Os efeitos das diferentes infecções no timo dependem do tipo de agente patogênico, a severidade da infecção e a habilidade do patógeno em infectar e persistir no microambiente tímico. A atrofia tímica aguda, desencadeada por infecções severas de rápida disseminação, é caracterizada por produção sistêmica de glicocorticoides e ou mediadores pró-inflamatórios que são capazes de desencadear aumento na taxa de apoptose dos timócitos, principalmente da subpopulação DP (Huldt et al., 1973, Martin & Bevan, 1997, Dooley & Liston, 2012). Tal efeito pode ocorrer mesmo sem a presença do patógeno no local.
A atrofia nessas situações pode ser exacerbada pela presença do patógeno no microambiente tímico, através da remodelação da matriz extracelular e da produção de fatores de virulência pelo patógeno ou pela infecção direta das células tímicas (Cotta-De-Almeida et al., 2003, Mendes-Da-Cruz et al., 2006, Schmitt et al., 2006). Essas alterações estruturais afetam a função tímica, particularmente a exportação de células T, podendo levar ao egresso de linfócitos T autoreativos para a periferia (Mendes-Da-Cruz et al., 2003, Nascimbeni et al., 2011, Menezes et al., 2012, Nunes-Alves et al., 2013). Apesar dos profundos efeitos desencadeados no timo pelas infecções agudas, o impacto dessa disfunção tímica na resposta imune é entendido como limitado e transitório, porque a população periférica de linfócitos T deve incluir células específicas para o patógeno e, após a atrofia inicial, a tendência é que o órgão se recupere parcialmente para manter sua função primária (Nunes- Alves et al., 2013).
A fase precoce da infecção pelo Pb é definida pelo período logo após o inóculo até a terceira semana de infecção, onde notamos o pico da atrofia após 7 dias de infecção (Brito et al., 2003). Apesar da atrofia, o timo parece recuperar suas características histológicas a partir de 7dpi. Portanto a fase precoce da infecção experimental pelo Pb representa as situações de atrofia aguda do timo. Assim, a observação de dois tempos de infecção, uma no pico da atrofia, observada em 7dpi, e outra duas semanas após o pico dessa atrofia (21dpi), torna-se necessária para um melhor entendimento do processo de involução tímica na PCM experimental durante a fase precoce da infecção.
Índice tímico e dosagem do cortisol
Para avaliar a influência da infecção por Paracoccidioides brasiliensis sobre o timo, camundongos BALB/c machos foram infectados com 5x106 leveduras por via intraperitoneal. Os animais foram mortos aos 7 e 21 dias após a infecção e o timo foi retirado e analisado quanto a seu peso e estrutura. Os resultados mostram que o peso relativo do timo de animais infectados com Paracoccidioides brasiliensis foi reduzido durante a infecção (Figura 1A). A perda da massa tímica foi significativa em ambos os tempos de infecção analisados quando comparada com timo de camundongos saudáveis.
O cortisol, hormônio corticosteroide, tem sido apontado como um dos responsáveis pela atrofia tímica aguda em situações de estresse físico ou químico como, por exemplo, má nutrição e tratamento com drogas quimioterápicas, assim como em infecções por bactérias gram-negativas, sendo liberado em resposta a ativação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) e cascatas de citocinas
2008). Para descartar a possibilidade de as alterações observadas no peso relativo do timo de animais infectados estarem associadas a um possível efeito de estresse, camundongos infectados e saudáveis tiveram seus níveis de cortisol sérico investigados. Os resultados obtidos mostram que em camundongos infectados e saudáveis não houve diferenças significativas com relação à produção de cortisol (Figura 1B).
Figura 1: Alteração do peso relativo do timo de camundongos BALB/c infectados, independe da produção de cortisol. Ct: animais controle; 7dpi: animal infectado por 7 dias; 21dpi: animal infectado por 21 dias. Camundongos BALB/c machos foram infectados com 5x106 leveduras de P. brasiliensis cepa Pb18. Os animais foram mortos aos 7 e 21 dias após a infecção e o timo foi retirado e analisado quanto a sua massa, enquanto que o sangue total foi coletado e o soro separado para dosagem do cortisol. A) Observa-se gradual perda de peso tímico em animais infectados por Pb18 quando comparado ao grupo controle (n=5). B) Não foram observadas diferenças na concentração do cortisol encontrado nos grupos controle e infectados em nenhum dos tempos experimentais analisados Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. ***p<0,001 e ****p<0,0001 teste paramétrico One-Way ANOVA.
Alterações na arquitetura tímica e detecção de fungos no timo de camundongos infectados
Análise histopatológica e detecção fúngica
A manutenção da estrutura do microambiente tímico é fundamental para o desenvolvimento dos linfócitos T. Os precursores de linfócitos T provenientes da medula óssea precisam transitar pelas regiões cortical e medular, onde recebem estímulos e sinais necessários para promover sua diferenciação em linfócitos T simples positivos, CD4+ e CD8+. Os eventos de seleção positiva e negativa também são dependentes da preservação da arquitetura tímica, para garantir a exportação de linfóticos T funcionais e tolerantes a antígenos próprios para a periferia do sistema imune (Takahama, 2006, Anderson et al., 2007, Ciofani & Zuniga-Pflucker, 2007, Petrie & Zuniga-Pflucker, 2007, Vicente et al., 2010).
A análise histopatológica dos timos de animais infectados por 7 dias mostrou alterações morfológicas em paralelo com a perda de peso do órgão. A presença de histiócitos ao redor de restos celulares, com aspecto de “céu estrelado”, bem como a perda da delimitação córtico-medular com aparente desorganização do tecido tímico foram observadas (Figura 2A e 2B).
As alterações morfológicas observadas nos animais infectados por 7 dias não foram mantidas nos animais infectados por 21 dias (Figura 2C). A partir de 21 dias de infecção nota-se que, embora tenha ocorrido redução do peso relativo do timo em relação aos controles, a estrutura do órgão parece ser recuperada, sendo possível observar a delimitação córtico-medular e as regiões histológicas córtex e medula com aspecto semelhante à estrutura histológica observada nos timos provenientes de animais controle (Figura 2A).
Sabendo que o timo é um órgão alvo para diversas infecções virais, bacterianas, por protozoários, helmínticas e fúngicas, que levam a atrofia do órgão acompanhada pela perda da delimitação córtico-medular e aparente perda da porção cortical do timo, o método de Grocott foi utilizado para investigar a presença do patógeno no órgão (Savino et al., 1986, Verinaud et al., 1998, Sodora et al., 2002, Cotta-De-Almeida et al., 2003, Seixas & Ostler, 2005, Savino, 2006). O método de Grocott permite evidenciar a presença de leveduras nos tecidos através da impregnação de prata na parede celular fúngica (Grocott, 1955, Luna, 1992).
A partir de 7 dias de infecção (Figura 2E) já é possível visualizar algumas leveduras no estroma tímico, e conforme a infecção progride aumentam o número de células fúngicas no órgão (Figura 2F).
Apesar de o patógeno ter sido encontrado a partir de 7 dias de infecção, e o número de leveduras aumentar conforme progride a infecção, ainda não são conhecidos os mecanismos pelos quais o Pb chega ao timo e provoca as alterações tímicas observadas nessa infecção.
Figura 2: Análises histológicas do timo. 7dpi: animal infectado por 7 dias; 21dpi: animal infectado por 21 dias; Ct: animal controle. (B) Observe a perda da delimitação cortico-medular no período referente ao 7dpi quando em comparação ao grupo controle “A”. (C) Recuperação da delimitação cortico- medular e da organização histológica do timo no período referente ao 21dpi. (E) e (F) Observe nas setas a presença de leveduras no estroma tímico. Painel da esquerda: coloração H&E;aumento de 100x; Painel da direita: coloração de Grocott;: aumento de 400x. Imagens representativas de três experimentos diferentes com n=5.
Alteração na distribuição da expressão de K8 e K14
Os subtipos de células epiteliais tímicas (TECs), corticais e medulares, possuem expressões distintas de citoqueratina, sendo que o principal subtipo cortical (cTECs) expressa citoqueratina 8 (K8), mas não citoqueratina 14 (K14), enquanto que o principal subtipo medular (mTECs) expressa K14, mas não K8. A contra coloração com o DAPI permite que possamos distinguir as regiões corticais e medulares baseado nas densidades celulares das mesmas, sendo a maior
densidade celular observada na região cortical e a menor densidade celular referente a região medular.
A análise por imunofluorescência da K14 e K8, realizada em cortes de timos de animais infectados por 7 dias, apresentou alterações quanto a distribuição da expressão dessas moléculas. Concomitante com a desorganização estrutural observada anteriormente por coloração H&E, a distribuição da expressão de K8 não se restringe às áreas de células epiteliais corticais, sendo encontrada praticamente em todo o órgão (Figura 3A e 3C). A distribuição da expressão de K14, por sua vez, se encontra restrita a uma possível região medular, mas em menor quantidade que a encontrada no controle (Figura 3B e 3D). Essas alterações fenotípicas observadas nas subpopulações de TECs, com expressão de moléculas restritas a um subtipo de TEC, como é o caso da expressão de K8 que deveria ser restrita à região cortical, estão de acordo com o encontrado na literatura em outros modelos de atrofia tímica por infecção, como por exemplo, na infecção pelo Trypanosoma cruzi e pelo Schistosoma mansoni (Wellhausen & Boros, 1982, Savino et al., 1989).
A localização da expressão de K8 e K14, após 21 dias de infecção, é semelhante ao observado nos cortes de timos controle, ficando restrita às suas respectivas regiões histológicas, corroborando os resultados anteriores, onde o timo de animais infectados por 21 dias apresenta uma recuperação histológica, ficando semelhante ao controle, apesar de não ocorrer recuperação do peso relativo (Figura 3E e 3F).
Figura 3: Análise da expressão de citoqueratina 8 e citoqueratina 14. 7dpi: animal infectado por 7 dias; 21dpi: animal infectado por 21 dias; Ct: animal controle. (C) Observe a expressão de K8 (referente a cTEC) bem espalhada pelo corte, não ficando restrita a região cortical como no Ct. (D) A expressão de K14 parece mais restrita a uma possível região medular, como no controle, porém em uma área menor. (E) e (F) A distribuição da expressão de K8 e K14 é normalizada, sendo possível definir nitidamente as regiões corticais e medulares como em (A) e (B). Painel da esquerda: Imunofluorescência para K8; Painel da direita: Imunofluorescência para K14: aumento de 100x. Imagens representativas de três experimentos diferentes com n=5.
Análise das subpopulações de timócitos por citometria de fluxo
A infecção com o Paracoccidioides brasiliensis levou a diversas alterações nas subpopulações celulares presentes no timo. As subpopulações de timócitos foram primeiro separadas quanto a sua expressão dos co-receptores CD4 e CD8, e analisadas quanto as frequências dessas subpopulações, onde não foram encontradas alterações significativas entre os grupos infectados e controle (Figura 4A). A partir da contagem em câmara hemocitométrica, as celularidades dos timos
foram aferidas, para computar os números absolutos das subpopulações de timócitos. Na fase precoce da infecção, durante o pico da atrofia tímica (7 dias de inoculo), foi observada uma diminuição significativa nos números absolutos das subpopulações de timócitos, com exceção para os timócitos duplo-negativos CD4- CD8- (DN), que não sofreram alterações significativas em todos os tempos de infecção observados (Figura 4B).
Com 21 dias de infecção as populações de timócitos CD4+ e CD8+ (simples- positivos, SP) e duplo-positivos CD4+CD8+ (DP), permanecem significativamente menor que o controle (Figura 4B).
Figura 4: Citometria de fluxo das subpopulações de timócitos. 7dpi: animal infectado por 7 dias; 21dpi: animal infectado por 21 dias; Ct: animal controle. (A) Gráfico representativo das porcentagens das subpopulações de timócitos. (B) Subpopulações de timócitos de animais controle e infectados em número absoluto. Aos 7 dias de infecção experimental, ocorre redução no número de timócitos simples-positivos CD4+ e CD8+ (SP) e duplo-positivos CD4+CD8+ (DP). Aos 21 dias de infecção o número dos timócitos DP e SP mantém-se significativamente menor que o controle. Não foram observadas alterações significativas entre os grupos infectados e controle na subpopulação de timócitos duplo-negativa CD4-CD8- (DN). Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. *p<0,05; **p<0,01; ****p<0,0001 teste paramétrico One-Way ANOVA.
Avaliação da frequência de células T portadoras de TCR Vβ5 e Vβ12 no baço A infecção com o Paracoccidioides brasiliensis induziu diversas alterações estruturais e celulares no timo. Sabendo do papel fundamental desse órgão no desenvolvimento dos linfócitos T, na manutenção à tolerância a antígenos próprios, investigamos se a função tímica estaria comprometida através da análise da
frequência de células T portadoras de TCRs “restritos” (que deveriam ter sido eliminados no processo de seleção negativa no timo), no baço de animais infectados e controle. As subpopulações de linfócitos T foram primeiro separadas quanto a sua expressão de CD3 e dos co-receptores CD4 e CD8, após, analisamos a frequência dos linfócitos T que expressavam TCRs Vβ5 e Vβ12 (Figura 5A). Aos 7 dias de infecção observamos aumento expressivo nas frequências de linfócitos T CD4+ e CD8+ que possuíam TCRs Vβ5 e Vβ12, restritos ao timo, nos baços desses animais quando comparados ao controle (Figura 5B).
Com 21 dias de infecção, observamos uma queda na frequência de linfócitos T CD4+ e CD8+ que possuem TCRs Vβ5 e Vβ12, ficando semelhante ao encontrado no controle, evidenciando uma recuperação da função tímica no que se refere ao processo de eliminação de clones possivelmente autoreativos (Figura 5B).
Figura 5: Citometria de fluxo para avaliar a frequência de linfócitos T Vβ5 e Vβ12 no baço. 7dpi: animal infectado por 7 dias; 21dpi: animal infectado por 21 dias; Ct: animal controle. (A) Gráfico representativo das porcentagens das subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+ expressando Vβ5 ou Vβ12. (B) Frequência de linfócitos T que expressam TCRs restritos ao timo de animais controle e infectados. Aos 7 dias de infecção experimental, ocorre aumento na frequência de linfócitos CD4+ e CD8+ que possuem TCRs Vβ5 e Vβ12 na periferia Aos 21 dias de infecção a frequência de linfócitos CD4+ e CD8+ que possuem TCRs Vβ5 e Vβ12 diminui ficando semelhante ao observado nos animais controle. Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. *p<0,05; **p<0,01; teste paramétrico One-Way ANOVA.
Avaliação do tipo de morte celular, por citometria de fluxo
A análise da presença de resíduos de fosfatidilserina (PS) na membrana plasmática da célula, que ocorrem nos estágios iniciais de apoptose, foi realizada por citometria de fluxo. Uma vez que alterações na membrana plasmática também ocorrem em células necróticas, a marcação dupla das células para anexina-V e
iodeto de propídio (PI), marcador de ácido nucléico impermeável à membrana, é essencial.
Análise em Células Epiteliais Tímicas (TECs)
A análise por citometria de fluxo da morte celular de células epiteliais tímicas (TEC) mostrou diferenças significativas entre os grupos controle e infectados. Os subtipos de TECs foram primeiramente selecionados dentre as células CD45- e depois quanto à expressão das moléculas Ly51 e MHC de classe II (MHCII). Células tímicas epiteliais medulares (mTEC) apresentam fenótipo Ly51-MHCII+ enquanto que as células tímicas epiteliais corticais (cTEC), são Ly51+MHCII+ (Figura 6A).
Uma maior porcentagem de células positivas para anexina-V (em apoptose), em ambos os subtipos de TECs, foi observada nos timos de animais infectados por 7 e 21 dias quando comparados ao grupo controle (Figura 6B e 6C). Sabendo do papel fundamental da arquitetura tímica e das células epiteliais tímicas (TECs) no desenvolvimento dos linfócitos T, a desorganização observada nos cortes histológicos somada ao aumento na porcentagem de células apoptóticas em ambos os subtipos de TECs, pode influir diretamente na resposta ao Pb na periferia (Alves et al. 2009, Auwaerter et al. 1996).
Figura 6: Análise da morte celular de TECs por citometria de fluxo. (A) Gráfico representativo da população de TECs encontrada nos grupos controle e infectados. (B) Gráficos representativos da marcação com anexina-V e iodeto de propídio dos subtipos de TECs do grupo controle e infectado. (C) % de TECs em apoptose. Observe a maior porcentagem de células anexina-V positivas em ambos os subtipos de TECs nos grupos infectados quando comparado ao controle. Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. * p<0,05; ** p≤0,01; teste paramétrico One-Way ANOVA.
Análise em Timócitos
A análise da morte celular dos timócitos provenientes de animais infectados com Pb, mostrou aumento considerável no número de células positivas para anexina-V. Os timócitos foram separados conforme sua expressão dos co- receptores CD4 e CD8 para depois serem analisados quanto a marcação com anexina-V e iodeto de propídio (Figura 7A). A análise fenotípica das diferentes subpopulações de timócitos revelou, com exceção à subpopulação de timócitos
em ambos os grupos infectados analisados (Pb7d e Pb21d) em relação ao controle (Figura 7B e 7C).
Figura 7: Análise da morte celular de timócitos por citometria de fluxo. (A) Gráfico representativo da população de timócitos encontrada nos grupos controle e infectados. (B) Gráficos representativos da marcação com anexina-V e iodeto de propídio das subpopulações de timócitos do grupo controle (Ct) e infectado (7dpi). (C) % de timócitos em apoptose. Observe, a maior porcentagem de células anexina-V positivas para as subpopulações de timócitos DP, CD4+ e CD8+, em ambos grupos infectados em relação ao controle,. Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. * p<0,05; ** p≤0,01; ***p<0,001 teste paramétrico One-Way ANOVA.
Análise fenotípica de células dendríticas tímicas
A análise da expressão das moléculas de superfície das DCs tímicas, envolvidas na apresentação antigênica e na co-estimulação dos timócitos, revelou diferenças significativas no perfil fenotípico entre os grupos controle e infectados. As DCs tímicas foram selecionadas das demais células do timo pela expressão positiva de CD11c e da molécula do complexo de histocompatibilidade de classe II (MHCII) (Figura 8A). Após serem separadas, foram analisadas quanto à intensidade da
expressão das moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86 e do próprio MHC II, através das médias de intensidade de fluorescência (MFI) obtidas pela marcação dessas moléculas com anticorpos fluorescentes (Figura 8B). Nos grupos infectados, a partir de 7dpi, foram observadas maiores médias de intensidade de fluorescência (MFI) do MHCII enquanto que o aumento em MFI de CD80 e CD86 só é significativo com 21 dias de infecção (Figura 8C).
A presença do patógeno no estroma tímico provavelmente está relacionada às alterações fenotípicas observadas, que sugerem um perfil mais ativado dessas células. As DCs tímicas podem fagocitar as leveduras do Pb, processar esses antígenos e apresentar aos timócitos como se fossem antígenos próprios.
O comprometimento da apresentação antigênica e a eliminação de linfócitos T reativos ao Pb pode levar à depressão da resposta imune celular ao Pb na periferia, frequentemente associada a disseminação da PCM (Teixeira et al., 1987). Outros mecanismos são apontados como responsáveis por essa imunodepressão como presença de células supressoras, resposta Th2 predominante e tropismo do fungo pelos órgãos linfoides (Jimenez-Finkel & Murphy, 1988, Franco et al., 1989, Benard et al., 1997).
Figura 8: Análise das moléculas de superfície das células dendríticas tímicas por citometria de fluxo. (A) Gráfico representativo da população de DCs tímicas encontrada nos grupos controle e infectados. (B) Histograma da intensidade de fluorescência das moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86 e do MHC de classe II. (C) Média da intensidade de fluorescência (MFI) de CD80, CD86 e MHCII. Aos 7 dias de infecção observa-se um aumento na expressão do MHCII em comparação com o grupo controle. Aos 21 dias de infecção a expressão de MHCII permanece maior que no grupo controle e é também observado aumento na expressão das moléculas CD80 e CD86 em comparação com o grupo controle, Os resultados são expressos como média ± erro padrão, de pelo menos, cinco animais. * p<0,05; ** p≤0,01 teste paramétrico One-Way ANOVA.
Análise da expressão gênica de caspases, e ativação do inflamassoma NLRP3 e da caspase-1
As caspases são conhecidas enzimas envolvidas em diversos aspectos da resposta imune, desde a clivagem de pro-IL-1 para sua forma ativa (pela caspase- 1), até a indução de apoptose, sendo a caspase-8 considerada iniciadora e a caspase-3 a executora do processo de morte celular (Mcilwain et al., 2013). Observamos que a expressão gênica de ambas as caspases 3 e 8, envolvidas no processo de morte celular, estavam aumentadas nos timos de animais infectados por 7 e 21 dias em comparação aos controles (Figura 9A). A ativação da pro- caspase-1 em caspase-1 ativa, composta pelo heterodímero das subunidades p10 e
p20, está associada a complexos citosólicos multiproteicos denominados inflamassomas. A caspase-1 ativa, por sua vez, leva a clivagem de pro-IL-1β em IL- 1β madura (Martinon et al., 2002, Martinon et al., 2009). A análise da expressão gênica tanto do receptor NLRP3, responsável pela oligomerização do inflamassoma NLRP3, quanto da sua caspase efetora, a caspase-1, apresentaram aumento nos timos de animais infectados de ambos os tempos analisados (Figura 9A).
A análise da expressão proteica da pro-caspase-1 e da caspase-1 ativa em relação ao GAPDH (controle endógeno), mostrou alterações significativas nos timos de animais infectados. Observamos um aumento na densidade das bandas