O entendimento das características da atrofia tímica frente a infecções persistentes ou prolongadas é fundamental para o estabelecimento de terapias que visem a recuperação da função primária do órgão no curso da doença, para facilitar a terapia desses pacientes. A infecção local do timo pode levar a repercussões severas, particularmente quando; (i) tais infecções ocorrem durante a infância, quando o repertório de células T está se desenvolvendo, (ii) quando essas infecções estão associadas com severa linfopenia, onde é necessária reconstituição de repertório periférico, como é o caso da infecção pelo HIV, (iii) e quando a infecção é persistente, como na tuberculose e na PCM, que pode levar a tolerância ao patógeno (Nobrega et al., 2007, Sauce et al., 2009, Nobrega et al., 2010, Vogel et al., 2010).
No caso das infecções prolongadas do timo, podemos ter o aparecimento de células T tolerantes ao agente infeccioso, por mecanismos de tolerância central, que irão prejudicar a resposta de células T reativas ao patógeno na periferia. Tal cenário favoreceria o patógeno pois iria contribuir para sua persistência. Para minimizar tais consequências, existem mecanismos para combater o patógeno diretamente no timo. Assim como em outros tecidos, esses mecanismos são dependentes da recirculação de linfócitos T periféricos advindos de órgãos linfoides secundários, de volta para o timo (Nobrega et al., 2013). Apesar de serem necessários para a proteção, tais células também podem contribuir para a infecção do timo no caso de alguns patógenos.
A preservação do microambiente tímico é importante para a manutenção da integridade do órgão, tanto estruturalmente quanto funcionalmente, sustentando ótima diferenciação e egresso de linfócitos T e prevenindo o aparecimento de células tolerantes ao patógeno invasor. Assim o timo deve ser considerado como parte ativa durante os episódios de infecção e a contribuição desse órgão para a resposta imune em vigor não pode ser descartada.
Portanto, a análise do timo na fase tardia da infecção experimental pelo Pb é fundamental para o entendimento da função tímica em condições de infecção prolongada com o Pb, sendo semelhante ao observado na clínica em pacientes com PCM, cujo curso da infecção é bastante longo.
Índice tímico e dosagem do cortisol
As alterações tímicas ocorridas na fase tardia da infecção, com animais infectados por 120 dias, foram muito distintas das encontradas na fase precoce da infecção, em 7dpi e 21dpi. Apesar da atrofia por envelhecimento observada nos animais controle da fase tardia (com 26 semanas de idade) em relação aos animais controle da fase precoce (com 9 semanas de idade), o timo dos animais infectados por 120 dias apresenta profunda perda de peso relativo, sendo esta superior à encontrada nos animais controle envelhecidos (Figura 1A). Assim como observamos na fase precoce da infecção, a produção de cortisol sérico não se mostrou alterada entre os animais infectados por 120 dias e seus respectivos controles (Figura 1B).
Figura 1: Alteração do peso relativo do timo de camundongos BALB/c infectados é independente da produção de cortisol. Ct fp: animais controle da fase precoce (9 semanas); Ct ft: animais controle da fase tardia (26 semanas); 120dpi: animal infectado por 120 dias. Camundongos BALB/c machos foram infectados com 5x106 leveduras de P. brasiliensis cepa Pb18. Os animais foram mortos aos 120 dias após a infecção, o timo foi retirado e analisado quanto a sua massa, e o sangue total foi coletado e o soro separado para dosagem do cortisol. A) Observa-se perda de peso tímico nos animais Ct ft em relação ao Ct fp, pelo processo natural da atrofia tímica por envelhecimento, ainda assim animais 120dpi apresentam perda de peso relativo significativa em relação aos animais controle de idade pareada (Ct ft). B) Não foram observadas diferenças na concentração do cortisol encontrado nos grupos controle e infectado. Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. ****p<0,0001 teste paramétrico t de Student.
Análise histopatológica e detecção fúngica
As alterações histopatológicas encontradas no timo de animais infectados por 120 dias são muito mais drásticas do que as observadas na atrofia tímica em 7dpi e 21dpi. O estroma tímico está completamente desorganizado, não são observadas regiões corticais e medulares típicas e várias áreas do órgão apresentam grande perda de celularidade, notadas pela ausência da coloração hematoxilina-eosina utilizada (Figura 2, painel superior à direita). Ainda, sob maior aumento, é notado considerável infiltrado celular, com a presença inclusive de gigantócitos e formação de granuloma (Figura 2, painel central à direita). Interessantemente, o posicionamento da formação do granuloma e dos gigantócitos é circunjacente à presença de leveduras viáveis do patógeno, encontradas em grandes quantidades no que aparenta ser a região medular do órgão (Figura 2, painel inferior à direita).
Figura 2: Análises histopatológicas do timo durante a fase tardia da infecção pelo Paracoccidioides
brasiliensis. Camundongos BALB/c machos (n=5) foram inoculados intraperitonealmente com 5x106
leveduras do Pb18 contidas em PBS ou somente com PBS (grupo controle). Cento e vinte dias depois do inóculo, os animais foram mortos e os timos removidos para análise. 120dpi: animal infectado por 120 dias; Ct: animal controle H&E: Coloração por hematoxilina e eosina – 120dpi apresenta desorganização histológica, sem evidências de regiões corticais (C) e medulares (M) tipicamente bem definidas e grande área do corte não corada, evidenciando perda na celularidade. Em maior detalhe abaixo, observamos gigantócitos e formação de granuloma em 120dpi. No painel inferior, a coloração de Grocott mostrou através da impregnação por prata da membrana fúngica, considerável infiltrado de leveduras do Pb no que aparenta ser a região medular do órgão, confirmando que as regiões não coradas representam colônias fúngicas. As imagens são representativas de três experimentos independentes com resultados similares. As imagens foram obtidas em um microscópio Olympus BX50. Magnificação total: 40x (painéis superiores e inferiores); 100x (painel do meio).
Alterações nas subpopulações celulares linfoides e não linfoides do timo na fase tardia da infecção
A longa infecção com o Paracoccidioides brasiliensis levou a alterações significativas nas subpopulações celulares presentes no timo, entre elas as células epiteliais tímicas (TECs) e os timócitos.
Células epiteliais tímicas
Os subtipos de TECs foram primeiro selecionados dentre as células CD45- e depois quanto sua expressão de Ly51 e MHC de classe II, sendo que as células tímicas epiteliais medulares (mTEC) expressam Ly51-MHCII+ e as células tímicas epiteliais corticais (cTEC) por sua vez expressam Ly51+MHCII+. Em seguida as subpopulações de TECs foram avaliadas quanto às frequências de cTECs e mTECs dentro de células CD45-, onde foram encontradas alterações expressivas (Figura 3A). A frequência de cTEC diminuiu consideravelmente no timo de animais infectados, enquanto que a frequência de mTEC apresentou aumento nesses animais (Figura 3B). Em seguida, as células epiteliais tímicas foram avaliadas quanto ao número absoluto destas nos timos provenientes de animais infectados e controle
A análise do número absoluto das TECs mostrou uma redução significativa de ambos os subtipos, no grupo infectado (Figura 3C). Esse resultado corrobora os achados anteriores, onde a celularidade do órgão foi significativamente reduzida com a invasão e multiplicação das leveduras do Pb.
Figura 3: Citometria de fluxo das subpopulações de células epiteliais tímicas (TECs). 120dpi: animal infectado por 120 dias; Ct: animal controle. (A) Gráfico representativo das porcentagens das subpopulações de TECs. (B) Frequência das subpopulações de TECs, dentro de células CD45-, de animais controle e infectados. Observe a queda na frequência de cTEC, enquanto a frequência de mTEC aumenta significativamente. (C) Subpopulações de TECs de animais controle e infectados em número absoluto. Aos 120 dias de infecção ocorre uma redução nos números absolutos de ambas as subpopulações de TECs (cTEC e mTEC). Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. * P <0,05; ** p≤0,01; ***p<0,001 teste paramétrico t de Student.
Timócitos
As subpopulações de timócitos foram primeiro separadas quanto a sua expressão dos co-receptores CD4 e CD8, e analisadas quanto as frequências dessas subpopulações, onde não foram encontradas alterações significativas entre
os grupos infectados e controle (Figura 4A). A partir da contagem em câmara hemocitométrica, as celularidades dos timos foram aferidas, para computar os números absolutos das subpopulações de timócitos. Os animais controle de mesma idade que os animais 120dpi, apresentaram redução no número absoluto de todas as subpopulações de timócitos em comparação aos animais controle da fase precoce devido a atrofia tímica por envelhecimento (dados não mostrados). Aos 120 dias de infecção foram observadas alterações significativas no número absoluto das subpopulações de timócitos, com redução de todas as subpopulações em comparação com o grupo controle de idade pareada (Figura 14B).
Figura 4: Citometria de fluxo das subpopulações de timócitos. Ct: animais controle; 120dpi: animal infectado por 120 dias. (A) Gráfico representativo das porcentagens das subpopulações de timócitos. (B) Subpopulações de timócitos de animais controle e infectados em número absoluto. Observamos aos 120 dias de infecção experimental, redução no número absoluto de todas as subpopulações de timócitos quando comparamos ao controle de idade pareada Ct. Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. *p<0,05; ***p<0,001; teste paramétrico t de
Student.
Avaliação da frequência de células T portadoras de TCR Vβ5 e Vβ12 no baço A fase tardia da infecção pelo Pb induziu profundas alterações estruturais e celulares no timo. Devido ao enorme infiltrado fúngico encontrado no timo de animais infectados, e sabendo da importância da manutenção da integridade do microambiente tímico para que os processos de seleção ocorram corretamente, de forma a exportar para os órgãos linfoides periféricos somente linfócitos T responsivos a antígenos não próprios, incapazes de desencadear respostas auto- imunes, analisamos se o processo de seleção negativa estaria ocorrendo de forma regular. Para isso avaliamos a frequência de células T portadoras de TCRs com segmentos gênicos da porção variável “V”, que são normalmente deletados no processo de seleção negativa, no baço de camundongos infectados e controle.
As subpopulações de linfócitos T foram primeiro separadas quanto a sua expressão de CD3 e dos co-receptores CD4 e CD8, após, analisamos a frequência dos linfócitos T que expressavam TCRs Vβ5 e Vβ12 (Figura 5A). Aos 120 dias de infecção observamos uma diminuição significativa, nas frequências de linfócitos T CD4+ e CD8+ que possuíam TCRs Vβ5 e Vβ12, restritos ao timo, nos baços desses animais quando comparados ao controle (Figura 5B).
Ainda que o resultado possa sugerir um processo de seleção tímica mais rigoroso, com eliminação de linfócitos T que possuam TCRs potencialmente auto- reativos, acreditamos que na verdade o desenvolvimento e egresso de linfócitos T
do timo esteja intensamente prejudicado devido às alterações tímicas observadas, podendo ter sido drasticamente reduzido ou até mesmo interrompido e, com isso observamos uma diminuição desses clones de linfócitos T que expressam TCRs Vβ5 e Vβ12.
Figura 5: Citometria de fluxo para avaliar a frequência de linfócitos T Vβ5+ e Vβ12+
no baço. 120dpi: animal infectado por 120 dias; Ct: animal controle. (A) Gráfico representativo das porcentagens das subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+ expressando Vβ5 ou Vβ12. (B) Frequência de linfócitos T que expressam TCRs restritos ao timo de animais controle e infectados. Aos 120 dias de infecção experimental, ocorre diminuição na frequência de linfócitos CD4+ e CD8+ que possuem TCRs Vβ5 e Vβ12 na periferia, sendo em alguns casos inclusive ausente. Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. *p<0,05; ***p<0,001; teste paramétrico t de
Avaliação do tipo de morte celular por citometria de fluxo
Células epiteliais tímicas (TECs)
Os subtipos de TECs foram primeiro selecionados dentre as células CD45- e depois quanto sua expressão de Ly51 e MHC de classe II, sendo que as células tímicas epiteliais medulares (mTEC) expressam Ly51-MHCII+ e as células tímicas epiteliais corticais (cTEC) por sua vez expressam Ly51+MHCII+ (Figura 6A). Uma maior porcentagem de células positivas para anexina-V e iodeto de propídio (em apoptose tardia) foi observada na subpopulação de mTECs provenientes de timos de animais infectados por 120 dias quando comparados ao grupo controle (Figura 6B). A porcentagem de apoptose da subpopulação cTEC não apresentou diferenças entre os grupos experimentais. Isso pode ser explicado pelo fato do órgão já estar bastante atrofiado, e a frequência de cTECs ser bem menor nos animais infectados como visto anteriormente.
Figura 6: Análise da morte celular de TECs por citometria de fluxo. 120dpi: animal infectado por 120 dias; Ct: animal controle. (A) Gráfico representativo da população de TECs encontrada nos grupos controle e infectados. (B) Gráficos representativos da marcação com anexina-V e iodeto de propídio dos subtipos de TECs do grupo controle e infectado. (C) % de TECs em apoptose. Observe a maior porcentagem de células anexina-V e iodeto de propídio positivas em mTECs nos grupos infectados quando comparado ao controle. Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. * p<0,05; teste paramétrico t de Student
Timócitos
Os timócitos foram separados conforme sua expressão dos co-receptores CD4 e CD8 para depois serem analisados quanto a marcação com anexina-V e iodeto de propídio (Figura 7A). A análise fenotípica dos timócitos duplo-positivos (DP), revelou uma porcentagem maior de células positivas para anexina-V no grupo
de animais infectados em relação ao controle, as demais subpopulações de timócitos não apresentaram diferenças significativas entre os grupos quanto a marcação com anexina-V e iodeto de propídio (Figura 7B e 7C).
Figura 7: Análise da morte celular de timócitos por citometria de fluxo. 120dpi: animal infectado por 120 dias; Ct: animal controle. (A) Gráfico representativo das subpopulações de timócitos encontrada nos grupos controle e infectados. (B) Gráficos representativos da marcação com anexina-V e iodeto de propídio das subpopulações de timócitos do grupo controle (Ct) e infectado (120dpi). (C) % de timócitos em apoptose. Observe, a maior porcentagem de células anexina-V positivas para as subpopulações de timócitos DP. Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. * p<0,05; teste paramétrico t de Student
Análise fenotípica de células dendríticas tímicas
A análise da expressão das moléculas de superfície das DCs tímicas, envolvidas na apresentação antigênica e na co-estimulação dos timócitos, revelou diferenças significativas no perfil fenotípico entre os grupos controle e infectado por 120 dias, assim como ocorre na fase precoce da infecção. As DCs tímicas foram
selecionadas das demais células do timo pela expressão positiva de CD11c e da molécula do complexo de histocompatibilidade de classe II (MHCII) (Figura 8A). Após serem separadas, foram analisadas quanto à intensidade da expressão das moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86 e do próprio MHC II, através das médias de intensidade de fluorescência (MFI) obtidas pela marcação dessas moléculas com anticorpos fluorescentes (Figura 8B). Observamos maiores médias de intensidade de fluorescência (MFI) nas DCs provenientes de timos de animais 120dpi, de forma semelhante ao encontrado na fase precoce da infecção (Figura 8C).
Figura 8: Análise das moléculas de superfície das células dendríticas tímicas por citometria de fluxo. 120dpi: animal infectado por 120 dias; Ct: animal controle. (A) Gráfico representativo da população de DCs tímicas encontrada nos grupos controle e infectados. (B) Histograma da intensidade de fluorescência das moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86 e do MHC de classe II. (C) Média da intensidade de fluorescência (MFI) de CD80, CD86 e MHCII. Aos 120 dias de infecção observa-se um aumento na expressão das moléculas CD80 e CD86 em comparação com o grupo controle. Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. * p<0,05; *** p≤0,001 teste paramétrico t de Student.
Análise da expressão gênica de caspases, e ativação do inflamassoma NLRP3 e da caspase-1.
A expressão gênica de caspases e atividade do inflamassoma NLRP3 também foi averiguada na fase tardia da infecção pelo Paracoccidioides brasiliensis.
Embora não tenham sido encontradas diferenças significativas na expressão gênica da caspase-3, o timo de animais infectados apresentou maior expressão de caspase-1 (inflamatória) e caspase-8 (iniciadora) comparado ao timo de animais saudáveis (Figura 9A). Sabendo que a caspase-1 está implicada com a liberação de citocinas pró-inflamatórias, mediada através da ativação por inflamassomas, nós também investigamos a expressão gênica de NLRP3, receptor do tipo NOD (do inglês, nucleotyde-binding oligomerization domain), relacionado à montagem do inflamassoma NLRP3, no timo de animais infectados e controle. A expressão gênica do receptor NLRP3 aumentou consideravelmente no timo de animais infectados (Figura 9A).
Em seguida quantificamos a atividade da caspase-1 no timo desses animais por immunoblotting, onde observamos aumento na densidade das bandas da caspase-1 ativa (p10) (Figura 9B). A normalização das densidades das bandas de caspase-1 ativa pelo controle de carga (GAPDH) confirmou a maior atividade dessa enzima nos animais infectados por 120 dias (Figura 9C).
Sabendo que a expressão gênica do receptor NLRP3 está aumentada nos animais infectados, investigamos se tal aumento estaria desencadeando a montagem do inflamassoma NLRP3. A densidade das bandas do NLRP3 de animais infectados de fato estava aumentada em relação aos animais controle (Figura 9D). A normalização das bandas de NLRP3 pelo controle de carga GAPDH
confirmou o resultado, o timo de animais infectados apresenta um aumento considerável na montagem do inflamassoma NLRP3 (Figura 9E).
Figura 9: Análise da expressão gênica de caspases, quantificação da atividade do inflamassoma NLRP3 e caspase-1 por western blott. 120dpi: timo de animais infectados por 120 dias; Ct: timo controle. (A) Expressão gênica das caspases 1; 3 e 8 e do inflamassoma NLRP3, tendo como controle endógeno o GAPDH. (B) Membrana de western blot para detecção de pro-caspase 1 e caspase-1 ativa, tendo como controle de carga GAPDH. (C) Razão da expressão proteica de pro- caspase 1 e caspase-1 ativa em relação à expressão de GAPDH (D) Membrana de western blot para detecção do inflamassoma NLRP3, tendo como controle de carga o GAPDH. (E) Razão da expressão proteica do NLRP3 em relação à expressão de GAPDH. Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. **p<0,01 e ****p<0,0001 teste paramétrico
Análise da expressão gênica e produção de citocinas no microambiente tímico A expressão gênica relativa de citocinas no timo foi averiguada por PCR em tempo real, observamos alterações significativas em todas as citocinas analisadas, com exceção a IL-4, IL-6 e TGF-β que não apresentaram diferenças entre os grupos. O aumento na expressão de IL-1β e IL-18 nos timos de animais infectados condiz com o aumento na atividade do inflamassoma e caspase-1, já que essas citocinas são o produto final da ativação desse complexo macromolecular (Figura 10A). A expressão gênica de IL-17, IFN-γ e TNF-α, citocinas pró-inflamatórias muito envolvidas nas respostas a fungos, também aumentou significativamente no timo dos animais infectados por 120 dias (Figura 10A).
A análise da produção intratímica de citocinas inflamatórias na fase tardia da infecção revelou uma manutenção do processo inflamatório iniciado na fase precoce, com aumento na produção de praticamente todas as citocinas analisadas no timo de animais infectados quando comparados ao controle, com exceção ao TGF-β que não apresentou diferenças entre os grupos. Uma observação interessante é que a produção de todas as citocinas analisadas aumentou no timo de animais controle da fase tardia (com 26 semanas de idade) em relação ao timo de animais controle da fase precoce (com 9 semanas de idade), com destaque para a produção intratímica de IL-1β e IL-18, onde a diferença é mais significativa. Este resultado corrobora o trabalho de (Youm et al., 2012), que mostra que a involução natural do timo pelo envelhecimento é devida, em boa parte, a ativação de NLRP3 no timo que leva a produção intratímica de IL-18 e, principalmente IL-1β, que induz as células tímicas a apoptose. Apesar do aumento considerável na produção intratímica de IL-1β e IL-18 nos animais controle da fase tardia em relação aos da fase precoce, a produção dessas citocinas em 120dpi é superior ao seu respectivo
controle e a todos os outros grupos analisados, mostrando o estabelecimento de um processo inflamatório crônico no timo desses animais na tentativa de erradicar o patógeno (Figura 10B).
A produção de TNF-α e IFN-γ também aumentou consideravelmente no timo de animais infectados em comparação com o controle, reforçando a ideia de que há um processo inflamatório no timo com a entrada do Pb, que é mantido e exacerbado conforme a infecção progride e o patógeno se dissemina (Figura 10B). A produção de IL-10 também aumentou no timo de animais infectados, porém de forma mais discreta quando comparada com as demais citocinas analisadas (Figura 10B).
Figura 10: Análise da expressão gênica e produção de citocinas intratímicas. 120dpi: timo de animais infectados por 120 dias; Ct: timo controle. (A) Expressão gênica de citocinas no microambiente tímico, tendo como controle endógeno o GAPDH. (B) A quantificação intratímica das citocinas pró-