existem ainda os elementos definidos como neutros, que não mudam a temperatura de transformação alotrópica, como Zr. Os quatro tipos de estabilizadores de fase do titânio têm seus respectivos diagramas de fase esquematizados na figura 2.2 (Lütjering e Willians, 2007).
Figura 2.2 – Diagramas de fases do titânio de acordo com seus elementos de liga: (a)
α-estabilizador, (b) β-estabilizador do tipo eutetóide, (c) β-estabilizador do tipo isomorfo e (d) neutro (Adaptado de Lütjering e Willians, 2007).
Embora o titânio puro seja largamente utilizado na indústria, em algumas situações são necessárias combinações de propriedades às quais o titânio puro não é aplicável. Para solucionar esse problema uma alternativa a ser seguida é o uso de ligas de titânio.
As ligas de titânio são obtidas a partir da adição controlada de elementos α e/ou β-estabilizadores ao titânio, com isso também é possível controlar a estabilidade de fases, bem como as respectivas frações volumétricas de cada fase à temperatura ambiente e consequentemente, suas propriedades mecânicas. Assim obtém-se ligas versáteis, principalmente quanto ao comportamento mecânico, uma vez que este depende fundamentalmente da
Al, O, N, C Fe, Mn, Cr Mo, V, Nb, Ta Zr (c) (a) (b) (d)
composição, da proporção entre as frações volumétricas das fases α e β e finalmente, dos tratamentos térmicos e termomecânicos utilizados. De acordo com as fases presentes à temperatura ambiente, as ligas de titânio podem ser classificadas em cinco grupos, ligas alfa, ligas quase alfa, ligas alfa+beta, ligas quase beta e ligas beta (Long e Rack, 1998).
2.1.1.1 – Ligas α
Ligas desse grupo exibem apenas fase α em temperatura ambiente. Além do titânio comercialmente puro, nessa classe encontram-se ainda ligas com elementos α estabilizadores, como os elementos mostrados na figura 2.2a. A presença de elementos estabilizadores da fase α, como soluto na matriz de titânio eleva as linhas de transformação α/α+β e α+β/β, fazendo com que, mesmo que uma liga α seja resfriada no campo α+β, a porção de fase verificada esteja sempre à esquerda da linha Mi/Mf à temperatura ambiente, sendo, então, termodinamicamente instável, transformando-se em α, conforme a figura 2.3 (Donachie, 1988).
As ligas tipo α apresentam elevada resistência à fluência e por esta razão, são adequadas ao uso em altas temperaturas. Como tais ligas não exibem transição do tipo dúctil-frágil são indicadas para operar em ambientes criogênicos. Além disso, essas ligas não exibem fases metaestáveis sujeitas à transformação no resfriamento (Donachie, 1988).
Figura 2.3 – Diagrama de fases para as ligas de titânio mostrando as transformações martensíticas em função da temperatura e da concentração de elementos estabilizadores de fase baseado nas linhas de transformação martensítica (adaptado de Flower, 1990).
2.1.1.2 – Ligas quase α
As ligas quase α contêm elementos estabilizadores da fase α, além de apresentar pequenos teores de elementos estabilizadores da fase β. A presença de elementos estabilizadores da fase β na liga α, mesmo em pequenas quantidades, faz com que o campo α+β aumente suficientemente para permitir que uma pequena quantidade de fase β, em equilíbrio metaestável, possa ficar retida em temperatura ambiente; permitindo assim, a transformação martensítica da fase β em α’ (martensita de estrutura HC) dentro de uma faixa muito limitada, obtida através das altas taxas de resfriamento, a partir do campo α+β (Donachie, 1988).
2.1.1.3 – Ligas α+β
Tais ligas são formadas pelo titânio e por elementos β estabilizadores em teor suficiente que permite a estabilização da fase β com fração volumétrica entre 10 e 50% à temperatura ambiente. Dessa maneira, o efeito dos elementos α e β estabilizadores resulta na formação de um campo de coexistência das fases α e β que se estende até a temperatura ambiente (Ahmed e Rack, 1998).
A combinação adequada de elementos de liga e de tratamentos térmicos permite obter uma grande variedade de microestruturas, principalmente quando as ligas α+β são comparadas às ligas α (Lütjering, 1998; Prasad e Seshacharyulu, 1998). Em geral, a manutenção da fase β na estrutura conduz à redução da resistência à fluência. Dessa forma, tais ligas não podem ser aplicadas em temperaturas elevadas. A liga Ti-6Al-4V é o melhor exemplo de ligas do tipo α+β (Qazi et al., 2003). Concebida inicialmente para ser empregada na indústria aeronáutica, tornou-se o material de referência dentre as ligas de titânio, sendo o material à base de titânio mais empregado na fabricação de dispositivos para implante, sejam ortopédicos ou dentários. Com o passar dos anos novas ligas α+β alternativas àquelas foram propostas, sendo as principais representantes as ligas contendo Nb na composição, por exemplo, Ti-6Al-7Nb (Long e Rack, 1998).
2.1.1.4 – Ligas quase β
São ligas com elementos estabilizadores da fase β em quantidade suficiente para que as linhas de transformação martensítica passem abaixo da temperatura ambiente e para que a linha β/α+β-transus fique bem abaixo da temperatura de transformação alotrópica do titânio puro. Estas ligas podem apresentar baixos teores de solutos estabilizadores da fase α, podendo assim serem trabalhadas dentro do campo β à 800°C. A cinética da nucleação e crescimento da fase estável α é bastante lenta, permitindo a manutenção da fase β metaestável à temperatura ambiente, mesmo sem necessidade de resfriamento rápido (Donachie, 1988).
2.1.1.5 – Ligas β
Ligas de titânio tipo β, são classificadas como metaestáveis ou estáveis, apresentam elevada resistência mecânica, boa conformabilidade e são endurecíveis através de tratamentos térmicos. Esta classe de ligas possibilita combinar baixo módulo de elasticidade que é resultante da estabilização da fase cúbica de corpo centrado, com elevada resistência mecânica. As ligas tipo β são produzidas pela adição de elementos β estabilizadores em volume suficiente que permite que a linha β-transus posicione-se bem abaixo da temperatura de transformação alotrópica do titânio puro (Froes e Bomberger, 1985). No caso de ligas tipo β metaestáveis tem-se ligas com composição dentro da faixa de β1 e β2 mostrada na figura 2.4 e que são obtidas através do resfriamento rápido das mesmas.
Figura 2.4 – Diagrama parcial de fases de sistemas constituídos pelo titânio e por elemento β-estabilizadores (adaptado de Lütjering e Willians, 2007).
No caso de formação de estruturas contendo a fase β metaestável, é possível a precipitação de outras fases como resultado de tratamentos térmicos de envelhecimento. Ligas com teor de elementos β estabilizadores superior a β2 são classificadas como estáveis e independem das condições de obtenção.
2.1.2 – Tratamentos Térmicos no Titânio
O titânio forma soluções sólidas intersticiais com elementos que possuem raio atômico pequeno, pois possui como espaço intersticial aproximadamente 26,5% do volume do reticulado cristalino para o α-Ti (HC) e de 32% para o β-Ti (CCC). A estrutura α possui 4 posições intersticiais de raio 0,62 Å. Já a estrutura β possui 12 interstícios do tipo tetraédrico com raio 0,44 Å e 6 do tipo octaédrico (Bellinati, 1999).
A presença de elementos intersticiais tende a aumentar a dureza, a resistência mecânica e diminuir a ductilidade do material. A maioria dos produtos de titânio comercialmente puro contém traços alguns desses elementos (Albrektsson, 1983).
Elementos estabilizadores de fase podem ser incorporados à estrutura dos materiais formando soluções sólidas através de tratamentos térmicos. É na manutenção de uma ou outra fase em equilíbrio termodinâmico que se baseia a adição de elementos de liga e os tratamentos térmicos ou termomecânicos.
Durante o resfriamento a partir de temperaturas superiores a temperatura β-transus (882°C) ocorre uma transformação alotrópica da estrutura CCC para a estrutura HC no titânio comercialmente puro. A adição de elementos de liga nesta temperatura modifica o equilíbrio entre os campos α e β (Collings, 1984).
Os resfriamentos submetidos a altas taxas promovem a precipitação mais fina da fase α’, resultando na estrutura Widmanstätten e, chegando estas taxas de resfriamento a patamares mais elevados, a difusão atômica será inibida gerando uma estrutura martensítica (Flower, 1990). A estrutura Widmanstätten (α + β) é característica das ligas diluídas e se apresenta como um emaranhado de agulhas paralelas em matriz de β (Brooks, 1982). A figura 2.5 mostra o diagrama esquemático da formação da estrutura de Widmanstätten na liga Ti-6Al-4V.
Figura 2.5 – Diagrama esquemático da formação da estrutura de Widmanstäntten na liga Ti-6Al-4V (Brooks, 1982).
2.1.2.1 – Têmpera e Revenimento
A têmpera é o tratamento térmico que possui como objetivo aperfeiçoar a relação entre microestrutura e as propriedades mecânicas. Basicamente, a têmpera consiste em resfriar rapidamente o material, a partir da temperatura elevadas a uma velocidade superior à velocidade crítica (Vc) para obter uma estrutura denominada martensita. Essa velocidade (Vc) significa a menor taxa de resfriamento que pode ser utilizada para que toda a estrutura obtida seja martensítica (Moreira, 2008). A temperabilidade mede a habilidade de um material sofrer um tratamento térmico que aumente a proporção de fase dura (martensita). Normalmente, esse processo é complementado por outro tratamento térmico, denominado revenimento.
Segundo Moreira e Lebrão (2008) são vários os meios utilizados para o tratamento de têmpera de aços, dois destes meios frequentemente são aplicados ao titânio, são eles: i) água –por meio de imersão, jatos, imersão ou jatos com água aquecida, ou ainda, misturas de água com aditivos poliméricos entre outros; ii) ar – este é um meio de tempera antigo, comum e barato. A aplicação do ar como meio de têmpera é mais comum em metais não-ferrosos.
O revenimento tem como principal objetivo controlar a relação dureza e tenacidade obtida após o processo de têmpera, reduzindo as tensões produzidas durante esse processo e aumentando a ductilidade e a tenacidade. O revenimento é realizado em temperaturas inferiores à de transformação alotrópica com tempos de duração e velocidades de resfriamento controladas.
2.1.3 – Transformação Martensita do Titânio
Uma transformação martensítica, por definição, é uma transformação que não envolve difusão de elementos de liga. A martensita é formada por resfriamentos suficientemente rápidos (têmpera) para impedir a difusão e a transformação em outras fases. Existem, basicamente, dois tipos de martensita em ligas de titânio: martensita hexagonal (HC) e martensita ortorrômbica (Lütjering e Willians, 2007).
Nas ligas de titânio contendo baixo teor de elementos β-estabilizadores, a fase beta a altas temperaturas pode ser transformada em α’ (martensita de estrutura HC) durante a têmpera acima da temperatura β-transus. Enquanto a martensita ortorrômbica α’' pode ser formada durante a têmpera em ligas com altas concentrações de elementos beta-estabilizadores. Esses diferentes tipos de estruturas cristalinas da martensita do titânio estão relacionadas ao deslocamento dos átomos por cisalhamento. Sendo que maiores taxas destes deslocamentos favorecem à formação da martensita α’ (HC), enquanto que a martensita α’’ (ortorrômbica) ocorrem quando estes deslocamentos são lentos (Kim et al., 2007). A transformação martensítica em ligas de titânio tem influência positivas sobre as propriedades de tensão e tenacidade à fratura das ligas (Ouchi et al., 1999; Grosdidier e Philippe, 2000; Bhattacharjee et al., 2005)
tendo sido objeto de diversos estudos ( Margevicius e Cotton, 1998; Zhang et
al., 2005; Lin et al., 2011).
A transformação martensítica inicia com deslocamento do tipo cisalhamento de átomos da fase β. A maior estabilidade da fase β se deve à formação de ligações covalentes que são dificilmente quebradas e com isso dificultam o cisalhamento dos átomos. A estabilidade desta fase afeta significativamente a transformação martensita no titânio, assim como, a formação e a quebra das ligações covalentes da estrutura unitária (Lin et al., 2011).
Já que as ligações covalentes da α’’ são dificilmente formadas, o cisalhamentos dos átomos pode ser limitado. Esta limitação pode favorecer à formação desse tipo de martensita. Além disso, uma vez que as ligações covalentes da martensita α’’ são formadas por têmpera ou por aplicações de tensões, a dissolução destas ligações também é bastante difícil. Caso contrário, onde ligações covalentes sejam facilmente formadas e/ou quebradas, o cisalhamento dos átomos pode ser acelerado, resultando no aumento da probabilidade de ocorrer a martensita α’ de estrutura HC (Lin et al., 2011).
2.1.4 – Microestruturas do Titânio
O titânio pode exibir uma grande variedade de estruturas dependendo da composição química da liga, do processamento e do tratamento térmico aplicado. Isto é possível porque o titânio e suas ligas exibem uma ampla faixa de transformação de fases. Muitas dessas transformações se devem à transformação alotrópica que ocorre de α para β outras, no entanto, se devem à formação de fases de transição metaestáveis que se precipitam durante a decomposição da fase β metaestável (Joshi, 2006).
O ponto chave da evolução microestrutural do titânio e de suas ligas é a temperatura de transformação alotrópica. Ligas de titânio quando tratadas em temperaturas acima da temperatura beta-transus apresentam-se como monofásica β. Através do resfriamento a partir desta temperatura é possível obter várias fases de equilíbrio e de não equilíbrio, dependendo da taxa de resfriamento e da concentração de elemento de liga. Na figura 2.6 é
apresentado o diagrama TTT (tempo, temperatura e transformação) para uma liga de titânio α+β (Joshi, 2006).
Figura 2.6 – Diagrama TTT pra uma liga de titânio α+β (Adaptado de Joshi, 2006).
A estrutura Widmanstätten pode mudar da forma de colônia de ripas alinhadas para a forma basket-weave com o aumento da taxa de resfriamento ou concentração de elementos de liga. Além disso, a estrutura lamelar se torna mais fina quando a taxa de resfriamento é aumentada. Em resfriamentos mais lentos a fase α esta presente nos contornos de grão β primário (Joshi, 2006).
Além dos produtos da transformação (α, α’, α’’), a microestrutura pode reter pequenas quantidades de fase β, dependendo da composição da liga. A quantidade de fase beta retida na microestrutura a partir do resfriamento no campo β é maior para maiores concentrações de soluto na liga. A martensita α’ ou α’’ se decompõe sobre envelhecimentos subsequentes levando a um aumento na resistência da liga (Joshi, 2006). A seguir nas figuras 2.7, 2.8, 2.9 e 2.10 são apresentadas diferentes microestruturas obtidas através do processamento térmicos de ligas de titânio.
Figura 2.7 – Microestrutura por microscopia ótica do titânio comercialmente puro grau 2 sem tratamento (Pazos et al., 2010).
Figura 2.8 – Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura da liga Ti17
(Ti-5Al-4Cr-4Mo-2Sn-2Zr) tratada isotermicamente a 750°C por (a) 360s e (b) 9400s. αGB – contorno de
grão e αWGB – contorno de grão Widmanstätten. A morfologia αWGB é composta por colônias de
placas α paralelas frequentemente com a mesma orientação, que crescem a partir de αGB
Figura 2.9 – Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura da liga Ti-6Al-2Sn-4Zr-6Mo. São mostrados grãos β delimitados por contornos de grãos α (Bhattacharyya et al., 2003).
Figura 2.10 – Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura da liga Ti-6Al-4V.
Observa-se grãos α e β (Lütjering e Willians, 2007).
As microestruturas mostradas nas figuras 2.7 a 2.10 são resultados de tratamentos térmicos realizados em diferentes ligas de titânio. Nos quais é possível observar grãos do tipo equiaxiais e grãos lamelares tanto de fase beta quanto de fase alfa. Esta variação do tipo de fase para uma mesma estrutura granular se deve à composição química da liga. Entretanto, não somente as ligas podem ter sua microestrutura alterada. O titânio comercialmente puro também pode apresentar microestruturas que variam tanto no tamanho quanto no formato dos grãos.
α
Borgioli e colaboradores (2001) trataram termicamente Ti-cp grau 2 em forno utilizando o ar como atmosfera de tratamento (Borgioli et al., 2001). Verificaram que para as amostras temperadas a partir da temperatura de 900°C forma-se duas camadas na superfície das amostras: uma fina camada de óxido e uma camada um pouco mais espessa com pequenas quantidades de oxinitreto de titânio. Estas camadas são mais espessas quanto maior for à temperatura e/ou o tempo de tratamento. A parte central do material consiste de uma estrutura acícular α, conforme é mostrado na figura 2.11.
Figura 2.11 – Micrografia do Ti-cp temperado em ar a partir de 900°C por 2h (Adaptado de
Borgioli et al., 2001).
A seguir, na figura 2.12 são apresentados difratogramas padrões para titânio comercialmente puro (Villars, 1997). Em (a) é apresentado o difratograma para o titânio α, hexagonal; e em (b) o difratograma fase β, cúbica.
Oxinitreto
Óxido
Figura 2.12 – Difratograma padrões para o titânio comercialmente puro: (a) fase α, (b) fase β (Pinto, 2005).
2.2 – Interação do Titânio com o Meio Biológico – O Titânio como Biomaterial
O titânio e suas ligas são os biomateriais metálicos mais indicados para aplicações biomédicas devido às combinações de propriedades, como: biocompatibilidade, alta resistência à biocorrosão, relação tensão/deformação e relação resistência/peso entre outros. Muitos trabalhos na literatura relatam o comportamento do titânio quando aplicado em meio biológico (Macêdo, 2008; Sá, 2009; Alves Jr, 2005).
O termo biomaterial foi definido na Conferência do Instituto Nacional de Desenvolvimento de Consenso em Saúde em 1982 como: “Qualquer
(a)
(b)
Fase α
substância (outra que não fármaco) ou combinação de substâncias, sintética ou natural em origem, que possa ser usada por um período de tempo, completa ou parcialmente como parte de um sistema que trate, aumente ou substitua qualquer tecido, órgão ou função do corpo” (Vaz, 2007). Os biomateriais devem ser isentos de produzir qualquer resposta biológica adversa local ou sistêmica, ou seja: o material deve ser não-tóxico, não-carcinogênico, não-antigênico e não-mutagênico. Sendo classificados como: bioinertes, bioativos e bioreativos. Os bioinertes são menos susceptíveis a causar uma reação biológica adversa devido a sua estabilidade química em comparação com outros materiais. Os materiais bioativos têm como propriedade formar tecido sobre a sua superfície e estabelecer uma interface capaz de suportar cargas funcionais. Os materiais bioreativos ficam no limite entre os materiais bioinertes e os bioativos (Trota Filho, 2007).
Quando o biomaterial entra em contato com o meio biológico ocorre uma série de reações físicas, químicas e biológicas que dependem principalmente das propriedades da superfície do biomaterial. Estas propriedades determinam a biocompatibilidade de um material, a figura 2.13 relaciona algumas destas propriedades (Spencer e Textor, 2007).
Figura 2.13 – Propriedades dos materiais que estão relacionadas à biocompatibilidade
(Spencer e Textor, 2007).
Os pesquisadores estudam o comportamento dos biomateriais com diferentes focos. Alguns destes grupos estudam células isoladas sobre a
superfície do material através de técnicas que quantificam a força de adesão celular (Anselme, 2000a; Bao e Suresh, 2003). Outros grupos, no entanto, focam seus trabalhos na interação do material com populações de células após alguns minutos ou horas de contato material/células (Thoumine et al., 1996; García et al., 1997; Rezania et al., 1997; Yamamoto et al., 1998; Myrdycz et al., 2002; Anselme e Bigerelle, 2005). Outros ainda consideram todas as fases da diferenciação, proliferação e adesão em curto prazo e longo prazo (Hunter et
al., 1995; Anselme et al., 2000b; Nishio et al., 2000; Mustafa et al., 2001; Suh et al., 2003; Lee et al., 2004).
Estudos in vivo e in vitro realizados com implantes têm demonstrado que as propriedades físicas e químicas dos biomateriais são capazes de regular a resposta tecidual inicial. Portanto, a interação biomaterial-célula depende das propriedades superficiais incluindo microestrutura, topografia, rugosidade e molhabilidade (Walboomers e Al, 1999; Ponsonnet et al., 2003; Winkelmann et
al., 2003).
Sabe-se que quando um biomaterial entra em contato com o meio biológico, as primeiras moléculas a alcançarem a sua superfície (escala de tempo de nanosegundos) são as de água. Em seguida, uma série de diferentes substâncias encontradas nos fluidos teciduais tais como: íons e proteínas, assim como células do tipo condroblastos, fibroblastos e osteoblastos reagem com a superfície conforme mostrado na figura 2.14 (Ellingsen, 1998).
Figura 2.14 – Representação da superfície do implante e sua interação com as moléculas do
fluido tecidual. (A) Implante. (B) Moléculas de água. (C) Camada glicoprotéica. (D) Célula (Adaptado de Kasemo, 2002).
Tem-se, portanto inicialmente, a formação de uma camada de proteínas sobre a superfície do biomaterial, nos primeiros instantes após o contato com o meio biológico. Essa camada é fruto das reações iniciais entre os constituintes teciduais e a superfície do implante e governará as futuras reações, determinando o tipo de resposta celular (Ellingsen, 1998).
Quando as células chegam à superfície, elas “encontram” uma superfície coberta de proteínas cuja camada tem propriedades que foram inicialmente determinadas pelas camadas de água pré-formada. Assim, quando se fala de interações superfície-célula, é em ultima análise a interação entre as células e as proteínas ligadas à superfície (Kasemo, 2002).
As propriedades da superfície do biomaterial irão proporcionar uma maior ou menor interação com a água e, por consequência, influenciarão as proteínas e outras moléculas que chegarão logo em seguida. A figura 2.15 esquematiza a interação de biomoléculas com a superfície de diferentes materiais, e suas influencias para a adsorção de proteínas e adesão celular (Kasemo, 2002).
Figura 2.15 – (1) Interação da superfície do material com a água. (2) Comportamento das proteínas de acordo com o conjunto superfície-água. (3) Células em crescimento na superfície ativa e em desnaturação na superfície inativa (adaptado de Kasemo, 2002).
As características da superfície determinarão quais moléculas irão adsorver, ao passo que a natureza e orientação dessas biomoléculas terão consequências diretas no recrutamento, ancoragem, proliferação e diferenciação das células (Vaz, 2007).
As ligações células-superfície são da ordem de 10 a 15 nm e recebem o nome de sítios de adesão ou contatos focais. Os contatos focais formam-se essencialmente em células com baixa mobilidade, devido ao fato destas células apresentarem receptores de superfície que reconhecem proteínas da matriz se associar a elas e, por conseguinte fixam as células. A arquitetura do
citoesqueleto celular é essencial na manutenção da forma e na adesão das células (Anselme et al., 2000c).
A interação osteoblasto-biomaterial depende de aspectos fundamentais do material, tais como topografia, química e energia de superfície. Estas características do material determinam como as moléculas serão adsorvidas e, mais particularmente, determinam a orientação das moléculas adsorvidas, bem como o comportamento da célula durante o contato (Boyan et al., 1996).
Células quando em contato com uma superfície primeiramente se ligam para em seguida aderir e espraiar. A primeira etapa, ou seja, a ligação depende de proteínas de adesão, tais como: selectinas, imunoglobulinas, caderinas e integrinas. A qualidade da adesão influenciará a morfologia e a capacidade da célula proliferar e diferenciar (Anselme et al., 2000b).
As integrinas são receptores transmembranicos e agem como uma interface entre o compartimento intra e extracelular. Deste modo auxiliam a troca de informações entre o meio externo e interno atuando na indução da adesão, propagação e migração celular e, por consequência, participam do crescimento e diferenciação celular (figura 2.16).
Figura 2.16 – Representação das proteínas celulares envolvidas na adesão do biomaterial
Osteoblastos humanos cultivados expressaram altos índices de integrinas α1β1, α3β1, α5β1 e α7β5 e níveis muito menores de integrinas α2β1, α4β1, α7β1 e α7β3 (Hughes et al., 1993). Ao que tudo indica a integrina β1 é um receptor predominante envolvido na adesão de osteoblastos (Gronthos et
al., 1997).
Comparando diferentes tipos de células em materiais semelhantes verificou-se que a resposta celular é diretamente relacionada à rugosidade superficial (Chesmel et al., 1995; Healy et al., 1996; Thomas et al., 1997). Observações por microscopia eletrônica de células ósseas em materiais com várias rugosidades tem demonstrado que as células se espraiam e formam uma camada celular contínua de melhor forma em superfícies rugosas que em superfícies lisas (Kieswetter et al., 1996; Anselme et al., 2000c).
O fenômeno de orientação de células osteoblasticas tem sido descrito. Em superfícies lisas as células orientam-se aleatoriamente enquanto que em superfícies rugosas, com rugosidade Ra acima de 0,5 µm as células orientam-se paralelamente à direção da rugosidade (Chesmel et al., 1995). Eiorientam-senbarth et al (2002) e Huang et al (2004) mostraram que células osteoblásticas seguem a orientação da rugosidade, conforme pode ser observado na figura 2.17 (Eisenbarth et al., 2002a; Huang et al., 2004).
Figura 2.17 – Morfologia celular em discos de titânio após 2 dias de cultura. (a) superfície
rugosa e (b) superfície polida (Eisenbarth et al., 2002a).
Estas células alinhadas, mostrando orientação com as ranhuras, tem melhor comportamento de adesão quando comparadas às células menos orientadas e às células de forma arredondada (Eisenbarth et al., 2002a).
As células orientadas tiveram alta densidade de contatos focais onde tinham contato com a borda das ranhuras da rugosidade, tendo mostrado melhor organização do citoesqueleto. Estas mudanças, na orientação das células podem levar a uma maior aderência em superfícies rugosas que em superfícies polidas (Eisenbarth et al., 2002b).
A distribuição dos contatos focais indica o modo de adesão de osteoblastos em diferentes rugosidades. Em superfícies lisas, os contatos focais ficam uniformemente distribuídos em toda a superfície da membrana os quais estão em contato com o substrato. Nas superfícies rugosas os contatos focais restringem-se às extremidades das extensões das células, onde a membrana celular está em contato com o substrato (Anselme, 2000a).
Para a adesão celular um outro parâmetro de grande importância são as características de hidrofilicidade e hidrofobicidade (Kieswetter et al., 1996; Rupp et al., 2006), uma vez que a energia de superfície pode influenciar a adsorção de proteínas e a reorganização estrutural das proteínas no material (Boyan et al., 1996). Segundo Altankov (1994) a adesão celular é melhor em superfícies hidrofílicas (Altankov e Groth, 1994).
Ponsonnet et al (2003) mostraram que a componente polar da energia de superfície, ou um baixo valor da fração de polaridade, foram os melhores parâmetros para a proliferação de fibroblastos (Ponsonnet et al., 2003). Mostraram ainda, que embora a energia de superfície tenha sido o fator dominante, a rugosidade pode afetar de forma considerável a relação energia de superfície e proliferação.
Assim pode-se constatar que os processos biológicos são fortemente influenciados pelas propriedades do material. A fim de melhorar estas interações muitas ligas de Ti foram desenvolvidas ao longo do tempo. Portanto este trabalho foi realizado com a finalidade de melhorar a interação do Ti-cp com células. A utilização deste tipo de Ti se deu com o intuito de diminuir os riscos futuros provenientes de elementos ligantes.
Capítulo 3
Metodologia
3 – Metodologia
O presente trabalho foi dividido em duas partes. A primeira parte consiste na preparação e caracterização de amostras de titânio com diferentes tratamentos térmicos. A segunda parte consiste na realização de ensaios biológicos para determinar a adesão e a proliferação de células pré-osteoblásticas sobre as superfícies previamente preparadas. A seguir na figura 3.1 é apresentado o organograma da realização do trabalho.
Figura 3.1 – Organograma da realização do trabalho
Tratamentos Térmicos Parte 1: Metalografia Parte 1: Caracterizações do Titânio Parte 2: Cultura de Células Parte 2: Caracterizações Biológica • MO • MEV (EBS, EDS, EBSD) • DRX / GIDRX • Ângulo de Contato • Energia de Superfície • Microdureza (HV) • Rugosidade • Análise de Imagens • MTT • Adesão • Expressão da integrina β1 • Lixamento • Polimento • Ataque químico
3.1 – Material de partida
Neste trabalho foram utilizados discos de titânio comercialmente puro (Ti-cp grau 2), com 15mm x 1,5mm (diâmetro x espessura) e composição química de acordo com a tabela 3.1 fornecidos pela empresa Realum Ind. Com. de Metais Puros e Ligas LTDA.
Tabela 3.1 – Composição química do titânio utilizado segundo o fornecedor. Discos de Ti ASTM F67 GR1Φ 15x1,50mm.
Elementos N C H Fe O Ti
% 0,011 0,011 0,004 0,04 0,085 Balanço
3.2 – Tratamentos térmicos dos discos de titânio
Os tratamentos térmicos foram realizados em forno resistivo (figura 3.2) utilizando o ar ambiente como atmosfera estática de trabalho. Colocou-se 15 amostras por vez para a realização da têmpera em 1100°C, 1000°C e 950°C respectivamente, mantendo-se essa temperatura por 1h (uma hora) e em seguida resfriando-se em água (volume de 6L) à temperatura ambiente, aproximadamente 25°C. Estas temperaturas foram utilizadas por estarem acima da temperatura beta transus e por possibilitarem a obtenção de diferentes microestruturas (Macêdo, 2008).
Das 15 amostras temperadas de cada condição anteriormente descrita, 5 permaneceram no estado temperado, 5 foram envelhecidas a 500°C e 5 foram envelhecidas a 700°C, todas por 4h. No caso do envelhecimento, o forno permaneceu fechado até atingir a temperatura ambiente de aproximadamente 25°C, conforme o esquema apresentado na figura 3.3 e descrição dada na tabela 3.2.
Figura 3.2 – Fotografia do forno utilizado para realização dos tratamentos térmicos – Laboratório de Tratamentos Térmicos do IFRN – Natal/RN
Tabela 3.2 – Simbologia e descrição dos tratamentos térmicos realizados. Simbologia Tratamento 11 Têmpera 1100°C (1h) 11R5 Têmpera 1100°C (1h) + Envelhecimento 500°C (4h) 11R7 Têmpera 1100°C (1h) + Envelhecimento 700°C (4h) 10 Têmpera 1000°C (1h) 10R5 Têmpera 1000°C (1h) + Envelhecimento 500°C (4h) 10R7 Têmpera 1000°C (1h) + Envelhecimento 700°C (4h) 95 Têmpera 950°C (1h) 95R5 Têmpera 950°C (1h) + Envelhecimento 500°C (4h) 95R7 Têmpera 950°C (1h) + Envelhecimento 700°C (4h)
ST Sem Tratamento (comercial)
3.3 – Preparação metalográfica
Uma amostra tratada de cada condição foi cortada transversalmente utilizando disco diamantado. Em seguida essa amostra, assim como todos os demais, foram embutidas em resina de poliéster e preparadas metalograficamente, passando pelas etapas de lixamento (lixas de granulometria variando de 80 # a 2000 #) até remover toda a camada formada durante a têmpera e polimento utilizando uma solução de 40% de sílica coloidal (1 micra) com 60% de peróxido de hidrogênio (30%).
Terminada a etapa de polimento os discos foram atacados quimicamente para revelação microestrutural, utilizando a solução Kroll (95mL de H2O + 10mL de HF + 5mL de HNO3). Em seguida os discos foram limpos
em banho ultrassônico utilizando detergente enzimático, álcool e água destilada, nesta ordem, sendo 10min de lavagem para cada líquido. Devidamente limpas as amostras foram secas e acondicionadas em embalagens apropriadas para uso posterior.
3.4 – Caracterizações das amostras
3.4.1 – Microscopia Ótica e Análise de Imagens da superfície
A técnica de microscopia ótica foi utilizada para análise da superfície e do perfil dos discos, bem como para a observação e análise das células aderidas à superfície dos discos. Para tanto foi utilizado um microscópio ótico de luz refletida da marca Olympus modelo BX 60M com uma câmera digital acoplada e conectada a um computador.
Para aquisição das fotomicrografias utilizou-se o software Image Pro
Plus versão 6.0. As fotomicrografias da superfície das amostras foram obtidas
em seis regiões do disco distribuídas conforme ilustra a figura 3.4. A delimitação dessas regiões foi feita utilizando microdureza Vickers (HV), de forma que a cada conjunto de 3 marcações de microdureza representa uma região a ser analisada (quadrantes e centro).
Figura 3.4 – Ilustração dos locais marcados para as análises das células sobre os discos.
3.4.2 – Microscopia eletrônica de Varredura (BSE, EDS e EBSD)
Foram utilizados dois microscópios eletrônicos de varredura – MEV, ambos de marca PHILLIPS e modelo XL30. O primeiro equipado com detetores de elétrons secundários (SE) e de elétrons retro-espalhados (BSE),
