Fundação Universidade Federal do Tocantins
Campus de Porto Nacional
Pós-graduação Strito sensu “Ecologia de Ecótonos”
Verificação da produção de substâncias bioativas a partir de fungos endofíticos isolados da Soja Glycine max L. Merril contra patógenos humanos e de vegetais
Thompson de Oliveira Turíbio
PORTO NACIONAL-TO,
Agosto de 2011
ii
Thompson de Oliveira Turíbio
Verificação da produção de substâncias bioativas a partir de fungos endofíticos isolados da Soja Glycine max L. Merril contra patógenos humanos e de vegetais
Orientador: Prof. Dr. Raphael Sanzio Pimenta.
Porto Nacional – TO
Agosto de 2011
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia de Ecótonos da Universidade Federal do Tocantins como requisito parcial para obtenção do grau de
iii Ficha catalográfica elaborada por Michelle de Lima Mota CRB2 1350
T938v TURIBIO, Thompson de Oliveira
Verificação da produção de substâncias bioativas a partir de fungos endofíticos isolados da Soja Glycine max L. Merril contra patógenos humanos e de vegetais/Thompson de Oliveira Turibio. – Porto Nacional, 2011.
81 f.
Orientador: Raphael Sanzio Pimenta
Dissertação (Mestrado). — Universidade Federal do Tocantins, Programa de Pós-Graduação em Ecologia de Ecótonos.
1. Substâncias bioativas . 2. Fungos endofíticos . 3. Soja
Glycine max L. Merril . 4. Patógenos humanos e de vegetais . I. Pimenta, Raphael Sanzio. II. Universidade Federal do Tocantins,
Programa de Pós-Graduação em Ecologia de Ecótonos.III. Título.
22.ed. CDD- 577
iv DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, Walter e Zélia, que sempre incentivaram os meus estudos e não mediram esforços, para que eu conseguisse transpor as dificuldades.
v AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço ao Pai Celestial a oportunidade de poder levantar com saúde e com disposição nesses anos transcorridos no mestrado. Ao Senhor toda Glória!
Ao meu Orientador Prof Dr Raphael Sanzio Pimenta que me recebeu prontamente em seu laboratório e que foi um incentivador desta pesquisa. Obrigado também Mestre pela confiança em mim depositada!!!
Ao grupo do Prof Luiz e Carlos Rosa na UFMG que foi bastante receptivo no meu estágio em BH;
Aos meus pais Walter (Gordo) e Zélia (Brancona) pelas ligações semanais incentivando os meus estudos;
A minha Esposa Bruna pelos momentos maravilhosos vividos até agora. Pelas caminhadas no fim do dia motivados por sonhos que irão se realizar;
As minhas enteadas Barbara e Beatriz (BIA) pelos momentos de descontração e alegria que hoje me cercam;
Aos meus Irmão Walter Cláudio e Georgeane pela compreensão do meu isolamento em virtude do cotidiano;
vi À pequena Geovana que me faz sorrir mesmo de longe e sem poder participar de seu desenvolvimento;
À família do “Tio” Benedito, Tia Lusia, Ederson e Gisele, pelos bons fins de semana que encontrei na cidade de Porto Nacional. Obrigado pelo carinho;
À minha cunhada Cynthia e sua família, Adriano (KIKO).... Vai Corinthians... As meninas de ouro, Sabrina e Amanda;
Ao cunhado Vieira belo bom relacionamento... Ao pequeno Augusto Tito, “o Bem 10 da turma”;
Aos eternos “Calangos do Cerrado” Wíris, Elton, Fabrício, Ronaldo (digo, Raul) e Rony. Este último agradeço infinitamente por ter participado diretamente e indiretamente na confecção dessa dissertação;
Ao novo amigo, Winicius, que fiz no mestrado e companheiro de almoço, lanche, lanche. Obrigado pelos conselhos e pela atenção;
Aos colegas do LAMBIO, Francisca (rainha das PCR), Cris, Laciene e Rubens, que sempre me ajudaram;
vii Ao Prof Waldesse e a Profa Jaqueline por terem me recebido tão bem no LABIOTEC. Sem falar no seu esquadrão Classe A: Júlio, Guta e Natália;
À Coordenadora Cida, do curso de enfermagem, do ITPAC, que sempre atendeu com solicitude minhas justificativas de faltas na academia;
Ao curso de Ciências Biológicas da UFT que me proporcionou momentos incríveis ao longo destes 10 anos;
Aos funcionários do ITPAC , Naira, Ana Raquel, Samuel, Patricia, Marcelo, André e Arthur pela boa convivência no ambiente de trabalho.
viii SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS VII
LISTA DE FIGURAS VIII
LISTA DE ABREVIATURAS IX RESUMO XI ABSTRACT XI 1 INTRODUÇÃO 14 2 JUSTIFICATIVA 16 3 REVISÃO DE LITERATURA 19 3.1 MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS 19 3.2 APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS 20
3.3 DESCRIÇÃO BOTÂNICA E IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DA Glycine
max l. Merril 27 4 OBJETIVOS 28 4.1 OBJETIVO GERAL 28 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 28 5 MATERIAL E MÉTODOS 29 5.1 PLANTA HOSPEDEIRA 29
5.2 COLETA E CULTIVO DOS FUNGOS 29
5.3 FREQUÊNCIA DE COLONIZAÇÃO 30
5.4 PREPARO DOS EXTRATOS VEGETAIS 30
5.5 PREPARO DOS EXTRATOS FÚNGICOS 30
5.6 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE MICROBIANA 31
5.7 PRADRONIZAÇÃO DOS INÓCULOS 31
5.8 ENSAIO ANTIMICROBIANO 32
5.9 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTAGONISTA 37
6 VERIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO DE COMPOSTOS VOLÁTEIS 38
6.1 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS FILAMENTOSOS 39
6.2 EXTRAÇÃO DE DNA TOTAL 39
6.3 OBTENÇÃO DOS AMPLICONS 40
6.4 PURIFICAÇÃO DOS AMPLICONS 41
6.5 REAÇÕES DE SEQUENCIAMENTO 42
6.6 PRECIPITAÇÃO DA REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO 42
6.7 ANÁLISE COMPUTACIONAL DAS SEQUÊNCIAS 43
7 RESULTADOS E DISCUSSÕES 44
7.1 COLETA E ISOLAMENTO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASOCIADOS
A Glycine max L.Merril 44
7.2 CULTIVO DOS FUNGOS PARA OBTENÇÃO DOS EXTRATOS
METANÓLICOS 45
7.3 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA 46
7.4 ANTAGONISMO POR DIFUSÃO 53
ix 7.6 COMPARAÇÃO DOS TESTES DE DIFUSÃO DE SUBSTÂNCIAS,
COMPOSTOS VOLÁTEIS E EXTRATO METANÓICO 61
7.7 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS ENDOFÍTICOS 62
8 CONCLUSÃO 66
x LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação taxonômica de Glycine max... 10
Tabela 2: Relação de fungos filamentoso isolados de cada indivíduo de Glycine max L. ... 44 Tabela 3. Avaliação da atividade anti-microbiana de extratos fúngicos obtidos a partir de fungos endofíticos associados à Glycine max. ...46 Tabela 4: Critérios de ajuste para os tratamentos utilizando-se as estruturas com homogeneidade e com heterogeneidade de variâncias e graus de liberdade do modelo e do resíduo associados aos tratamentos. ... 51 Tabela 5: Análise de Variância utilizando o Produto Direto não estruturado - DPUN - como a estrutura de covariância. ... 53 Tabela 6: Testes de Comparação de Médias para os tratamentos estudados. ... 53 Tabela 7. Comparação de inibição de crescimento pelos métodos de difusão e por produção de compostos voláteis. ... 57 Tabela 8. Comparação dos resultados dos três ensaios: Extratos fúngicos, Antagonismo e Compostos Voláteis. ... 61
xi LISTA DE FIGURA
Figura1. Representação esquemática do teste antimicrobiano. 33 Figura 2. Representação esquemática do teste antagonista por difusão em ágar. 37 Figura.3. Representação esquemática do experimento de detecção de substâncias
voláteis. 38
Figura 4. Porcentagem de extratos fúngicos com atividade antimicrobiana a S.
aureus 50
Figura 5. Porcentagem de extratos fúngicos com atividade antimicrobiana a E. coli. 51 Figura 6. Números de indivíduos isolados produtores de substâncias bioativas que inibiram o crescimento dos microrganismos-alvos.
54
Figura 7 : Frequência de isolados ativos em relação as morfo-espécies. 56 Figura 8. Números de fungos isolados produtores de compostos voláteis ativos
contra os patógenos alvos. 56
xii LISTA DE ABREVIATURAS
ATCC: American Type Culture Collection BLAST: Basic Local Alignment Search Tool cm: centímetro
CONAB: Confederação Nacional de Abastecimento CTAB: Brometo de cetil trimetilamônio
COV: Compostos orgânicos voláteis DNA: Ácido desoxirribonucléico
dNTP: Desoxirribonucleotídeos fosfatados EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético EUA: Estados Unidos da América
g: grama H2O: água
HCl: Ácido clorídrico
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística ITS: Região transcrita interna
Km²: quilômetro quadrado
KH2PO4: Dihidrogenofosfato de potássio KNO3: nitrato de potássio
LBEM: Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular m: metro
M: molar
MgCl2: cloreto de magnésio MgSO4: Sulfato de magnésio mg: miligrama
mL: mililitro mm: milímetro mM: milimolar mol/L: mol por litro
µg: micrograma
µl: microlitro
µmol: micromol
xiii NaCl: Cloreto de sódio
NCBI: National Center for Biotechnology Information
NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards ng: nanograma
nº: número P.A.: para análise
pH: potencial hidrogeniônico p.p.m: partes por milhão pmol: picomol
p/v: peso por volume rDNA: DNA ribossomal r.p.m.: rotações por minuto SDS: dodecil sulfato de sódio TBE: tris borato
U: unidade
UFC: unidade formadora de colônia
UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais V: volts X: vezes %: por cento ºC: graus Celsius ® :marca registrada
xiv RESUMO
TURIBIO, T.O. Verificação da produção de substâncias bioativas a partir de fungos endofíticos isolados da Soja, Glycine max L. Merril contra patógenos humanos e vegetais. Dissertação de mestrado. Universidade Federal do Tocantins, Porto Nacional, 2011.
Fungos endofíticos são microrganismos que residem nos tecidos das plantas vivas, sem causar quaisquer sinais e sintomas, têm sido encontrados em todas as espécies de plantas até a presente data e são reconhecidos como fontes potenciais de novos produtos naturais para exploração na medicina, agricultura e indústria. A soja (Glycine Max L Merri pertence à família Leguminosae e é a mais importante oleaginosa cultivada no mundo, e sua participação é de cerca de 52% do total da produção de grãos plantados. Este trabalho tem como objetivo contribuir para o conhecimento da micota endofítica presente na Glycine max e avaliar o potencial destes microrganismos para produção de metabólitos com atividade antimicrobiana. Após 90 dias do plantio, foram coletadas 3 folhas sadias, sem qualquer mancha ou vestígio de predação de cada indivíduo. As folhas foram armazenadas em sacolas plásticas e processadas no Laboratório de Microbiologia Ambiental e Biotecnologia da UFT imediatamente, sendo retirados 5 fragmentos da amostra. Estes foram desinfetados superficialmente para, então, serem plaqueados em meio BDA para o isolamento de fungos endofíticos. Os isolados foram cultivados em meio BDA e, após 15 dias, tratados com metanol para obtenção de extratos brutos. A atividade antimicrobiana dos extratos brutos a 100 µg/disco foi avaliada pelo método de difusão em disco utilizando os microrganismos alvos:
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Candida. krusei e Cladosporium sphaerospermum. Já para determinação de atividade antagonista foi
realizado dois testes, um por meio de ensaio de produção de substâncias difusíveis no meio e outro pela produção de substâncias voláteis bioativas, utilizando os fitopatógenos alvos: Aspergillus parasiticus, Monilinia fructicola e Colletotrichum
gloeosporioides. Foram obtidos, no total, 140 isolados de fungos endofíticos de 480
fragmentos foliares, resultando em uma taxa de colonização de 29,2%. Dos extratos fúngicos testados, 77 (55%) foram ativos contra pelo menos um dos microrganismos alvos, sendo 54 contra S. aureus, 23 contra E. coli e 18 ativos simultaneamente contra estes dois microrganismos. Houve diferença significativa entre a inibição de S.aureus e
E. coli, sendo S. aureus mais sensível aos extratos fúngicos.Nenhum extrato foi ativo
contra Candida albicans, C. krusei e Cladosporium sphaerospermum. Dentre os isolados testados quanto à produção de substâncias difusíveis no meio, 16 inibiram o crescimento de pelo menos um dos fitopatógenos alvos, sendo 1 ativos contra
Aspergillus parasiticus. 12 contra Colletotrichum gloeosporioides e 1 contra Monilinia fructicola. No teste de produção de compostos voláteis bioativos, foram encontrados 16
isolados ativos 16 inibiram o crescimento de pelo menos um dos fitopatógenos alvos. 3 exclusivamente foram ativos contra Aspergillus parasiticus , 1 exclusivamente contra
Monilinia fructicola e 8 exclusivamente contra Colletotricum gloeosporioides. Sendo
que, 4 fungos tiveram atividade contra os patógenos Monilinia fructicola e
Colletotricum gloeosporioides. Um isolado desta morfo-espécie (M26) foi selecionado
para identificação molecular, tendo sido identificado como Fusarium oxysporum. Os isolados endofíticos apresentam-se como um possível produto potencial biotecnológico, já que alguns indivíduos apresentaram atividade contra mais de um microrganismo-alvo.
xv ABSTRACT
Verification of the production of bioactive compounds from endophytic fungi isolated from soybean, Glycine max (L) against human pathogens and plants. Master's thesis.Federal
University of Tocantins, Porto Nacional, 2011.
Endophytes are microorganisms that reside in the tissues of living plants without causing any signs and symptoms have been found in all plant species to date and are recognized as potential sources of new natural products for exploitation in medicine, agriculture and industry. Soybean (Glycine Max (L) Merril) belongs to the family Leguminous and is the most important oilseed crop grown in the world, and its share is about 52% of the total production of grain planted. This paper aims to contribute to the knowledge of mycota endophyte present in Glycine max and assess the potential of these microorganisms for production of metabolites with antimicrobial activity. After 90 days of planting, healthy leaves were collected 5, without any stain or trace of predation of each individual. The leaves were stored in plastic bags and processed in the Laboratory of Environmental Microbiology and Biotechnology of the UFT immediately being removed five fragments from the sample. These were disinfected superficially to be then plated on PDA to isolate endophytic fungi. The isolates were cultured on PDA and after 15 days, treated with methanol to obtain crude extracts. The antimicrobial activity of crude extracts at 100 mg / disc was evaluated by disk diffusion using the target microorganisms: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, C. krusei and Cladosporium sphaerospermum. Since the determination of antagonistic activity was carried out two tests, an essay by production of diffusible substances in the middle and another through the production of bioactive volatile compounds, using the target pathogens: Aspergillus parasiticus, Monilinia fructicola and Colletotrichum gloeosporioides. We obtained a total of 140 endophytic fungi isolated from leaf fragments of 480, resulting in a colonization rate of 29.2%. Of fungal extracts tested, 77 (55%) were active against at least one of the target microorganisms, and 54 against S. aureus, 23 against E. coli and 18 simultaneously active against these two microorganisms. The significant difference between the inhibition of S. aureus and E. coli, and S. aureus more susceptible to extracts fúngicos.Nenhum extract was active against Candida albicans, C. krusei and Cladosporium sphaerospermum. Among the isolates tested for the production of diffusible substances in the medium, 16 inhibited the growth of at least one of the target pathogens, being an active against Aspergillus parasiticus. 12 against Colletotrichum gloeosporioides and one against Monilinia fructicola. In the test production of bioactive volatile compounds, were found 16 active 16 isolates inhibited the growth of at least one of the target pathogens. Only 3 were active against Aspergillus parasiticus, an exclusively against Monilinia fructicola and only 8 against Colletotrichum gloeosporioides. Since, four have activity against
xvi
fungal pathogens Monilinia fructicola and Colletotrichum gloeosporioides. An isolate of morpho-species (M26) were selected for molecular identification and was identified as Fusarium oxysporum. The endophytic isolates presented as a possible potential of biotechnology products, as some individuals had more activity against a target organism.
17 1- INTRODUÇÃO
Os microrganismos como bactérias e fungos, são responsáveis por importantes transformações metabólicas, pelo controle biológico de doenças e pragas, além de serem um manancial de fármacos, corantes e enzimas, entre outros produtos úteis e ainda não explorados (AZEVEDO e MELO, 1998).
Endofíticos são microrganismos que residem nos tecidos das plantas vivas, sem causar quaisquer sinais e sintomas. Até a presente data, foram constatados que os endófitos são encontrados em todas as espécies de plantas e são reconhecidos como fontes potenciais de novos produtos naturais para exploração na medicina, agricultura e indústria (GUO et al., 2008 ). Além disso, os fungos endofíticos possuem um vasto recurso de metabólitos e compostos bioativos, que ainda não foram isolados e por isso esta assembléia de microrganismos têm merecido mais atenção (LI et al., 2004).
Os microrganismos endofíticos possuem uma íntima interação com os hospedeiros vegetais e esta relação entre microrganismos e plantas pode ser caracterizada como simbiose. Neste sentido entender os fatores que afetam essas interações na natureza podem ser importantes para predizer a dinâmica das comunidades terrestres. Atualmente, pouco se sabe sobre a biologia das interações planta-microrganismo em relação às interações planta macro-organismo, tais como herbívoros ou polinizadores (RUDGERS et al., 2009).
Estima-se que existam cerca de 300 mil espécies de plantas vasculares no planeta e cada planta pode ser hospedeira de um ou mais endófitos (STROBEL, 2003). Entretanto, o conhecimento destes microrganismos e a sua utilização em estudos de bioprospecção são recentes. Diversas estratégias podem ser adotadas para a escolha do grupo vegetal a ser utilizado para o estudo de fungos endofíticos aumentando a chance de obtenção de substâncias bioativas (VIEIRA, 2008).
18 Apesar da grande diversidade e abundância de endófitos em plantas vasculares, pouco se tem estudado sobre esta interação, quando comparado com a relação existente entre os endófitos e as gramíneas (CARROL, 1988, 1991).
Santos e colaboradores apud Michelliny (2010) define a bioprospecção como o método ou forma de localizar, avaliar e explorar sistemática e legalmente a diversidade de vida existente em determinado local. A bioprospecção tem como principal finalidade a busca de recursos genéticos e bioquímicos para fins comerciais.
As substâncias produzidas pelos endófitos comportam-se como um aleloquímico, inibindo o desenvolvimento de um parasita ou de um herbívoro da planta hospedeira, corroborando o conceito de alelopatia defendido por RICE (1984).
A cultura de Glycine max (L.) Merrill tem posição de destaque na agricultura mundial, com rendimento anual de aproximadamente U$ 215 bilhões (ASSUMPÇÃO, 2009). Segundo a Confederação Nacional de Abastecimento (CONAB 2009) o Brasil é o segundo maior produtor de soja do mundo, com uma produção de aproximadamente 60 milhões de toneladas.
Ultimamente, tem-se investido muito em pesquisas, para disponibilizar fontes alternativas de nutrientes às plantas, e em metodologias alternativas de controle de patógenos, com enfoque no uso de microrganismos endofíticos que ocorrem naturalmente em associação com os vegetais (PEIXOTO NETO et al., 2002).
Assim, estes microrganismos endofíticos podem ser empregados em metodologias como alternativa ao uso de insumos agrícolas , além de colaborar com a manutenção da sustentabilidade (ASSUMPÇÃO, 2009).
19 2. JUSTIFICATIVA
O Cerrado é uma fitofisionomia que representa às savanas brasileiras, ocupando quase 85% do Brasil central. Essa paisagem é caracterizada por extensas formações savânicas, interceptadas por matas ciliares ao longo dos rios. Este bioma é caracterizado por diferentes paisagens, tendo destaque o Cerradão e o Cerrado sensu stricto. A distribuição da flora deste bioma é condicionada pelo regime de chuvas, queimadas, profundidade do lençol freático, aspectos relacionados à química e física do solo, altitude e latitude, além de inúmeros fatores antrópicos (CARVALHO e PAREJA, 2007; SCHUBART et al. apud SILVA et al, 2007).
Dentre os fatores antrópicos que provocam a redução do bioma cerrado, pode-se ressaltar o cultivo de monoculturas, entre elas destaca-se a cadeia produtiva da soja. A monocultura pode provocar danos ao meio ambiente, no que tange ao uso indiscriminado de pesticidas, fungicidas e herbicidas (agroquímicos), uma vez que a maioria destes defensivos agrícolas são percolados e lixiviados (SPADOTTO e GOMES, 2004).
Outro ponto impactante está relacionado ao desmatamento para expansão do cultivo, que acaba por provocar um forte impacto sobre flora e fauna autóctone. Diante deste contexto, é importante encontrar alternativas que minimizem o impacto do meio ambiente, tornando esses agrossistemas mais sustentáveis.
O uso de microrganismos endofíticos como antagonistas para o controle de fitopatógenos tem sido bastante estudado atualmente, por vários motivos, principalmente pelos problemas ambientais e de saúde humana decorrentes do uso indiscriminado de agrotóxicos (GRIGOLETTI JÚNIOR et al., 2000; PERES et al., 2007).
20 Vega e colaboradores (2009) isolaram fungos endofíticos do café (Coffea
arabica L) no Havaí, Colômbia, Porto Rico e México e o estudo revelou a presença de
16 espécies de cinco gêneros de fungos entomopatogênicos. Os bioensaios conduzidos com dois dos isolados, Beauveria bassiana e Clonostachys rosea indicaram que estes são patogênicos contra o inseto que causa a broca do café.
Com o objetivo de diminuir a extensão da degradação do ambiente, perda de biodiversidade, deterioração da terra e da água, causada por excesso de agrotóxicos pode-se adotar métodos de controle biológico (GUO et al, 2008).
A utilização de organismos múltiplos em um consórcio que vai coexistir nos tecidos internos da planta está apenas começando a ser empreendida. Os resultados apresentados na identificação da supressão de um nematóide que parasita bananeira, induzido por uma comunidade antagonista de fungos endófitos, demonstrou que os consórcios microbianos contribuem efetivamente para a saúde vegetal (BACKMAN e SIKORA, 2008).
O uso das combinações de endofíticos com inseticidas comerciais aplicado às sementes ou mudas, poderá levar a efeitos sinergéticos sobre um ou vários agentes causadores de doenças. Os produtos químicos forneceriam uma supressão instantânea sobre os organismos patogênicos, enquanto que o agente biológico forneceria um controle continuado, reduzindo assim os impactos ambientais (BACKMAN e SIKORA, 2008).
Os microrganismos endofíticos são fontes potenciais de novos produtos naturais bioativos, com um enorme potencial para o desenvolvimento de novos medicamentos e produtos agrícolas. Apesar do aumento do número de estudos sobre os seus produtos naturais nos últimos anos, os endófitos ainda são um grupo relativamente pouco
21 estudado. Portanto, a investigação centrada nos endófitos é um campo promissor nos produtos naturais (GALLO et al., 2008).
O interesse em se cultivar produtos agrícolas orgânicos ou biologicamente sustentáveis, tem incrementado a busca por soluções, que possam propiciar a produção de alimentos de melhor qualidade e com o uso cada vez menor de substâncias sintéticas. Neste sentido, o isolamento de fungos endofíticos é uma ferramenta que pode ser utilizada no controle biológico de fungos patogênicos nas lavouras de Glycine max. Sendo, portanto, uma alternativa que minimizará o custo socioeconômico dos inseticidas tradicionais, além de evitar a resistência dos patógenos, a percolação dos agroquímicos para os mananciais de águas e a contaminação do solo, evitando também a contaminação de partes áreas do vegetal, principalmente as vagens de sementes.
Dentro deste contexto a utilização de fungos endofíticos no controle biológico, insere-se como um item fundamental da agroecologia, que busca a produção mais saudável dos alimentos sem uso de defensivos químicos, bem como a diversificação dos agroecossistemas e a valorização da sustentabilidade ambiental e econômica.
22 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS
O termo endófitos ou endofíticos foi usado pela primeira vez pelo cientista alemão Anton de Bary em 1884, e é usado para definir os fungos ou bactérias que ocorrem no interior dos tecidos vegetais sem causar quaisquer sinais ou sintomas no hospedeiro. Os fungos endofíticos foram detectados em centenas de plantas, incluindo muitas monoculturas como o trigo, banana, soja e tomates. Estes fungos têm sido utilizados satisfatoriamente no controle de insetos herbívoros e patógenos de plantas (ARNOLD, 2007; VEGA, 2009; SURYANARAYANAN et al 2009).
Os endófitos são definidos como fungos colonizadores de tecidos vegetais saudáveis, sem causar nenhum sintoma evidente ou nenhuma lesão aparente para o hospedeiro. (LI et al., 2004).
Muitos microrganismos endófitos isolados de diferentes ecossistemas são promotores de crescimento de plantas (produção de auxinas e giberelinas) e antagonistas de fitopatógenos, além de serem estudados para o desenvolvimento de produtos comerciais, em razão de seu elevado potencial biotecnológico (WELLER et al., 2002).
Os fungos endofíticos apresentam uma grande importância biotecnológica e ecológica, uma vez que a utilização destes microrganismos poderá reduzir a utilização de produtos químicos sintéticos (PINTO, 2003). Os microrganismos endofíticos podem ser utilizados em muitos processos e por isso entrou na idade de ouro da biotecnologia. Uma infinidade de produtos pode ser obtida pelos processos de fermentação, que incluem solventes, antibióticos, enzimas, vitamina, aminoácidos, polímeros e muitos outros compostos (ADRIO e DEMAIN, 2003).
23 Pesquisas revelam que fatores abióticos e bióticos podem afetar a relação planta-endófito, por exemplo, uma maior disponibilidade de nutrientes no solo pode reduzir a frequência de colonização. Em contra-partida, uma maior exposição a herbívoros pode aumentar a freqüência da endossimbiose (RUDGERS et al., 2009).
As plantas e microrganismos cultiváveis são as principais fontes de moléculas biologicamente ativas e úteis terapeuticamente, embora as triagens contínuas destas fontes frequentemente levem a altos índices de re-isolamento de substâncias já caracterizadas. (CLARDY e WALSH, 2004).
As interações endófito/planta, ainda não estão totalmente compreendidas, mas podem ser simbióticas, neutras ou antagônicas (neste caso, estudadas pela fitopatologia). Nas interações simbióticas os microrganismos produzem ou induzem a produção de metabólitos primários e secundários que podem conferir diversas vantagens à planta tais como: a diminuição da herbivoria e do ataque de insetos, o aumento da tolerância a estresses abióticos e o controle de outros microrganismos (SOUZA et al., 2004).
Nessa relação os fungos endófitos recebem nutrientes orgânicos, abrigo e transporte garantindo a perpetuação da espécie, enquanto que as plantas hospedeiras ficam mais vigorosas, resistentes à seca e a herbívoros, nematóides e patógenos de plantas infectadas (MÜLLER e KRAUSS, 2005).
SUN e colaboradores (2008) estudando a diversidade e composição da assembléia fúngica de endofíticos de plantas medicinais na China, sugerem que a distribuição dos endófitos é conspicuamente afetada pelos diferentes tipos de tecido da planta.
24 3.2APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS
SOUZA e colaboradores (2004) relata com base nos trabalhos de (Fahey, 1988; Murray et al., 1992; Volksch et al., 1992; Hallmann e Sikora, 1996; Stamford et al., 1998; Stierle et al., 1993; Wang et al., 2000; Strobel et al., 1999) que os endófitos são potencialmente úteis na agricultura e na indústria. Estes microrganismos podem ser usados como vetores para introdução de genes de interesse nas plantas, como agentes inibidores de pragas e patógenos e como fontes de metabólitos primários e secundários de interesse como o taxol, poderoso anticancerígeno, a cryptocandina, lipopeptídeo antimicótico e diversos outros antibióticos.
Há um relato recente indicando que 51% das substâncias biologicamente ativas e isoladas de fungos endofíticos eram previamente desconhecidos, enquanto apenas 38% das novas substâncias foram obtidas da microflora do solo (SCHUTZ apud STROBEL, 2003).
Em relação a assembléias de fungos endofíticos estudados recentemente, Sun e colaboradores (2008) relatam que as taxas de colonização e taxas de isolamento foram respectivamente, de (61%) e de (0,93), para seis plantas medicinais presentes no Jardim Botânico da China. Além disso, segundo Sun et al. (2008) afirma que as taxas de colonização e isolamento dos fungos endofíticos aumentaram com a idade do vegetal. Os resultados obtidos com base nas análises de agrupamento e com o do coeficiente de similaridade de Sorenson indicaram que alguns fungos endofíticos apresentaram um certo grau de acolhimento e de preferência por algum tipo de tecido.
Além da produção de substâncias que podem ser difundidas em meio, os fungos endofíticos têm habilidade para produzir substâncias voláteis. Neste contexto STROBEL e colaboradores 2001) ilustraram o papel do fungo endofítico Muscodor
25 efetivamente inibe crescimentos de outros fungos e bactérias, através de compostos voláteis.
Muscodor crispans é um fungo endofítico de Ananas comosus (abacaxi
selvagem) que é cultivado na bacia da Amazônia boliviana. Este microrganismo produz uma mistura de compostos orgânicos voláteis (COVs). Estes COVs são eficazes contra uma grande variedade de patógenos de plantas, incluindo Pythium ultimum,
Phytophthora cinnamomi, Sclerotinia sclerotiorum e Xanthomonas axonpodis pv.citri.
Além disso, COVs produzidos pelo M. crispans eliminou vários agentes patogênicos de humanos, incluindo Yersinia pestis e Mycobacterium tuberculosis. Os produtos gasosos da M. crispans potencialmente poderiam vir a ser utilizados pela indústria farmacêutica e na agricultura (MITCHELL et al; 2009).
O controle biológico de patógenos de plantas normalmente se refere ao uso de microrganismos que reduzem a severidade da doença, inibindo a atividade dos patógenos de plantas. Diferentes mecanismos de controle biológico de patógenos de plantas foram identificados, como a antibiose, a competição e o parasitismo (OWNLEY et al., 2010).
Recentes pesquisas têm mostrado que os endófitos de plantas podem atuar na degradação das toxinas presentes no meio ambiente. Sendo uma ferramenta importante para diminuir o grau de degradação ambiental, perda da biodiversidade e da deterioração da terra e da água, causada por excesso de inseticida, esgoto e gases tóxicos (GUO et al, 2008).
26 3.3 DESCRIÇÃO BOTÂNICA E IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DA Glycine
max L. Merrill
A soja é uma dicotiledênea herbácia pertencente à familia Fabaceae e ao gênero
Glycine L., que compreende 15 espécies (Tab. 1). O ciclo anual inicia-se com chuvas e
se desenvolve pelo período de 80 a 200 dias, dependendo do cultivar. Os frutos são vagens achatadas e curtas, com sementes elípticas ou achatadas e de coloração variada. O sistema radicular é composto por uma raiz pivotante com ramificações e nódulos com bactérias fixadoras de nitrogênio (GOMES, 1990; BORÉM, 2005).
Tabela 1. Classificação taxonômica de Glycine Max (Soja)
Classificação taxonômica da Soja
Reino: Plantae Filo: Magnoliophyta Classe: Magnoliopsida Ordem: Fabales Família: Fabaceae Gênero: Glycine L
Espécie: Glycine max L. Merrill
A soja cultivada comercialmente é uma planta herbácea com grande variabilidade genética, tanto no ciclo vegetativo (período compreendido da emergência da plântula até a abertura das primeiras flores), como no reprodutivo (período do início
27 da floração até o fim do ciclo da cultura), sendo também influenciada pelo meio ambiente (CISOJA, 2009).
A soja que se cultiva hoje é diferente daquela oriunda da China. Na segunda metade do século XX, o alto teor de óleo e proteína da soja aumentou significativamente a sua produção. Sendo assim, a partir de 1960, o Brasil inicia o processo de ampliação da produção. Em parte este aumento da produção se firmou como uma alternativa à cultura de trigo, no sul do País. Além disso, a soja poderia compor o farelo que alimentaria as empresas de beneficiamento de suínos e aves (EMBRAPA, 2010).
Glycine max (L) Merril pertencente à família Fabaceae é a mais importante
oleaginosa cultivada no mundo, e sua participação é de cerca de 52% do total da produção de grãos plantados. A soja no Brasil, até meados dos anos 60, não tinha a importância econômica como a da cana-de-açúcar, algodão, milho, arroz, café, laranja e feijão. No entanto, a partir do final dos anos 60, o cenário mudou e a soja tornou-se economicamente importante. Esse crescimento fez com que o Brasil aumentasse sua participação na produção mundial de 3,6%, em 1970, para 18,7%, em 1980. Nos anos 80, os Cerrados brasileiros começaram a ter importância econômica como região produtora (ANDERSON et al., 2003).
O comércio externo é de fundamental importância para o funcionamento do sistema agroindustrial (SAG) da soja no Brasil. Nos últimos dezesseis anos, a participação média da exportação com base em soja no Brasil foi de 73,1% da produção total. O (SAG) da soja é um dos mais expressivos na economia brasileira. Em 2005, as exportações do complexo da soja (grãos, óleo e farelo) totalizaram US$ 9,5 bilhões, correspondendo a 21,7% das exportações totais do agronegócio e 8% das exportações totais no Brasil. O Brasil é um dos poucos países com “estoques” de terras agrícolas a
28 serem exploradas. Tanto que, nos últimos dez anos, foram incorporados à produção da soja quase 12 milhões de hectares, com destaque para a incorporação observada na região Centro-Oeste (com aproximadamente 6.250 mil hectares), que representa, sozinha, 55% da expansão total do período (BRASIL, 2007).
No Brasil, a expansão da frente pioneira agrícola e a colonização do Centro-Oeste, a partir dos anos 70, têm ocasionado modificações profundas nas paisagens naturais dos biomas Cerrado e Floresta Amazônica (CARDILLE e FOLEY, 2003). Essas áreas apresentam uma biodiversidade frágil com elevado grau de endemismo (MYERS et al., 2000), onde concorrem com interesses socioambientais e econômicos, sendo que esses últimos têm prevalecido sobre os demais no que tange à expansão da cultura da soja no Mato Grosso nos últimos anos (DUBREUIL et al., 2009). Segundo Barreto (2011) a otimização da utilização dos espaços já ocupados pela sojicultura é uma saída para o aumento da produção sem a devastação dos biomas.
Na região Norte, o estado do Tocantins é o que apresenta grande potencial de expansão na área cultivada com soja. Pesam a favor desse estado, condições climáticas favoráveis à produção de soja, bases de preço mais forte que em outras regiões, preços das terras relativamente mais baixos que na Bahia ou em Mato Grosso, logística favorável ao escoamento e, recentemente, a implementação de unidades processadoras do grão. Porém, há fatores negativos no Estado, como a disponibilidade limitada de fazendas com maiores extensões (restringindo a escala de produção) e condições de relevo não tão favoráveis como na Bahia (BRASIL, 2007).
A cada ano, novas fronteiras são estabelecidas, em que, devido ao uso abusivo e errôneo de agrotóxicos, as relações de equilíbrio desses agroecossistemas são desestabilizadas, ocorrendo seleção de plantas daninhas, doenças e pragas resistentes e em altas taxas populacionais. Além da contaminação do homem e ambiente. Soma-se a
29 isso explosão populacional de pragas anteriormente consideradas de importância secundária, como consequência indesejável desse mau uso dos inseticidas (PALUMBO et al., 2001; DIEZ-RODRÍGUEZ e OMOTO, 2001).
A soja é a cultura que tem a maior demanda em água para as operações de aplicação de agroquímicos representando cerca de 70% da água consumida para este fim (GANDOLFO et al., 2011). As principais bacias hidrográficas brasileiras (Amazônica e do São Francisco) nascem no cerrado e impactos como a perda de grandes volumes de água através da irrigação e a substituição da vegetação natural por culturas agrícolas podem causar a essas bacias o assoreamento e a contaminação por agrotóxicos e fertilizantes (HENRIQUE, 2003).
Verifica-se que a aplicação de agrotóxicos pode exercer efeitos perniciosos sobre fungos entomopatogênicos, interferindo no seu papel de agente de controle natural e ocasionando surtos da praga. Em muitos sistemas agrícolas, os fungos entomopatogênicos são agentes importantes de controle natural de diversas espécies de insetos, ácaros e pragas (SOSA-GOMEZ, 2005).
Experimentos de campo têm demonstrado que aplicações de fungicidas, na cultura da soja, podem estimular a incidência de maior número de lagartas nas áreas tratadas com benomil ou difenoconazole por supressão de um dos inimigos mais importantes das lagartas, o fungo Nomuraea rileyi (SOSA-GÓMEZ et al., 2003).
Para tentar minimizar esse quadro, tem-se enfatizado o emprego do controle biológico (VAN LENTEREN e BUENO, 2003), que preconiza a utilização de diversas táticas de controle de forma harmônica, visando a complementar o controle biológico natural, a fim de manter as populações de pragas agrícolas abaixo do nível de dano econômico, conservando o ambiente.
30 Embora a diversidade de fungos patogênicos associados com a Glycine max sempre ter sido registrada na literatura, há uma escassez de informações quanto às espécies não patogênicas, Como os fungos endofíticos de importância econômica associados a estas plantas.
Nem a importância ecológica, nem aplicações econômicas da maioria dos endófitos foram descritos, porém em parte devido poucas espécies de plantas terem exaustivamente pesquisadas com enfoque nestes microrganismos. Dada a enorme importância econômica da Glycine max, bem como a importância da planta em sistemas agro-florestais sustentáveis e os esforços de conservação, há um interesse crescente para examinar a sua comunidade endofítica.
31 4. OBJETIVOS
4.1 Geral
Contribuir para o conhecimento da micota endofítica associada à Glycine max L. Merril e avaliar o potencial destes microrganismos quanto à produção de metabólitos com atividade antimicrobiana.
4.2 Específicos
Isolar a comunidade de fungos endofíticos associados a (Glycine Max L. Merril) e avaliar o seu potencial biotecnológico;
Caracterizar a comunidade de fungos endofíticos isolados da (Glycine Max (L)
Merril);
Verificar a taxa de colonização dos isolados de (Glycine Max L. Merril); Identificar os microrganismos que apresentarem atividade microbiana;
Verificar a produção de substâncias bioativas contra Candida albicans ATCC 18804, C. krusei ATCC 20298, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus
aureus ATCC 12600 e Cladosporium sphaerospermum CCT 1740;
Verificar a produção de compostos voláteis contra Aspergillus parasiticus IMI 242693 (International Mycological Institute, Inglaterra); Monilinia fructicola (ameixa 3635) e Colletotrichum gloeosporioides (INCOPER)
Depositar os isolados na coleção de micro-organismo do Laboratório de Microbiologia Ambiental da Universidade Federal do Tocantins.
32 5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Planta Hospedeira
As sementes de soja (Glycine max L. Merril foram adquiridas do banco de germoplasma da Universidade Federal do Tocantins, Campus de Gurupi e pertencem à linhagem M-Soy 8360 RR. As sementes foram cultivadas em vasos na Área Experimental do Campus da Universidade Federal do Tocantins em Palmas.
5.2 Coleta e cultivo dos fungos
Após 90 dias do plantio, foram coletadas 5 folhas sadias de cada indivíduo, sem qualquer mancha ou vestígio de predação, totalizando 32 indivíduos. As folhas foram armazenadas em sacolas plásticas e processadas no Laboratório de Microbiologia Ambiental e Biotecnologia da UFT imediatamente.
As folhas coletadas foram lavadas com detergente neutro e enxaguadas com água destilada estéril, de cada folha foram retirados cinco fragmentos. Estes fragmentos foram desinfetados superficialmente através da imersão em álcool 70% (1 minuto), hipoclorito de sódio 2% (3 minutos) e água destilada (2 minutos). Após desinfecção superficial, os fragmentos foram transferidos para placas de Petri contendo Agar Batata Dextrosado (BDA/Difco) suplementado com 100 µg/mL de cloranfenicol (Sigma/EUA). As placas foram incubadas a 25-28 ºC por um período de até 60 dias e os isolados foram purificados em novas placas de Petri contendo meio BDA. Os isolados de fungos filamentosos obtidos foram preservados, em duplicata, em água destilada estéril e em glicerol 30% a 80 ºC negativos. Todos os isolados obtidos durante o estudo foram depositados na Coleção de Microrganismos do laboratório de Microbiologia Ambiental da Universidade Federal do Tocantins.
33 5.3 Frequência de colonização
A frequência de colonização, que corresponde ao número de fragmentos colonizados foi calculada utilizando-se a fórmula:
= . 100
5.4 Extratos vegetais
As partes remanescentes de folhas dos trinta e dois indivíduos de Glycine max, não utilizadas para o isolamento de fungos endofíticos, foram transferidas para tubos cônicos de 50 mL, sendo adicionados 25 mL de metanol P. A.
Estes tubos foram mantidos ao abrigo da luz e, após 15 dias, o sobrenadante (extrato metanólico) foi filtrado com o uso de esferas de algodão previamente imersas em metanol por três dias e secas em estufa. Os extratos brutos foram, então, transferidos para um tubo de ensaio de 10 mL .
5.5 Cultivo dos fungos e preparo dos extratos fúngicos
Os fungos filamentosos obtidos foram cultivados em meio BDA a 28°C por um período de 14 dias. Após esse período, foi realizada a fragmentação do micélio juntamente com o meio de cultivo utilizando uma espátula estéril. Os fragmentos foram transferidos para tubos cônicos de 50 mL, sendo adicionados 25 mL de metanol P.A. Onde Nd e Nt correspondem, respectivamente, ao número de amostras das quais foi possível isolar um ou mais fungos endofíticos e ao número total de fragmentos amostrados (TAYLOR et al., 1999).
34 Estes tubos foram mantidos refrigerados a 5ºC e ao abrigo da luz e, após 7 dias, o sobrenadante foi filtrado com o uso de esferas de algodão previamente imersas em metanol por 3 dias e secas em estufa. Os extratos brutos foram transferidos para 2 tubos de 2 mL e, posteriormente, secos em estufa a temperatura inferior a 35ºC.
Os extratos secos obtidos foram solubilizados em solução de água:metanol (9:1) a uma concentração de 10 mg/mL e mantidos a –20°C para posterior utilização nos ensaios antimicrobianos.
5.6 Determinação da atividade microbiana
A determinação da atividade antimicrobiana dos extratos fúngicos foi realizada pelo método de difusão em disco utilizando-se os seguintes microrganismos alvos: Leveduras: Candida albicans ATCC 18804, Candida. krusei ATCC 20298; Bactérias
Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 12600 e o fungo
filamentoso Cladosporium sphaerospermum CCT 1740.
5.7 Padronização dos inóculos
O inóculo das leveduras foi padronizado por meio da escala de Mac Farland nº 1 em densidade óptica, o que corresponde a 3x108 UFC/mL (YARROW, 1998). As leveduras foram crescidas em Ágar Sabouraud a 28ºC por 48 horas. Cinco colônias foram suspensas em solução salina estéril 0,145 mol/L (salina a 0,85%). A suspensão resultante foi homogeneizada em agitador de vórtex durante 15 segundos e a densidade celular ajustada com espectrofotômetro, acrescentando-se solução salina suficiente para
35 obter a absorbância equivalente à de uma solução-padrão da escala de Mc Farland nº 1, em comprimento de onda de 530 nm (NCCLS, 2002).
O inóculo das bactérias foi padronizado por meio da escala de Mc Farland nº 0,5 em densidade ótica, o que corresponde a 1 a 2x108 UFC/mL. As bactérias foram crescidas em ágar BHI (infusão de cérebro e coração) a 35ºC por 24 horas. Três colônias foram transferidas para um tubo contendo 9 mL de caldo BHI, que foi incubado à 37ºC por 12 horas. Em 1 mL desta suspensão foi acrescentada caldo BHI suficiente para obter a absorbância equivalente a uma solução padrão da escala de Mc Farland 0,5 em comprimento de onda de 625 nm (NCCLS, 2003).
Para a padronização do inóculo do fungo filamentoso, culturas puras de C.
sphaerospermum foram previamente crescidas em meio ágar BDA (Batata dextrose e
ágar), a 28 ºC no escuro. Ao atingir a fase de maior esporulação (10-14 dias), cerca de 10-20 mL de polissorbato- 20 (Tween®) a 0,05% foi vertida sobre as culturas e, com o auxílio de uma alça de semeadura, o crescimento fúngico foi raspado e os esporos foram coletados em condições assépticas. Esta suspensão foi filtrada em gaze estéril para Erlenmeyers também estéreis, para eliminação de fragmentos de meio de cultura e de micélio fúngico. Para contagem do número de esporos, uma alíquota desta suspensão foi transferida para uma câmara de Neubauer com o auxílio de uma micropipeta. Utilizando-se um microscópio óptico, com aumento de 40X, foram contados os esporos presentes em 25 áreas de 1/16 mm. O número total de esporos/mL da suspensão foi então calculado utilizando-se a fórmula: Nº total de esporos/mL = [Total de esporos x (1 / 0,00025) x diluição x 103] / Nº total de retículos e a concentração foi ajustada para 5x107 esporos/mL.
36 5.8 Ensaio antimicrobiano
Para a realização do ensaio antimicrobiano, um “swab” foi imerso nas suspensões celulares de leveduras e bactérias previamente padronizadas. Os microrganismos alvos foram inoculados em placas de Petri contendo meio ágar Sabouraud para as leveduras e meio ágar BHI para as bactérias (ROSA et al., 2003).
Discos de papel estéreis (6,2 mm de diâmetro) foram colocados sobre a superfície seca das placas inoculadas com os microrganismos-alvo e 10 µL da solução em água: metanol (9:1) de cada extrato fúngico (10 mg/mL) foi aplicado sobre os discos (100 µg/disco).
Foram considerados ativos os extratos que apresentaram halo de inibição após um período de incubação de 24h/28ºC para as leveduras e 48h/37ºC para as bactérias, respectivamente.
Figura 1. Representação esquemática do teste antimicrobiano
37 Para a determinação da atividade antifúngica frente ao microrganismo alvo C.
sphaerosperum, 100 µg de cada extrato fúngico foram aplicados em papel de filtro e
secos à temperatura ambiente.
A suspensão contendo esporos de C. sphaerospermum na concentração final de 5x107 esporos/mL foi borrifada sobre o papel de filtro onde as amostras foram aplicadas e, em seguida, o mesmo foi incubado durante 72 horas a 28ºC em câmara úmida. Após este período, foi observada a presença/ausência do crescimento fúngico próximo às áreas de aplicação dos extratos. Como controles positivos foram aplicados 100 µg de cloranfenicol (Sigma/EUA) para as bactérias e 100 µg de anfotericina B (Sigma/EUA) para as leveduras e para o fungo filamentoso.
O extrato do meio de cultura sem crescimento fúngico, e 10 µL da solução água:metanol (9:1) foram utilizados como controles negativos. Todos os extratos brutos foram avaliados em triplicata para a atividade antimicrobiana, em dias diferentes.
Para verificar se houve diferenças nos tratamentos quanto a inibição de S. aureus e E. coli, (Tratamento 1: S. aureus sensíveis aos extratos fúngicos; Tratamento 2: E. coli sensíveis aos extratos fúngicos) foi aplicado o procedimento MIXED do SAS (SAS, 2001) que disponibiliza ao usuário em torno de 40 tipos de estruturas de (co)variâncias residuais e critérios para escolha da melhor estrutura para determinado conjunto de dados. Esses critérios, em geral, incluem o valor da função de máxima verossimilhança restrita, o número de dados analisados e de parâmetros a serem estimados.
A escolha da melhor estrutura de (co)variância residual e do modelo mais adequado é fundamental na análise de dados, caso contrário, os resultados podem ocasionar conclusões equivocadas. Segundo Littell e outros (1998), a escolha da estrutura de (co)variância para os resíduos é importante porque os erros-padrão das
38 médias são dependentes desta escolha e, caso se opte por uma estrutura inadequada, os erros-padrão podem ser viesados.
As estruturas AR (1): regressiva de primeira ordem; ARMA(1,1): auto-regressiva de primeira ordem com média móvel; CS: simetria composta e VC: componentes de variância consideram homogeneidade de variâncias, enquanto as estruturas CSH: simetria composta heterogênea; HF: Huynh–Feldt; UN: não-estruturada; ANTE: Ante-Dependência; FA(1): fator analítico de primeira ordem; DPUN: Produto Direto não estruturado, consideram heterogeneidade de variâncias. Na estrutura CS, todas as covariâncias são iguais e, na VC, as covariâncias são nulas. As demais estruturas consideram diferentes covariâncias para cada par de medidas.
Para escolha do arranjo para efeitos fixos e da estrutura de (co)variância que melhor representam a variabilidade entre e dentro dos extratos fúngicos, respectivamente, foram utilizados os critérios “-2 Residual Log Likelihood”(-2RLL) e “Consistent Akaike’s Information Criterion”(CAIC), obtidos com as seguintes fórmulas (WOLFINGER, 1993; SAS, 2001):
-2RLL = (n - p) ln (2π) + ln|ZGZ' + R| +ln|X'(ZGZ' + R)-1 X|+(y - Xb)'(ZGZ' + R)-1 (y -
Xb)
CAIC = -2RLL + d(ln k + 1);
em que: n = número de observações (153); p = posto da matriz X; k = número de observações utilizadas (846); y = vetor de observações (846 x 1); X = matriz de incidência dos efeitos fixos (846 x número de tratamentos); b = vetor das soluções para os efeitos fixos (número de tratamentos x 1); Z = matriz de incidência dos efeitos aleatórios (846 x 153).
39 As pressuposições assumidas neste trabalho consistiam de que todas as matrizes apresentaram distribuição normal multivariada (NMV). Neste contexto, a média de y assumiu a média dos tratamentos com variância igual a matriz ZGZ', e a média do resíduo igual a zero com variância igual a própria matriz residual. Contudo, testou-se a normalidade dos dados através dos testes de Shapiro-Wilk (W) e de Kolmogorov-Smirnov (D), em que para ambos, o valor calculado de W e de D não foram estatisticamente significativos para P = 0,05 (W = 0,129; D = 0,097), aceitando-se a hipótese que a distribuição estudada é normal.
Os parâmetros das matrizes de (co)variâncias residuais foram estimados pelo método da Máxima Verossimilhança Restrita, observando-se que, no procedimento MIXED do SAS, o máximo é obtido pelo método de Newton-Raphson.
Como critério de convergência do algoritmo de busca do ponto de máximo da função de verossimilhança restrita, adotou-se o padrão do procedimento MIXED do SAS:
| |
Nesste contexto, quanto menor os valores de -2RLL e de CAIC, melhor ajuste do modelo (SAS, 2001).
O modelo estatístico adotado na análise de variância foi descrito como: y = µ + Ti + ei
Onde: y = valor da observação do halo de inibição; µ = média para o conjunto de dados; Ti = efeito do Tratamento (i); ei = erro aleatório.
≤ 1 * 10-8 em que fk= valor da função de interesse (verossimilhança restrita); gk = primeira derivada da função de interesse; e Hk = segunda derivada da função de interesse, ambos na iteração k (SAS, 2001).
40 5.9 Determinação de atividade antagonista
Para a realização dos ensaios de antagonismo, todos os fungos endofíticos isolados foram testados quanto à produção de substâncias difusíveis e voláteis contra os seguintes fitopatógenos: Monilinia fructicola (mfa3635) e Colletotrichum gloeosporioides (CG-incoper02).
Os isolados endofíticos foram previamente cultivados em ágar Sabouraud durante sete dias. No teste de verificação de substâncias difusíveis, um disco de ágar de 5 milímetros de diâmetro contendo micélio de cada fungo endofítico foi inoculado em um lado da placa de Petri contendo meio ágar Sabouraud e incubado por três dias a 25ºC. Em seguida, um disco similar de cada fitopatógeno foi inoculado no outro lado da placa. Após três dias de incubação a 25ºC, o raio do micélio fúngico foi medido e comparado com o controle (Figura 2).
O controle do ensaio descrito foi feito com a inoculação de cada fitopatógeno no meio de cultura sem o antagonista. Todos os testes positivos foram repetidos três vezes.
41
Figura 2. Representação esquemática do teste antagonista por difusão em ágar. Onde 1= microrganismo antagonista e 2 = microrganismo alvo.
6.0 Verificação da produção de Compostos Voláteis
O teste de produção de substâncias voláteis foi realizado utilizando placas de Petri das quais foram cortado o meio de cultura, removendo uma faixa na porção central do mesmo, a fim de evitar o efeito de difusão. Estas placas foram seladas com parafilme, após a inoculação do endofítico e do fitopatógeno.
O controle do ensaio descrito foi realizado com a inoculação de cada fitopatógeno no meio de cultura sem o antagonista. Todos os testes positivos foram repetidos três vezes.
Para os testes de inibição por produção de substâncias voláteis foram utilizados os microrganismo citados a seguir: Aspergillus parasiticus; Monilinia fructicola e
Colletotricum sp.
1 2
42
Figura 3. Representação esquemática do experimento de detecção de Compostos voláteis. A = antagonista P = fitopatógeno.
6.1 Identificação dos Fungos Filamentosos
Os isolados de fungos filamentosos que apresentarem atividade antimicrobiana tiveram as colônias fotografadas (frente e verso) e agrupadas de acordo com as seguintes características macro-morfológicas: cor da colônia (frente e verso), textura da superfície (frente e verso) e aspecto da borda (WEI apud ZHOU et al., 2010).
Embora muitas espécies tenham sido simplesmente divididas por suas características de macroscópicas, estas divisões, nem sempre são compatíveis com suas reais relações filogenéticas (MIU e HONG, 2007).
Com o avanço da ciência, tecnologia e desenvolvimento de taxonomia, técnicas de biologia molecular foram introduzidas na moderna taxonomia dos fungos. A utilização da técnica do 18S do DNA ribossomal (rDNA) e do ITS é eficiente para realizar análises filogenéticas e de agrupamentos (ZHOU et al., 2010).
43 Um isolado de cada morfoespécie foi então selecionado para identificação molecular por meio do seqüenciamento da região transcrita interna (ITS1-5.8S-ITS2) do DNA ribossomal.
6.2 Extração do DNA total
A extração do DNA total foi realizada de acordo com De Hoog et al. (2003). Os fungos filamentosos foram crescidos por sete dias em ágar Sabouraud. Fragmentos de micélio foram colocados em tubo de 1,5 mL acrescidos de 400 µL de tampão de lise (Tris-HCl - 0,05 M, EDTA - 0,005 M, NaCl 0,1 M e SDS 1%) e deixado a – 20 ºC por aproximadamente 10 minutos. O micélio foi triturado com o auxílio de um pistilo e foram acrescidos 5 µL de Proteinase K (50 µg/mL). Após essa etapa, foram adicionados 162 µL de CTAB de Hoog (Tris 2M, NaCl 8,2%, EDTA 2M e CTAB 0,2%), seguido de homogeneização e incubação por 10 minutos a 65 ºC. Em seguida, foram acrescentados 570 µL da mistura clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Após homogeneização, o tubo foi incubado por 30 minutos em gelo. Em seguida, o conteúdo foi centrifugado a 13.200 r.p.m. por 10 minutos e o líquido sobrenadante transferido para um novo tubo de 1,5 mL, e contendo 10% do volume de uma solução de acetato de sódio 3 M. O tubo foi vertido para homogeneização, incubado a 0 ºC por 30 minutos e centrifugado a 13.200 r.p.m. por 10 minutos.
O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, no qual foi adicionado 50% do volume de isopropanol e centrifugado a 13.200 r.p.m. por 5 minutos. O sobrenadante foi desprezado por inversão. A seguir, foram adicionados 200 µL de etanol (Merck) 70% p/v e a suspensão foi gentilmente homogeneizada. Após este procedimento, a amostra foi centrifugada a 13.200 r.p.m. por 5 minutos e o sobrenadante desprezado por
44 inversão, seguido por homogeneização com etanol 70% p/v. A amostra foi seca por aproximadamente 15 minutos, 50 µL de Tris-EDTA (Tris-HCl 0,01 M e EDTA 0,001 M) foram adicionados e a mesma foi incubada a 65 ºC por 60 minutos para hidratação do DNA. As amostras foram armazenadas em freezer a –20 ºC.
6.3 Obtenção dos amplicons
Os iniciadores ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (TCCTCCGCTTATT GATATGC) foram utilizados para amplificação da região ITS do rDNA, conforme descrito por White et al. (1990). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada em um volume final de 50 µL, contendo 2,0 µL de DNA, 1,0 µL de cada iniciador ITS1 e ITS4 10 µmol-1 (MWG Biotech), 5,0 µL de tampão de PCR 5X (Fermentas), 2,0 µL de MgCl2 25mM, 2,0 µL de dNTP 10 mM, 0,3 µL de Taq DNA polimerase 5U (Fermentas) e o volume final completado com água destilada estéril. As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador PCR Express (Thermo Hybaid). O programa consistiu de uma desnaturação inicial a 94 ºC por 5 min, seguida por 35 ciclos de 1 min de desnaturação a 94 ºC, 1 min de anelamento a 55 ºC e 1 min de extensão a 72 ºC, e uma extensão final por 5 min a 72 ºC. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1 %, em tampão TBE 0,5 X, eluídos durante aproximadamente 1 h a 120 V. Os géis foram corados com solução de brometo de etídio, visualizados sob luz ultravioleta e fotografados.
45 Os amplicons gerados pela reação de PCR foram purificados utilizando-se polietilenoglicol (PEG). Ao produto de PCR foi adicionado igual volume de uma solução de polietilenoglicol 20 % em NaCl 2,5 M, que foi mantido em banho-maria a 37 ºC por 15 min. O tubo foi centrifugado a 13.500 r.p.m. por 15 mine o sobrenadante foi retirado e descartado. A seguir, foram adicionados 125 µL de etanol 70-80% resfriado a 4 ºC. O tubo foi centrifugado a 13.500 r.p.m. por 2 min e o etanol foi retirado. Este passo foi repetido mais uma vez e a amostra foi novamente centrifugada a 13.200 r.p.m. por 1 min. O tubo foi deixado à temperatura ambiente para evaporação de todo o excesso de etanol. Foram adicionados 10 µL de água deionizada estéril e o conteúdo do tubo foi homogeneizado em vórtex por 15 s. Em seguida, o tubo foi incubado em banho-maria a 37 ºC por 40 min. O produto obtido foi dosado em NanoDrop ND 1000 (NanoDrop Thecnologies) para ser utilizado nas reações de sequenciamento.
6.5 Reações de sequenciamento
O sequenciamento foi realizado utilizando-se o Kit DYEnamicTM (Amersham Biosciences, USA) em combinação com o sistema de sequenciamento automatizado MegaBACETM 1000, no Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular (LBEM –UFMG). Para as reações de sequenciamento foram utilizados 100-150 ng do DNA purificado e os reagentes presentes no Kit DYEnamicTM (Amersham Biosciences, USA). A reação de PCR foi realizada em um volume final de 10 µL contendo 4 µL do pré-mix (presente no kit de sequenciamento) e 1 µL do iniciador (5 µmol-1), completando-se o volume final com água deionizada estéril. O programa consistiu de 36 ciclos de uma desnaturação inicial a 95 ºC por 25 min, seguido por 15 s de anelamento a
46 50 ºC e 3 minutos de extensão a 60 ºC. Em seguida, os produtos da reação foram transferidos para uma placa de sequenciamento de 96 poços para serem precipitados.
6.6 Precipitação da reação de sequenciamento
Para precipitação das reações de sequenciamento, 1 µL de acetato de amônio 7,5 M foi adicionado em cada poço da placa de 96 poços. A solução de acetato de amônio foi dispensada na parede lateral dos poços e a placa levemente batida sobre a bancada para que as gotas do acetato de amônio se misturassem à reação. Em seguida, foram adicionados 28 µL de etanol P.A. (Merck). A placa foi submetida à agitação em vórtex e incubada por 20 minutos à tempertaura ambiente, protegida da luz.
Após período de incubação, a placa foi centrifugada por 45 minutos a 4000 r.p.m. O sobrenadante foi descartado virando-se a placa sobre um papel absorvente. Em seguida, foram adicionados 150 µL de etanol 70% (Merck). A placa foi novamente centrifugada por 15 minutos a 4000 r.p.m e o sobrenadante foi então descartado. Para remoção do excesso de etanol, a placa foi invertida sobre um papel absorvente, e submetida a um pulso em centrífuga a 900 r.p.m. durante 1 segundo. Em seguida, a placa foi mantida em repouso durante 20-40 minutos, protegida da luz, para evaporação do etanol.
O DNA das amostras precipitado em cada poço da placa foi então ressuspendido em 10 µL de Loading buffer. A placa foi submetida à agitação em vórtex por 2 minutos, centrifugada por 1 segundo a 900 r.p.m. e armazenada a 4ºC, protegida da luz, até injeção das amostras no sistema automatizado MegaBACETM 1000.
47 As sequências de DNA foram analisadas utilizando-se o programa BLASTn (Basic Local Alignment Serch Tool - versão 2.215 do BLAST 2.0) disponível no portal NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) desenvolvido pelo National Center For Biothecnology.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
7.1 Coleta e isolamento de fungos endofíticos associados a Glycine max L.
Ao fim da coleta foram obtidos 140 isolados de fungos endofíticos de 480 fragmentos de folhas de Glycine max L.(Tabela 2), resultando numa taxa de colonização de 29.2%. Esse valor é superior ao descrito por Pimentel e colaboradores (2006), que obtiveram uma taxa de colonização de 17,2%, quando estudaram a colonização de fungos endofíticos de Glycine max L. em diferentes condições ambientais. Porém,
48 existem poucos relatos que analisam a micota endofítica presente nas folhas neste grupo de plantas.
Tabela 2. Relação de fungos filamentoso isolados de cada indivíduo de Glycine max L.
Hospedeiro Frequência Freqüência
relativa P1 6 4.29 P2 5 3.57 P3 3 2.14 P4 4 2.86 P5 6 4.29 P6 2 1.43 P7 1 0.71 P8 3 2.14 P9 3 2.14 P10 7 5.00 P11 4 2.86 P12 6 4.29 P13 0 0.00 P14 7 5.00 P15 3 2.14 P16 6 4.29 P17 0 0.00 P18 2 1.43 P19 8 5.71 P20 1 0.71 P21 9 6.43 P22 4 2.86 P23 6 4.29 P24 4 2.86 P25 4 2.86 P26 6 4.29 P27 4 2.86
49 7.2 Cultivo dos fungos para obtenção dos extratos metanólicos
No presente trabalho foram produzidos extratos metanólicos a partir dos fragmentos de folha de Glycine max e de todos os isolados de fungos para avaliação da atividade antimicrobiana de fragmentos de folha de Glycine max e também de todos os isolados de fungos filamentosos endofíticas obtidos. Foram obtidos 32 extratos de folhas de Glycine max e 140 extratos dos isolados fúngicos.
Segundo Dai e Tao (2008), fatores como a temperatura, pH, umidade e tempo de crescimento das culturas podem resultar em diferenças significativas na produção destes metabólitos. Neste estudo foi utilizado o metanol devido à sua polaridade e afinidade por moléculas de baixo e médio peso molecular, e satisfatório poder de penetração em meios de cultura sólidos (VIZCAÍNO et al., 2005; LI et al., 2004, RIEDELL et al., 1991). Além de que o uso de solventes orgânicos sempre proporciona uma maior eficiência na extração de atividades antimicrobiana, quando comparado com a extração com água ( SUAY et al. 2000, GONZALEZ del VAL et al. 2001).
Optou-se pela obtenção dos extratos a partir do crescimento de culturas em meio sólido. O método utilizado foi eficiente para ensaios de triagem, uma vez que diminuiu o tempo necessário para a extração. As concentrações dos extratos fúngicos obtidos variaram de 17,1 mg a 706,5 mg, o que foi suficiente para a realização de todos os ensaios para determinação da atividade antimicrobiana.
P28 7 5.00 P29 6 4.29 P30 5 3.57 P31 3 2.14 P32 9 6.43 Total 140 100
