O inóculo das leveduras foi padronizado por meio da escala de Mac Farland nº 1 em densidade óptica, o que corresponde a 3x108 UFC/mL (YARROW, 1998). As leveduras foram crescidas em Ágar Sabouraud a 28ºC por 48 horas. Cinco colônias foram suspensas em solução salina estéril 0,145 mol/L (salina a 0,85%). A suspensão resultante foi homogeneizada em agitador de vórtex durante 15 segundos e a densidade celular ajustada com espectrofotômetro, acrescentando-se solução salina suficiente para
35 obter a absorbância equivalente à de uma solução-padrão da escala de Mc Farland nº 1, em comprimento de onda de 530 nm (NCCLS, 2002).
O inóculo das bactérias foi padronizado por meio da escala de Mc Farland nº 0,5 em densidade ótica, o que corresponde a 1 a 2x108 UFC/mL. As bactérias foram crescidas em ágar BHI (infusão de cérebro e coração) a 35ºC por 24 horas. Três colônias foram transferidas para um tubo contendo 9 mL de caldo BHI, que foi incubado à 37ºC por 12 horas. Em 1 mL desta suspensão foi acrescentada caldo BHI suficiente para obter a absorbância equivalente a uma solução padrão da escala de Mc Farland 0,5 em comprimento de onda de 625 nm (NCCLS, 2003).
Para a padronização do inóculo do fungo filamentoso, culturas puras de C.
sphaerospermum foram previamente crescidas em meio ágar BDA (Batata dextrose e
ágar), a 28 ºC no escuro. Ao atingir a fase de maior esporulação (10-14 dias), cerca de 10-20 mL de polissorbato- 20 (Tween®) a 0,05% foi vertida sobre as culturas e, com o auxílio de uma alça de semeadura, o crescimento fúngico foi raspado e os esporos foram coletados em condições assépticas. Esta suspensão foi filtrada em gaze estéril para Erlenmeyers também estéreis, para eliminação de fragmentos de meio de cultura e de micélio fúngico. Para contagem do número de esporos, uma alíquota desta suspensão foi transferida para uma câmara de Neubauer com o auxílio de uma micropipeta. Utilizando-se um microscópio óptico, com aumento de 40X, foram contados os esporos presentes em 25 áreas de 1/16 mm. O número total de esporos/mL da suspensão foi então calculado utilizando-se a fórmula: Nº total de esporos/mL = [Total de esporos x (1 / 0,00025) x diluição x 103] / Nº total de retículos e a concentração foi ajustada para 5x107 esporos/mL.
36 5.8 Ensaio antimicrobiano
Para a realização do ensaio antimicrobiano, um “swab” foi imerso nas suspensões celulares de leveduras e bactérias previamente padronizadas. Os microrganismos alvos foram inoculados em placas de Petri contendo meio ágar Sabouraud para as leveduras e meio ágar BHI para as bactérias (ROSA et al., 2003).
Discos de papel estéreis (6,2 mm de diâmetro) foram colocados sobre a superfície seca das placas inoculadas com os microrganismos-alvo e 10 µL da solução em água: metanol (9:1) de cada extrato fúngico (10 mg/mL) foi aplicado sobre os discos (100 µg/disco).
Foram considerados ativos os extratos que apresentaram halo de inibição após um período de incubação de 24h/28ºC para as leveduras e 48h/37ºC para as bactérias, respectivamente.
Figura 1. Representação esquemática do teste antimicrobiano
37 Para a determinação da atividade antifúngica frente ao microrganismo alvo C.
sphaerosperum, 100 µg de cada extrato fúngico foram aplicados em papel de filtro e
secos à temperatura ambiente.
A suspensão contendo esporos de C. sphaerospermum na concentração final de 5x107 esporos/mL foi borrifada sobre o papel de filtro onde as amostras foram aplicadas e, em seguida, o mesmo foi incubado durante 72 horas a 28ºC em câmara úmida. Após este período, foi observada a presença/ausência do crescimento fúngico próximo às áreas de aplicação dos extratos. Como controles positivos foram aplicados 100 µg de cloranfenicol (Sigma/EUA) para as bactérias e 100 µg de anfotericina B (Sigma/EUA) para as leveduras e para o fungo filamentoso.
O extrato do meio de cultura sem crescimento fúngico, e 10 µL da solução água:metanol (9:1) foram utilizados como controles negativos. Todos os extratos brutos foram avaliados em triplicata para a atividade antimicrobiana, em dias diferentes.
Para verificar se houve diferenças nos tratamentos quanto a inibição de S. aureus e E. coli, (Tratamento 1: S. aureus sensíveis aos extratos fúngicos; Tratamento 2: E. coli sensíveis aos extratos fúngicos) foi aplicado o procedimento MIXED do SAS (SAS, 2001) que disponibiliza ao usuário em torno de 40 tipos de estruturas de (co)variâncias residuais e critérios para escolha da melhor estrutura para determinado conjunto de dados. Esses critérios, em geral, incluem o valor da função de máxima verossimilhança restrita, o número de dados analisados e de parâmetros a serem estimados.
A escolha da melhor estrutura de (co)variância residual e do modelo mais adequado é fundamental na análise de dados, caso contrário, os resultados podem ocasionar conclusões equivocadas. Segundo Littell e outros (1998), a escolha da estrutura de (co)variância para os resíduos é importante porque os erros-padrão das
38 médias são dependentes desta escolha e, caso se opte por uma estrutura inadequada, os erros-padrão podem ser viesados.
As estruturas AR (1): auto-regressiva de primeira ordem; ARMA(1,1): auto- regressiva de primeira ordem com média móvel; CS: simetria composta e VC: componentes de variância consideram homogeneidade de variâncias, enquanto as estruturas CSH: simetria composta heterogênea; HF: Huynh–Feldt; UN: não- estruturada; ANTE: Ante-Dependência; FA(1): fator analítico de primeira ordem; DPUN: Produto Direto não estruturado, consideram heterogeneidade de variâncias. Na estrutura CS, todas as covariâncias são iguais e, na VC, as covariâncias são nulas. As demais estruturas consideram diferentes covariâncias para cada par de medidas.
Para escolha do arranjo para efeitos fixos e da estrutura de (co)variância que melhor representam a variabilidade entre e dentro dos extratos fúngicos, respectivamente, foram utilizados os critérios “-2 Residual Log Likelihood”(-2RLL) e “Consistent Akaike’s Information Criterion”(CAIC), obtidos com as seguintes fórmulas (WOLFINGER, 1993; SAS, 2001):
-2RLL = (n - p) ln (2π) + ln|ZGZ' + R| +ln|X'(ZGZ' + R)-1 X|+(y - Xb)'(ZGZ' + R)-1 (y -
Xb)
CAIC = -2RLL + d(ln k + 1);
em que: n = número de observações (153); p = posto da matriz X; k = número de observações utilizadas (846); y = vetor de observações (846 x 1); X = matriz de incidência dos efeitos fixos (846 x número de tratamentos); b = vetor das soluções para os efeitos fixos (número de tratamentos x 1); Z = matriz de incidência dos efeitos aleatórios (846 x 153).
39 As pressuposições assumidas neste trabalho consistiam de que todas as matrizes apresentaram distribuição normal multivariada (NMV). Neste contexto, a média de y assumiu a média dos tratamentos com variância igual a matriz ZGZ', e a média do resíduo igual a zero com variância igual a própria matriz residual. Contudo, testou-se a normalidade dos dados através dos testes de Shapiro-Wilk (W) e de Kolmogorov- Smirnov (D), em que para ambos, o valor calculado de W e de D não foram estatisticamente significativos para P = 0,05 (W = 0,129; D = 0,097), aceitando-se a hipótese que a distribuição estudada é normal.
Os parâmetros das matrizes de (co)variâncias residuais foram estimados pelo método da Máxima Verossimilhança Restrita, observando-se que, no procedimento MIXED do SAS, o máximo é obtido pelo método de Newton-Raphson.
Como critério de convergência do algoritmo de busca do ponto de máximo da função de verossimilhança restrita, adotou-se o padrão do procedimento MIXED do SAS:
| |
Nesste contexto, quanto menor os valores de -2RLL e de CAIC, melhor ajuste do modelo (SAS, 2001).
O modelo estatístico adotado na análise de variância foi descrito como: y = µ + Ti + ei
Onde: y = valor da observação do halo de inibição; µ = média para o conjunto de dados; Ti = efeito do Tratamento (i); ei = erro aleatório.
≤ 1 * 10-8 em que fk= valor da função de interesse (verossimilhança restrita); gk = primeira derivada da função de interesse; e Hk = segunda derivada da função de interesse, ambos na iteração k (SAS, 2001).
40 5.9 Determinação de atividade antagonista
Para a realização dos ensaios de antagonismo, todos os fungos endofíticos isolados foram testados quanto à produção de substâncias difusíveis e voláteis contra os seguintes fitopatógenos: Monilinia fructicola (mfa3635) e Colletotrichum gloeosporioides (CG-incoper02).
Os isolados endofíticos foram previamente cultivados em ágar Sabouraud durante sete dias. No teste de verificação de substâncias difusíveis, um disco de ágar de 5 milímetros de diâmetro contendo micélio de cada fungo endofítico foi inoculado em um lado da placa de Petri contendo meio ágar Sabouraud e incubado por três dias a 25ºC. Em seguida, um disco similar de cada fitopatógeno foi inoculado no outro lado da placa. Após três dias de incubação a 25ºC, o raio do micélio fúngico foi medido e comparado com o controle (Figura 2).
O controle do ensaio descrito foi feito com a inoculação de cada fitopatógeno no meio de cultura sem o antagonista. Todos os testes positivos foram repetidos três vezes.
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Figura 2. Representação esquemática do teste antagonista por difusão em ágar. Onde 1= microrganismo antagonista e 2 = microrganismo alvo.