UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
THIAGO ALVES DA COSTA
INFLAMAÇÃO E MORTE CELULAR NA ATROFIA TÍMICA
INDUZIDA PELO PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS
INFLAMMATION AND CELL DEATH IN THYMIC DEMISE
INDUCED BY PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS
CAMPINAS 2016
INFLAMAÇÃO E MORTE CELULAR NA ATROFIA TÍMICA INDUZIDA
PELO PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS
INFLAMMATION AND CELL DEATH IN THYMIC DEMISE INDUCED
BY PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutor em Genética e Biologia Molecular, na área de Imunologia Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor in Genetics and Molecular Biology, in the area of Immunology
Orientadora: Profa. Dra Liana Maria Cardoso Verinaud
CAMPINAS 2016 ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO THIAGO ALVES DA COSTA E ORIENTADA PELA LIANA MARIA CARDOSO VERINAUD
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972 Alves da Costa, Thiago,
AL87i AlvInflamação e morte celular na atrofia tímica induzida pelo Paracoccidioides
brasiliensis / Thiago Alves da Costa. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
AlvOrientador: Liana Maria Cardoso Verinaud.
AlvTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Alv1. Paracoccidioidomicose. 2. Timo. 3. Atrofia tímica. 4. Paracoccidioides
brasiliensis. 5. Inflamação. I. Verinaud, Liana Maria Cardoso,1959-. II.
Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Inflammation and cell death in thymic demise induced by
Paracoccidioides brasiliensis Palavras-chave em inglês: Paracoccidioidomycosis Thymus Thymic atrophy Paracoccidioides brasiliensis Inflammation
Área de concentração: Imunologia
Titulação: Doutor em Genética e Biologia Molecular Banca examinadora:
Liana Maria Cardoso Verinaud [Orientador] Vânia Niéto Brito de Souza
James Venturini
Alessandro dos Santos Farias Elaine Conceição de Oliveira
Data de defesa: 04-10-2016
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Liana Maria Cardoso Verinaud Profa. Dra. Vânia Nieto Brito de Souza Prof. Dr. James Venturini
Prof. Dr. Alessandro dos Santos Farias Profa. Dra. Elaine Conceição de Oliveira
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
“Dizemos aos confusos, Conhece-te a ti mesmo, como se conhecer-se a si mesmo não fosse a quinta e mais dificultosa operação das aritméticas humanas, dizemos aos abúlicos, Querer é poder, como se as realidades bestiais do mundo não se divertissem a inverter todos os dias a posição relativa dos verbos, dizemos aos indecisos, Começar pelo princípio, como se esse princípio fosse a ponta sempre visível de um fio mal enrolado que bastasse puxar e ir puxando até chegarmos à outra ponta, a do fim, e como se, entre a primeira e a segunda, tivéssemos tido nas mãos uma linha lisa e contínua em que não havia sido preciso desfazer nós nem desenredar estrangulamentos, coisa impossível de acontecer na vida dos novelos e, se uma outra frase de efeito é permitida, nos novelos da vida.” (José Saramago)
Aos meus pais, irmãos e a tia Bia, pelo amor e compreensão que me acompanha sempre, por me amparar e fornecer os valores pessoais sobre os quais trilhei meu caminho, sem vocês nada seria possível.
À minha querida Marina, melhor parte que completa meu todo, toma o meu braço, minha dança, o meu passo e vagando em verso sigamos a caminhar, só o amor me ensina onde vou chegar, por onde for quero ser seu par.
À minha orientadora, Profa. Dra. Liana Maria Cardoso Verinaud, que possibilitou meu crescimento profissional, participando ativamente para garantir que eu tivesse a melhor formação possível sempre acreditando no meu potencial.
Aos meus queridos companheiros de laboratório, Ana Carolina Carvalho, Amanda Pires Bonfanti, Carolina Vazques, Ieda Geniseli Friol, Isadora Tassinari, Luidy Kazuo Issayama, Rodolfo Thomé e Rosária Di Gangi, pela ajuda e empenho nas etapas que permitiram a realização desse trabalho, pelas risadas compartilhadas que tornaram o dia a dia mais prazeroso, a amizade construída não há de perecer!
À Profa. Dra. Leonilda M. B. Santos e ao Prof. Dr. Alessandro dos Santos Farias pelo uso do citômetro e equipamento de PCR real time.
À Profa. Dagmar Stach-Machado, ao Prof. Dr. Marco Aurélio e à Profa. Dra. Patrícia Ucelli Simioni pelos conselhos e críticas mencionados na qualificação do meu doutorado.
Ao Prof. Dr. Marco Aurélio e a Profa. Dra. Vânia Niéto Brito pela discussão dos meus resultados apresentados no exame de pré-banca.
pessoal para realização de diferentes técnicas.
Aos professores do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional e do Departamento de Histologia por todos os auxílios técnico e teórico.
Ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, por contribuir com a infra-estrutura para a realização do meu trabalho, e à secretária Lourdes, pelo esclarecimento de dúvidas e problemas ao longo do caminho.
À CAPES e a FAPESP (Processo #12/22131-7) pelas bolsas de estudo de doutorado a mim concedidas.
À FAPESP (Processo #13/08194-9) pelo financiamento do projeto de pesquisa que possibilitou a execução desse trabalho.
Aos Profs. Drs. membros desta Banca de Doutorado pelo tempo dispensado e contribuição à qualidade do trabalho.
Resumo
O timo é o órgão linfoide primário responsável pela maturação e desenvolvimento dos linfócitos T, e para exercer tal função seu microambiente necessita estar preservado. Apesar de sua importância, o timo sofre involução tanto em condições fisiológicas, como no envelhecimento, quanto em condições patológicas, como durante infecções. Estudos de nosso laboratório têm demonstrado que a infecção experimental por Paracoccidioides brasiliensis, o agente causal da micose sistêmica de maior prevalência na América do Sul e Central – a paracoccidiodomicose, induz atrofia tímica. Neste estudo investigamos a participação dos mecanismos de morte celular e das vias inflamatórias na involução tímica em camundongos experimentalmente infectados com P. Brasiliensis. Observamos acentuada perda celular nos timos desses animais, tanto nas subpopulações de células epiteliais tímicas quantos nas subpopulações de timócitos. Tal perda celular resulta do aumento nas taxas de apoptose dessas células. A participação de mediadores de inflamação intratímica foi observada nesse processo, com aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias, destacando-se IL-1 na fase precoce da infeção e IFN- e TNF- na fase tardia. Além disso, observamos a ativação intratímica do inflamassoma NLRP3, complexo macromolecular envolvido na ativação de caspases inflamatórias. Coletivamente, nossos resultados mostram que o patógeno se mantém viável e se multiplica no microambiente tímico, causando desequilíbrio molecular que afeta as células presentes no estroma, tais alterações comprometem a função tímica com saída prematura de linfócitos na fase precoce e queda na exportação de tais células na fase tardia. Acreditamos que tais resultados podem contribuir para o entendimento da imunossupressão periférica observada na clínica da paracoccidioidomicose.
Abstract
The thymus is a primary lymphoid organ responsible for the maturation and development of T lymphocytes, to do this the thymic microenvironment needs to be preserved. Despite its importance, thymic involution occurs both in physiological conditions, as in aging, and in pathological conditions as seen in infections. Studies from our group have shown that experimental infection with Paracoccidioides brasiliensis, the causal agent of paracoccidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis on South and Central America, induces thymic atrophy. Here we investigated the participation of cell death mechanisms and inflammatory pathways on the thymic involution seen in P. brasiliensis experimentally infected mice. We observed marked cell loss on the thymus of those animals, in both thymic epithelial cells subpopulations and thymocytes subpopulations. This cell loss is due to the increase in apoptosis rates of these cells. The participation of intrathymic inflammatory mediators was observed in this process, with increased production of pro-inflammatory cytokines, highlighting IL-1at the early stage of infection and IFN- and TNF- in the late phase. In addition, we observed intrathymic activation of the inflammasome NLRP3, a macromolecular complex involved in the activation of inflammatory caspases. Collectively, our data show that the pathogen remains viable and is able to multiply in the thymic microenvironment, causing molecular imbalance that affects the cells present in the stroma, such alterations compromises thymic function leading to premature egress at the early stage of infection and reduction of thymic export on the late phase. We believe that these results can contribute to a better understanding of peripheral immunosuppersion observed in clinical paracoccidioidomycosis.
Abreviaturas
AIRE - regulador autoimune
Apaf-1 - fator-1 de ativação da apoptose APCs - Células apresentadoras de antígenos APC-Cy7 - aloficocianina 7
ASC - do inglês, apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD BHI - do inglês, brain heart infusion
BSA - Soro albumina bovina
CARD - domínio de recrutamento de caspase CD - do inglês, cluster of differentiation
cDNA - Ácido desoxirribonucleico complementar CEEA - Comissão de ética no uso de animais
CEMIB - Centro multidisciplinar para investigação biológica cTEC – células epiteliais tímicas corticais
DAMPs - Padrões moleculares associados a danos DAPI - 4',6-diamidino-2-fenilindol
dATP - Adenosina trifosfato DC - Células dendríticas DN - Duplo negativos DP - Duplo positivos E2 - 17-β-estradiol
FITC - isotiocianato de fluoresceína gp43 - Glicoproteína de 43 quilodaltons HE - Hematoxilina-eosina
HIV - Vírus da imunodeficiência humana IFN-γ - Interferon gama
iNOS - NO-sintase induzida LRR - repetições ricas em leucina
MHC - Complexo principal de histocompatibilidade mTEC - Células epiteliais tímicas medulares
NLR - receptores com domínio de ligação de nucleotídeos e oligomerização NBD - domínio central de ligação de nucleotídeos
PAMPs - Padrões moleculares associados a patógenos Pb - Paracoccidioides brasiliensis
Pb18 - Isolado altamente virulento do Paracoccidioides brasiliensis PBS - Solução salina tamponada com fosfato
PCM - Paracoccidioidomicose
PCR - Reação em cadeia da polimerase PE - do inglês, phycoerythrin
PE-Cy5 - PE cianina 5 PE-Cy7 - PE cianina 7
PERCP-Cy5.5 - clorofila peridinina-cianina 5.5 PI - Iodeto de propídio
RIPA - do inglês Radioimmunoprecipitation assay ROS - Espécies reativas de oxigênio
RT-qPCR - PCR quantitativo em tempo real
SBCAL - Sociedade brasileira para ciência de animais de laboratório SFB - Soro fetal bovino
SP - Simples positivo
SPF - Livre de patógenos específicos TBS - solução salina tamponada com Tris TCR - receptor de linfócitos T
Th1 - Linfócito T auxiliar 1 Th2 - Linfócito T auxiliar 2 Th17 - Linfócito T auxiliar 17 TLR - receptor do tipo toll
TNC - do inglês, thymic nurse cells TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa
TNFR-α - Receptor do fator de necrose tumoral alfa TRA - antígenos restritos a tecidos
Sumário
Introdução 17
1 O timo 17
1.1 O timo como órgão alvo de infecções 22
1.2 Paracoccidioides brasiliensis e PCM (paracoccidioidomicose) 26
1.3 Paracoccidioides brasiliensis 26 Paracoccidioidomicose (PCM) 28 O timo e a PCM 34 2 Objetivos 35 3 Materiais e métodos 36 3.1 Delineamento experimental 36 3.2 Animais 36 3.3 Fungo 37 3.3.1 Manutenção do isolado 37
3.3.2 Preparo da suspensão de infecção 37
3.4 Índice tímico 38
3.5 Dosagem sérica de cortisol 38
3.6 Análises histológicas do timo 38
3.6.1 Análise pelo método de Grocott 38
3.6.2 Análise histopatológica 38
3.6.3 Análise da distribuição da expressão de citoqueratina 8 (K8) e citoqueratina 14 (K14) por imunofluorescência
39
3.7 Análise de subpopulações celulares por citometria de fluxo 40 3.8 Avaliação do tipo de morte celular, por citometria de fluxo 41
3.8.1 Timócitos 41
3.9 Análise da atividade do inflamassoma NLRP3 43
Immunoblotting 44
3.10 PCR quantitativo em tempo real (qPCR) 45
3.10.1 Extração de RNA 45
3.10.2 Reações de Real Time PCR 45
3.11 Determinação dos níveis intratímicos de IL-1β, IL-10, IL-17 IL-18, IFN-γ, TNF-α, TGF-β por ELISA de captura
46
3.12 Análise estatística 47
4 Resultados e discussão Capítulos I e II- 48
Capítulo I - Alterações tímicas induzidas na fase precoce da infecção pelo Paracoccidioides brasiliensis
49
Índice tímico e dosagem do cortisol 50
Alterações na arquitetura tímica e detecção de fungos no timo de camundongos infectados
53
Análise histopatológica e detecção fúngica 53
Alteração na distribuição da expressão de K8 e K14 55 Análise das subpopulações de timócitos por citometria de fluxo 57 Avaliação da frequência de células T portadoras de TCR Vβ5 e
Vβ12 no baço
59
Avaliação do tipo de morte celular, por citometria de fluxo 61 Análise em Células Epiteliais Tímicas (TECs) 62
Análise em Timócitos 63
Análise fenotípica de células dendríticas tímicas 64 Análise da expressão gênica de caspases, e ativação do
inflamassoma NLRP3 e da caspase-1
66
Análise da expressão gênica e produção de citocinas no microambiente tímico
Discussão Capítulo I 71 Resultados Capítulo II - Alterações tímicas induzidas na fase tardia da infecção pelo Paracoccidioides brasiliensis
81
Índice tímico e dosagem do cortisol 83
Análise histopatológica e detecção fúngica 84
Alterações nas subpopulações celulares linfoides e não linfoides do timo na fase tardia da infecção
86
Células epiteliais tímicas 86
Timócitos 87
Avaliação da frequência de células T portadoras de TCR Vβ5 e Vβ12 no baço
89
Avaliação do tipo de morte celular por citometria de fluxo 91
Células epiteliais tímicas (TECs) 91
Timócitos 92
Análise fenotípica de células dendríticas tímicas 93 Análise da expressão gênica de caspases, e ativação do
inflamassoma NLRP3 e da caspase-1
95
Análise da expressão gênica e produção de citocinas no microambiente tímico
97
Análise da frequência de linfócitos T maduros e de linfócitos T produtores de citocinas no microambiente tímico
100 Discussão Capítulo II 102 5 Referências 108 6 Anexos 124 Trabalho em paralelo 124 Manuscrito - capítulo I 137 Manuscrito - capítulo II 146
Declaração CEUA 161
1. Introdução
1.1 O timo
A palavra timo vem da derivação do latim (thymus) da palavra grega thymos, que significa “excrecência carnosa”. Devido à palavra thymos também significar “alma” ou “espírito”, o timo foi mal interpretado pelos gregos antigos como a sede da alma (Jacobs et al., 1999). Cláudio Galeno, mais conhecido como Galeno de Pérgamo (século II), um proeminente médico, farmacêutico e filósofo romano, foi o primeiro a notar em suas investigações anatômicas em dissecções de macacos, que o timo era proporcionalmente maior durante a infância, quando cunhou o termo “órgão de mistério” ao se referir ao timo, termo que se manteve preciso por praticamente dois milênios (May, 1968, Nutton, 1973, Nishino et al., 2006). Foi somente na década de 60 que o papel do timo começou a ser esclarecido, por Miller, que percebeu através da timectomia de camundongos neonatos, a importância do timo no desenvolvimento da resposta imune (Miller, 1961).
Atualmente, os conhecimentos acerca do timo avançaram bastante, seu papel na resposta imune já está bem caracterizado, assim como boa parte da regulação fina que determina suas funções. Situado na porção superior do mediastino anterior, na frente do coração e atrás do esterno, o timo é o órgão linfoide primário responsável pela diferenciação, maturação e desenvolvimento dos linfócitos T. O órgão é constituído por dois lobos e envolto por uma cápsula de tecido conjuntivo de onde partem septos que o subdividem em diversos lóbulos (Nishino et al., 2006, Vicente et al., 2010). Histologicamente, observa-se que cada lóbulo é dividido em duas regiões principais: a região cortical, composta principalmente por linfócitos (ou timócitos, enquanto no timo) e por algumas células mesenquimais e epiteliais; e a região medular, composta por um maior número de
células epiteliais, células dendríticas (DCs, do inglês dendritic cells) tímicas e por um pequeno número de timócitos (Blackburn & Manley, 2004, Nishino et al., 2006). As células epiteliais tímicas (TECs), que podem ser corticais ou medulares, são os principais componentes não linfóides do timo e interagem com os timócitos afetando seu desenvolvimento. Interessantemente, esta interação também modula funcionalmente as TECs, influenciando na manutenção da funcionalidade do órgão (Ciofani & Zuniga-Pflucker, 2007, Jenkinson et al., 2008).
Um subtipo especial de célula epitelial no timo são as thymic nurse cells (TNC), ou células “nurse” do timo, primeiramente descritas na década de 80 por Wekerle e Ketelsen (Wekerle & Ketelsen, 1980, Wekerle et al., 1980). As TNC são células que expressam citoqueratinas como as demais células epiteliais, mas que são capazes de internalizar timócitos em vacúolos especializados como fagócitos (Pezzano et al., 2001). Localizadas no córtex, possuem papel fundamental no desenvolvimento dos timócitos, principalmente na restrição ao MHC próprio durante o processo da seleção positiva (Guyden et al., 2015).
Além das TNC localizadas no córtex, outra estrutura fundamental para o processo de educação dos timócitos foi descoberta na medula do órgão durante o século XIX. Tais estruturas formadas pelo agrupamento de células epiteliais tímicas na medula foram inicialmente identificadas e descritas por Hassal em 1849, sendo denominadas corpúsculos de Hassal (Hassall, 1849). Entre os papéis já descritos para os corpúsculos de Hassal estão a remoção de corpos apoptóticos de timócitos e a maturação dessas células (Blau, 1965, Senelar et al., 1976). Outros pesquisadores ainda, demonstram a participação dessas estruturas na produção de citocinas e fatores de crescimento fundamentais para o desenvolvimento dos timócitos, e inclusive na geração de células T reguladoras naturais através do
estímulo das DCs tímicas pela produção de linfopoietina estromal tímica (TSLP, do inglês thymic stromal lymphopoietin) (Le et al., 1991, He et al., 1995, Zaitseva et al., 2002).
O completo desenvolvimento dos timócitos depende da constante migração dos precursores hematopoiéticos através dos compartimentos tímicos que favorecem diferentes interações entre as células e outros componentes do microambiente tímico, resultando na expressão ou repressão de genes em estágios específicos. Esta migração é necessária para que os timócitos encontrem os sinais específicos para sua sobrevivência, proliferação, diferenciação e seleção da diversidade de repertório (Jamieson et al., 1999); e depende da interação dos timócitos com as células que compõe o microambiente tímico através da secreção de elementos de matriz extracelular, citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento (Savino et al., 2002). Neste sentido, a arquitetura tímica, com diferentes microambientes é essencial para a maturação e diferenciação de timócitos, uma vez que as subpopulações se localizam em nichos distintos no órgão, recebendo, portanto, sinais distintos em cada região (Lind et al., 2001, Ciofani & Zuniga-Pflucker, 2007).
O desenvolvimento dos linfócitos T é caracterizado pela progressão por diversos estágios fenotipicamente diferentes, definidos com base na expressão dos co-receptores CD4 e CD8, sendo eles duplo negativo (DN), duplo positivo (DP) e simples positivo (SP). O subtipo DN ainda é subdividido em outros quatro estágios (DN1-3 e DN4/pré-DP) através da expressão diferencial de CD44 e CD25 (Blackburn & Manley, 2004). Durante os diferentes estágios de desenvolvimento, os timócitos ocupam domínios espacialmente distintos e restritos, um indício de que a
diferenciação dessas células ocorre de forma concomitante a migração bem orquestrada (Prockop & Petrie, 2000, Lind et al., 2001).
Os precursores de linfócitos T advindos da medula óssea adentram o timo por capilares especializados, localizados na junção córtico-medular, e migram progressivamente para a zona subcapsular (mais externa do córtex) enquanto células DN, depois de volta para o córtex em direção a região medular já como células DP (Lind et al., 2001, Takahama, 2006). Nessa etapa, as células DN4/pré-DP passam pelo processo de recombinação V(D)J da cadeia do receptor de células T (TCR, do inglês T cell receptor), formando o complexo pré-TCR, seguido pela expressão dos co-receptores CD4 e CD8, se tornando células DP na região do córtex onde irão passar pelo primeiro evento de educação de repertório, o processo de seleção positiva (Dudley et al., 1994, Capone et al., 1998, Starr et al., 2003, Gameiro et al., 2010). O repertório das cadeias polipeptídicas do TCR, associado ao CD3 permite o reconhecimento de antígenos e a especificidade do TCRαβ depende do domínio variável (V) da cadeia β (Dudley et al., 1994).
O processo de seleção positiva é coordenado pelas cTECs que expressam moléculas de MHC ligadas a peptídeos, que serão apresentados aos timócitos DP, portadores de TCR funcional (Takahama et al., 2010, Takahama et al., 2012, Nitta & Suzuki, 2016).
Os timócitos DP que se ligarem com baixa afinidade à molécula de MHC próprio-peptídeo receberão estímulos para sobreviver, sendo selecionados para continuar seu processo de desenvolvimento. Após esse evento, os timócitos DP deixam de expressar um dos co-receptores (CD4 ou CD8) que não foi utilizado na ligação ao complexo MHC-peptídeo, se tornando timócitos SP. Essas células continuam sua migração em direção a medula do órgão, sob atração das
quimiocinas CCL19 e CCL21 produzidas pelas mTEC, onde irão passar pelo principal evento de seleção de repertório, a seleção negativa (Stein & Nombela-Arrieta, 2005, Forster et al., 2008).
O processo de seleção negativa tem a participação de DCs tímicas presentes na medula do órgão e principalmente das mTECs. As mTECs são responsáveis pela produção de peptídeos próprios encontrados na periferia do sistema imune, no contexto tímico, denominados antígenos restritos a tecidos (TRA, do inglês tissue restricted antigens) através da expressão do gene regulador autoimune (AIRE, do inglês autoimmune regulator), fundamental para o processo de tolerância central (Liston et al., 2003, Anderson & Su, 2011). Estudos conduzidos com camundongos BALB/c mostraram que os segmentos V5 e V12 são normalmente eliminados no processo de seleção negativa, recebendo a denominação de segmentos proibitivos, vários pesquisadores já associaram à presença desses segmentos em linfócitos T na periferia a eventos que levam a danos ao próprio (Chou et al., 1994, Hodes & Abe, 2001, Keesen et al., 2011, Menezes et al., 2012). Os timócitos que reconhecerem com alta afinidade os peptídeos próprios apresentados pelas DCs tímicas ou mTECs serão eliminados por apoptose, somente aqueles que não reconhecerem ou que se ligarem com baixa afinidade poderão egressar para a periferia como células T naive (Blackburn & Manley, 2004).
Assim como observado por Cláudio Galeno, o timo apresenta seu maior peso relativo ao nascimento, embora continue crescendo até a puberdade. Apesar de sua importância para o sistema imune, o timo sofre um processo de atrofia fisiológica a partir da puberdade, devido, provavelmente, à influência de inúmeros fatores, incluindo a produção de hormônios adrenais e sexuais, que levam a perda de volume do órgão e resultam em declínio na produção de células T
(Dominguez-Gerpe & Rey-Mendez, 1998, Savino et al., 2000, Dominguez-(Dominguez-Gerpe & Rey-Mendez, 2003).
Estudos recentes evidenciam que o inflamassoma NLRP3, um complexo macromolecular envolvido na ativação de caspases inflamatórias, está diretamente implicado na atrofia tímica fisiológica por envelhecimento (Youm et al., 2012). A expressão de mRNA do NLRP3 e IL-1β foi encontrada aumentada em células mielóides tímicas de camundongos envelhecidos, enquanto que o receptor de IL-1β foi principalmente expresso em frações enriquecidas de células epiteliais tímicas (Youm et al., 2012). Tais observações sugerem que a ativação do inflamassoma e produção de IL-1β por macrófagos ou células dendríticas no timo pode impactar negativamente a integridade do compartimento TEC (Youm et al., 2012).
1.2 O timo como órgão alvo de infecções
A atrofia tímica também tem sido demonstrada associada a doenças infecciosas. Diferentes agentes patogênicos, como vírus (HIV), bactérias (listeriose) e parasitas (Trypanosoma cruzi, Schistosoma mansoni) já foram descritos como indutores de atrofia (Wellhausen & Boros, 1982, Watson et al., 1983, Watson et al., 1984, Savino et al., 1986, Savino et al., 1989). As profundas modificações observadas em diversos elementos constituintes do microambiente tímico durante tais infecções levam a alterações na funcionalidade do timo e, consequentemente, no processo de maturação dos timócitos (Savino et al., 2004, Savino, 2006).
A atrofia tímica observada em condições de infecção pode estar relacionada com alterações nos componentes celulares (células epiteliais e timócitos), solúveis (quimiocinas e citocinas) e estruturais (elementos de matriz extracelular), com taxa
elevada de morte de timócitos e/ou com a migração prematura de timócitos imaturos para a periferia do sistema imune.
A elevada taxa de morte de timócitos, principalmente por apoptose, pode ser um dos fatores que levam à atrofia tímica. A célula entra em apoptose após receber sinais do meio extracelular (via extrínseca ou do receptor de morte) ou após o aparecimento de danos internos (via intrínseca, ou da mitocôndria) (Feig & Peter, 2007).
A via intrínseca é conhecida também por via da mitocôndria, ocorre com a liberação do citocromo c da região intermembrana para o citosol da mitocôndria onde, então, se liga ao fator-1 de ativação da apoptose (Apaf-1). A ligação de dATP (desoxiadenosina trifosfato) induz uma mudança conformacional do Apaf-1 que permite o recrutamento de pró-caspase-9 e sua ativação. O primeiro alvo da caspase 9 é a caspase 3 (Desagher & Martinou, 2000).
A via extrínseca da apoptose é ativada quando citocinas indutoras de morte como Fator de Necrose Tumoral-alpha (TNF-α), FasL/CD95-L/Apo1 e/ou o ligante indutor de apoptose relacionado com TNF (TRAIL) se ligam aos seus respectivos receptores TNFR1; CD95 (Fas;APO-1); TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5) expressos em células sensíveis à apoptose (Chicheportiche et al., 1997, Ashkenazi & Dixit, 1998, Peter & Krammer, 1998, Suliman et al., 2001, Rubio-Moscardo et al., 2005).
O TNF é uma importante citocina envolvida em processos inflamatórios, promovendo seus efeitos quando ligada aos seus receptores TNFR1 (p55) e TNFR2 (p75) (Chan et al., 2000, Chen & Goeddel, 2002). Durante infecções agudas, os níveis séricos desta citocina aumentam, podendo então atuar como uma potente indutora de apoptose de timócitos (Isogai et al., 1996). O mecanismo de indução de
apoptose parece envolver o TNFR1. A ativação desse receptor leva a associação do complexo à proteína adaptadora TRADD que, em reposta, liga-se ao FADD. A via apoptótica é desencadeada pela ativação das caspases, uma família de enzimas proteolíticas, que atuam no citoplasma e no núcleo (Ashkenazi & Dixit, 1998).
As citocinas pró-inflamatórias IL-1, IL-6 e TNF-α originadas de macrófagos e neutrófilos quando liberadas sistemicamente potencializam a atrofia tímica (Mastorakos & Ilias, 2006) e são encontradas em elevadas concentrações em camundongos infectados por Pb (Gonzalez et al., 2003). Nesse sentido, é possível supor que a infiltração e atividade de fagócitos inflamatórios no timo podem estar associadas com as profundas alterações observadas no órgão.
Além dos mecanismos de apoptose descritos, a resposta inflamatória também contribui com os mecanismos de morte celular, que podem levar a atrofia tímica. Assim, a presença do patógeno no timo de animais infectados por Pb, pode contribuir diretamente com o processo de involução do órgão. Os fagócitos, como macrófagos e DCs tímicas que constituem o estroma tímico, podem ser ativados através dos receptores de reconhecimento de padrões (PRRs do inglês, pattern recognition receptors), que são capazes de reconhecer estruturas moleculares associadas a patógenos (PAMPs do inglês, pathogen associated molecular patterns) e também associadas a danos celulares (DAMPs do inglês damage associated molecular patterns). Dentre os PRRs estão os receptores tipo Toll (TLRs) (Takeda & Akira, 2015), os receptores de lectina tipo C (Huysamen & Brown, 2009), receptores induzíveis por ácido retinóico (RIG)-1-like receptors (Yoneyama & Fujita, 2007) e, mais recentemente, receptores com domínio de ligação de nucleotídeos e oligomerização (NLRs) (Meylan et al., 2006, Davis et al., 2011).
Os NLRs são formados por três domínios, que em conjunto, estão implicados em interações proteína-proteína e de formação de redes. Dessa forma, muitos NLRs estão associados a grandes complexos macromoleculares, os inflamassomas, envolvidos na ativação de caspases inflamatórias, entre elas a caspase-1 (Davis et al., 2011). A caspase-1 é uma protease originalmente denominada enzima de conversão de IL-1β (Cerretti et al., 1992, Thornberry et al., 1992), e que atua essencialmente na regulação das respostas inflamatórias devido à sua capacidade de processar e ativar pro-IL-1β e pro-IL-18 (Ogura et al., 2006). IL-1β e IL-18 são potentes citocinas pró-inflamatórias, liberadas por diversas células durante processos infecciosos ou inflamatórios (Dinarello, 2002, 2005, Ogura et al., 2006). O NLRP3 é o inflamassoma mais amplamente estudado, cujo papel fisiológico está bem caracterizado, incluindo na atrofia tímica por envelhecimento (Davis et al., 2011, Youm et al., 2012).
O NLRP3 (também conhecido como NALP3 ou criopirina) é formado por um domínio de pirina N-terminal, um domínio central de ligação de nucleotídeos (NBD, do inglês, nucleotide binding domain) e um domínio C-terminal rico em leucina (LRR, do inglês, leucine reach repeat) (Hoffman et al., 2001). O NLRP3 não possui o domínio de recrutamento de caspase (CARD, do inglês Caspase Activation and Recruitment Domain) e por isso não consegue recrutar a procaspase-1, exceto na presença da molécula adaptadora ASC (do inglês, apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD). A expressão do NLRP3 ocorre em células mielóides, sendo positivamente regulada em resposta a reconhecimento de DAMPs, derivados de células e organelas danificadas, e também do reconhecimento pelos macrófagos, de estruturas compartilhadas por patógenos, os PAMPs (O'connor et al., 2003, Mariathasan et al., 2006, Duewell et al., 2010, Zhou et al., 2010).
Uma vez ativado pela interação com PAMPs ou DAMPS, o NLR orquestra a montagem do inflamassoma (Mariathasan et al., 2004, Sutterwala et al., 2006, Martinon et al., 2009). A ativação do inflamassoma induz a inflamação através da secreção de interleucina-1 beta (IL-1β) e interleucina-18 (IL-18), e também pode levar a morte celular inflamatória programada - piroptose (Davis et al., 2011).
1.3 Paracoccidioides brasiliensis e PCM (paracoccidioidomicose)
Paracoccidioides brasiliensis
O fungo Paracoccidioides brasiliensis (Pb) é o principal agente etiológico da paracoccidiodomicose (PCM), uma micose sistêmica crônica severa, mais frequente na América do Sul e México, antes denominada blastomicose sul-americana (Restrepo, 1985, Lacaz et al., 2002, Shikanai-Yasuda et al., 2006). O Pb é um fungo termodimórfico, que em tecidos e culturas à 37ºC, se apresenta sob a forma de levedura unicelular, enquanto que em temperaturas mais baixas (25ºC) cresce na forma de micélio filamentoso (Lacaz et al., 2002, San-Blas et al., 2002, Restrepo et al., 2008).
O nicho ecológico do fungo P. brasiliensis ainda não foi determinado (Restrepo et al., 2001). Acredita-se que o habitat natural do patógeno seja o solo ou as plantas das áreas em que a PCM é endêmica, onde vive como saprófita (Restrepo et al., 2008, Arantes et al., 2016). As dificuldades enfrentadas pelos estudos destinados a entender a ecologia e distribuição real do patógeno no meio ambiente estão centralizadas no fato de que a maioria dos isolados de Pb provêm de pacientes e não do ambiente, o que pode ser influenciado pela migração e pelo
longo período de incubação do patógeno no organismo, que pode ser superior a uma ou duas décadas (Shikanai-Yasuda et al., 2006, Arantes et al., 2016). A PCM é limitada geograficamente à região entre México e Argentina devido à sua relação direta com o clima, a maioria dos casos acontece em áreas tropicais ou subtropicais onde a temperatura varia de 17º-24ºC e a precipitação anual é de 500 a 2500mm, apresentando maior prevalência no Brasil, Colombia, Venezuela e Argentina (Brummer et al., 1993, Rivitti & Aoki, 1999, Barrozo et al., 2009, Barrozo et al., 2010, Bocca et al., 2013), ainda que alguns casos já tenham sido reportados em áreas não endêmicas, devido a viajantes e populações que emigraram dessas regiões (Buitrago et al., 2011).
Esse tipo de micose afeta principalmente homens na faixa etária de 30-60 anos que trabalham na agricultura, raramente é observada em crianças e jovens, quando não é tratada é quase sempre fatal (Brummer et al., 1993, Shikanai-Yasuda et al., 2006). As mulheres estão mais protegidas da doença, através da produção de estrógeno que atua em proteínas ligantes no citosol dos fungos, impedindo sua transformação de micélio em levedura (Stover et al., 1986, Shankar et al., 2011). Outros estudos mostraram que o hormônio feminino 17-β-estradiol (E2), em condições fisiológicas, levava a inibição do crescimento das células leveduriformes (Muchmore et al., 1974). Clemons e colaboradores (1989) mostraram que o tratamento de culturas de Pb com E2 modificava a expressão de proteínas durante a fase de transição micélio-levedura (Clemons et al., 1989). Assim o E2 através desses mecanismos pode interferir na patogenicidade do P. brasiliensis.
Paracoccidioidomicose (PCM)
A PCM é uma micose sistêmica que representa um grande problema para a saúde pública no Brasil, apresentando a maior taxa de mortalidade dentre as micoses sistêmicas, e a oitava causa de mortalidade dentre as doenças infecciosas crônicas, incluindo a leishimanioses, com taxas de até 4.39 mortes por 106 habitantes (Coutinho et al., 2002). Apesar de ser uma doença grave de importante caráter epidemiológico, sua notificação não é compulsória, prejudicando os dados sobre sua incidência e inclusive seu diagnóstico e tratamento em algumas regiões do país (Shikanai-Yasuda et al., 2006). Os micélios saprófitas do Paracoccidioides presentes no solo são mantidos viáveis pela presença de matéria orgânica em decomposição, que funciona como fonte de nutrientes no meio ambiente onde esse patógeno é endêmico (Silva-Vergara et al., 1998, Theodoro et al., 2005, Tercarioli et al., 2007). Os conídios produzidos por tais micélios são os responsáveis pela propagação da doença, cuja principal via de entrada é a aérea, onde a partir da chegada aos pulmões, os propágulos inalados se transformam em leveduras e estabelecem uma infecção primária (Brummer et al., 1993, San-Blas et al., 2002). A PCM inicia como uma pneumonia assintomática, podendo se disseminar para outros órgãos por meio da corrente sanguínea e ou vasos linfáticos, como a pele e a mucosa, o fígado, o baço, as glândulas adrenais, sistema nervoso central, entre outros, formando lesões graves, que comprometem a função desses tecidos, podendo o patógeno permanecer viável nestas até mesmo após o tratamento com antifúngicos (Brummer et al., 1993, Restrepo, 2000, Borges-Walmsley et al., 2002, Bocca et al., 2013).
As formas clínicas da PCM foram formalmente classificadas em Medellín, Colômbia, durante o Colóquio Internacional sobre Paracoccidioidomicose em 1986,
onde as relações entre o aspecto clínico, história natural e definições da doença foram estabelecidas (Franco et al., 1987). As infecções pelo Paracoccidioides spp. foram divididas em duas formas principais, a forma aguda/subaguda, também classificada como do tipo juvenil, que pode levar a uma doença clinicamente moderada ou grave, e a forma crônica ou do tipo adulta, cuja doença varia em decorrência do tipo de lesões ocasionadas pelo patógeno (unifocal ou multifocal) (Franco et al., 1987).
As duas formas de infecção se baseiam em quanto tempo a doença é estabelecida após a infecção inicial. Caso sua incidência ocorra logo após a primeira infecção, esta é considerada como do tipo aguda/subaguda, se os sinais clínicos surgirem após um longo período de latência, a doença é classificada na forma crônica. A localização do patógeno nos órgãos, o grau de severidade com base no estado geral e no estado nutricional do indivíduo, e a função dos órgãos atingidos são parâmetros também utilizados para classificar as formas clínicas da PCM (Bocca et al., 2013).
As manifestações clínicas da PCM são divididas em forma aguda/subaguda e forma crônica. A forma aguda é a menos frequente na clínica, acometendo aproximadamente 5% dos pacientes com PCM, usualmente crianças, adolescentes e adultos jovens, sendo também por essa razão denominada como do tipo juvenil, além de afetar homens e mulheres igualmente (Franco et al., 1987, Bocca et al., 2013, Martinez, 2015). As lesões na forma aguda são disseminadas rapidamente através do sistema linfático e sanguíneo, atingindo principalmente os linfonodos cervicais, axilares e inguinais, desencadeando considerável hiperplasia (Franco et al., 1987, Bocca et al., 2013). Além do envolvimento sistêmico dos linfonodos, hepatoesplenomegalia e disfunção da medula óssea são também observadas
(Franco et al., 1987). Inicialmente, as características clínicas remetem ao linfoma de Hodgkin, com nódulos firmes coalescentes, associados a febre vespertina (Marques et al., 2016). A evolução do quadro sem tratamento adequado faz com que tais linfonodos adquiram aspecto inflamado, formando abcessos e fístulas (Marques et al., 2016). As lesões também podem ocorrer na pele e nas mucosas, e em 50% dos casos o trato digestivo é afetado (Bocca et al., 2013).
O extenso envolvimento do sistema reticuloendotelial é uma característica observada na clínica da fase aguda. A resposta ao patógeno é predominantemente mediada por altos títulos de anticorpos específicos para o Pb, com alta produção dos isotipos IgA, IgG e também IgE, sendo que IgG4 e IgE são encontrados com maior frequência na clínica da forma aguda/subaguda (Baida et al., 1999, Mamoni et al., 2001). Anticorpos anti-idiotípicos também são uma característica da resposta ao Pb na forma aguda/subaguda, sendo detectados em grandes proporções nesses pacientes, onde se acredita inclusive que tenham papel na modulação da resposta imune (Souza et al., 2000).
A resposta imune celular é fundamental no controle da infecção pelo Pb, assim como em outras infecções por patógenos intracelulares. No entanto, existe uma dicotomia na PCM com relação as respostas humorais e celulares específicas, manifestada em altos títulos de anticorpos e falhas na resposta imune celular, com hipoproliferação de células T, sugerindo que respostas do tipo Th2 tenham participação na inabilidade do paciente em controlar a infecção (Benard et al., 1997, Cacere et al., 2008). Ainda, pacientes com a forma aguda/subaguda são incapazes de responder a mitógenos e aos testes intradérmicos, mostrando depressão nas respostas celulares (Oliveira et al., 2002, Benard, 2008).
A forma crônica é responsável por mais de 90% dos casos e geralmente ocorre em homens na faixa etária de 30-60 anos, que tenham trabalhado em áreas agrícolas (Bocca et al., 2013). A incidência da forma crônica é predominante em homens com uma prevalência de 10-15 casos para cada mulher diagnosticada (Shikanai-Yasuda, 2015). Caracteristicamente se desenvolve de forma lenta com evolução crônica de difícil detecção, apresentando severidade moderada a baixa, que pode resultar em sequelas em um terço dos casos (Bocca et al., 2013). A forma unifocal envolve apenas um órgão, enquanto a multifocal envolve disseminação da doença, todavia não é possível estabelecer que a forma multifocal é mais severa, já que as lesões unifocais podem ocorrer em órgãos do sistema nervoso central (SNC) ou em outros órgãos vitais, tornando maior a severidade da doença (Franco et al., 1987). Os principais órgãos afetados na forma crônica são os pulmões, seguidos pela pele e mucosas (Morejon et al., 2009).
A utilização de animais como modelos experimentais para o estudo da PCM tem sido relatada por diversos autores. Um dos primeiros relatos foi em 1927, quando Montenegro foi capaz de estabelecer uma infecção em cobaias através da via intratesticular, utilizando uma suspensão de tecidos infectados obtidos na clínica médica (Montenegro, 1927). Posteriormente vários estudos foram conduzidos com outras espécies de animais, permitindo o acompanhamento da infecção desde seus estágios iniciais, o que não é possível nos estudos realizados a partir de biópsias e necrópsias humanas. Em 1959, Mackinnon realizou a infecção de camundongos Swiss através da via broncoalveolar, entre outras, onde observou desenvolvimento de broncoalveolite e disseminação do patógeno pela circulação sanguínea (Mackinnon, 1959). Após, outros pesquisadores passaram a adotar a utilização de
camundongos para a infecção experimental com o Pb para investigar o papel da resposta imune (Linares & Friedman, 1972, Defaveri et al., 1982).
Porém, os primeiros estudos envolvendo camundongos isogênicos na infecção experimental pelo Pb só aconteceram em 1985, quando se determinou uma relação entre padrão de expressão gênica e susceptibilidade ao patógeno (Calich et al., 1985).
As linhagens de camundongos foram classificadas dentro de quatro grupos relacionados à suceptibilidade pela infecção com o P. brasiliensis: grupo muito resistente (DBA/2, A/J e A/Sn); grupo resistente (C3H/He); grupo intermediário (C3H,HeB, CBA, C57Bl/10 e BALB/c) e grupo muito sensível (B10.D2/nSn, B10.A e B10.D2/oSn) (Calich et al., 1985, Calich et al., 1994) Neste mesmo trabalho, foi demonstrado que as fêmeas de camundongos BALB/c e B10D2/nSn foram, significativamente, mais resistentes que os machos (Calich et al., 1985). Tais estudos foram baseados no tempo de sobrevivência dos camundongos infectados por via intraperitoneal com Pb18, isolado virulento de P. brasiliensis.
O estabelecimento e a disseminação da PCM dependem tanto de fatores ligados ao fungo, como a virulência e composição antigênica, quanto de fatores ligados à resposta imune do hospedeiro. As formas graves da doença estão frequentemente associadas com a imunossupressão das respostas imune celulares específicas, acompanhada por altos títulos de anticorpos, enquanto nas formas mais brandas da doença o que se observa é uma resposta celular bem preservada e baixos níveis de anticorpos específicos (Franco et al., 1989, De Oliveira et al., 2015).
Vários mecanismos foram propostos para explicar o comprometimento da resposta imune nesses pacientes. Campanelli e colaboradores (2003) mostraram
que leucócitos mononucleares isolados do sangue de pacientes com PCM apresentavam maior expressão de CD95L (FasL) e CD152 (CTLA-4) do que leucócitos isolados de indivíduos saudáveis, principalmente após a estimulação dessas células com antígenos do Pb. Ainda, mostraram que a maior expressão de FasL, leva ao aumento da apoptose mediado pela ligação Fas-FasL, e juntamente com a ligação do CTLA-4 às células apresentadoras de antígenos APCs, poderia explicar a ausência de resposta dos linfócitos T para antígenos da PCM (Campanelli et al., 2003). Recentemente nosso grupo demonstrou em camundongos infectados experimentalmente com Pb, que a transferência adotiva de DCs moduladas com extratos de leveduras de Pb confere proteção à PCM induzida por infecção experimental. Nesse trabalho mostramos que tais extratos promovem a ativação das DCs através do aumento da expressão de CD80 e CD86, além da maior produção da citocina IL-12p40. Ainda, tal modulação das DCs levou a uma diminuição da produção de citocinas do tipo Th2 (IL-4 e IL-10) por linfócitos T, principalmente CD8+ implicando estas no quadro de imunossupressão frequentemente observado nos pacientes com PCM (Alves da Costa et al., 2015).
Interessantemente, trabalhos anteriores de nosso laboratório mostram que a infecção experimental de camundongos BALB/c com o isolado altamente virulento, Pb18 é seguida por acometimento do timo, com perda de peso relativo do órgão (Brito et al., 2003),
1.4 O timo e a PCM
Tendo em vista que o P. brasiliensis apresenta um forte tropismo por tecidos linfoides, nosso laboratório tem estudado a ação deste fungo sobre o timo de camundongos infectados experimentalmente na tentativa de melhor compreender os mecanismos desencadeadores da supressão imunológica observada durante a infecção. Nossos dados indicam uma severa atrofia tímica, associada com profunda alteração estrutural e aumento nas taxas de morte celular de timócitos (Souto et al., 2003). Estudos subsequentes, também de nosso laboratório, mostraram profundas alterações na expressão de receptores de matriz extracelular, sugerindo comprometimento dos processos de adesão e sinalização dependentes da interação dos timócitos com componentes da matriz (Gameiro, 2009). A avaliação da frequência de subpopulações de timócitos em animais infectados com Paracoccidioides brasiliensis revelou o comprometimento de células duplo-positivas. Fato que está diretamente relacionado com alterações na expressão gênica de citocinas importantes na diferenciação deste subtipo celular, como, por exemplo, a interleucina IL-7 e o fator de crescimento e transformação TGF-β (Loyola, 2009).
Assim, consideramos pertinente dar continuidade aos estudos anteriores, ampliando nossa investigação sobre a(s) possível(is) causa(s) e consequência(s) desta atrofia para uma melhor compreensão do processo de imunossupressão observado neste tipo de micose e, desta forma, contribuir para um maior entendimento da dinâmica da doença.
2. Objetivos
Frente ao exposto na introdução, este projeto teve como objetivo geral analisar a inflamação e morte celular na atrofia tímica observada na fase precoce (7 e 21 dias) e fase tardia (120 dias) da infecção experimental de camundongos pelo Paracoccidioides brasiliensis.
Para isso os seguinte objetivos específicos foram propostos: (i) Avaliação da estrutura e função do timo
(ii) Análise dos mecanismos de morte celular envolvidos na atrofia (iii) Investigação das vias inflamatórias que contribuem na atrofia
3. Materiais e métodos
3.1 Delineamento experimental
As etapas para cumprimento dos objetivos deste trabalho estão esquematizadas abaixo.
3.2 Animais
Camundongos machos, da linhagem BALB/c, com 8 semanas de idade, foram obtidos do CEMIB-UNICAMP a partir de colônias livres de patógenos específicos (SPF). Os animais foram mantidos, durante todo o período experimental, em microisoladores acondicionados em racks ventiladas com água e ração estéreis, fornecidas em livre demanda, e com um ciclo de fotoperíodo de 12h/12h. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas propostas pela
Sociedade Brasileira para Ciência de Animais de Laboratório (SBCAL) e aprovados pelo Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto de Biologia da Unicamp, protocolo nº 2968-1 (CEUA/Unicamp).
3.3 Fungo
3.3.1 Manutenção do isolado
Foi utilizado o isolado virulento de P. brasiliensis, denominado Pb18, gentilmente cedido pela Profª Drª Vera L. G. Calich do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (USP). O isolado tem sido mantido, no laboratório, na fase leveduriforme em meio de cultivo Fava-Netto a 37ºC, sendo repicado a cada 7 dias. Para manutenção da virulência da cepa, a cada seis meses os fungos são inoculados em animais susceptíveis, recuperados do fígado e baço e semeados em meio BHI (do inglês, Brain Heart Infusion) suplementado.
3.3.2 Preparo da suspensão de infecção
Para o preparo da suspensão fúngica, a cepa de P. brasiliensis foi cultivada em meio de Fava Netto e coletada em sua fase de crescimento exponencial (após 7 dias de cultivo). As células fúngicas foram ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS, do inglês Phosphate buffered saline) estéril, pH 7.2, agitadas em agitador tipo vórtex, em dois ciclos de 15 segundos cada, centrifugadas por 10 minutos a 300 x g e lavadas por 2 vezes em PBS. O número total de células fúngicas presentes na suspensão foi determinado por contagem em câmara hemocitométrica e a suspensão final ajustada para 1x107 fungos/mL. A viabilidade fúngica foi determinada pelo teste de exclusão do corante azul de Trypan (Phillips, 1973). Os animais foram inoculados com 500µl da suspensão intraperitonealmente.
3.4 Índice tímico
Animais controle e infectados foram anestesiados com xilazina/quetamina (10mg/kg e 80 mg/Kg, respectivamente) e em seguida pesados. A seguir, os timos foram coletados, limpos e pesados. O índice tímico foi calculado a partir da seguinte equação: peso do órgão (g)/peso do animal (g)x100.
3.5 Dosagem sérica de cortisol
Animais controle e infectados foram anestesiados, sacrificados e o sangue total coletado para obtenção de soro. A concentração de cortisol no soro de ambos os grupos foi dosada através de kit de ELISA R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA).
3.6 Análises histológicas do timo
Os timos dos animais infectados e controle foram coletados e fixados em solução de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M por 16 horas a 4°C. Após a fixação, os órgãos foram desidratados em gradiente crescente de etanol (70, 80, 85, 90, 95-100%), diafanizados em xilol e incluídos em parafina. Os órgãos foram então submetidos à microtomia para obtenção de cortes histológicos com 5µm de espessura. Os cortes histológicos obtidos no micrótomo foram desparafinizados com xilol e hidratados em gradiente decrescente de etanol (100-95, 90, 85, 80, 70%), para as colorações de Grocott e hematoxilina-eosina (HE).
Os timos dos animais infectados e controle que seria utilizados para imunofluorescência foram coletados e congelados a -60°C em meio de criopreservação (OCT). Os cortes histológicos de 5 µm de espessura foram obtidos
no criostato e as lâminas contendo as secções foram fixadas em acetona (MERCK) e mantidas a -70º C até o momento do uso.
3.6.1 Análise pelo método de Grocott
A coloração pelo método de Grocott (específico para fungos) consiste na oxidação do tecido com Ácido crômico, impregnação pela prata-metenamina, remoção do excesso de prata com tiossulfato de sódio e contra coloração por hematoxilina de Harris (Grocott, 1955, Luna, 1992). As lâminas foram montadas e analisadas em microscópio de luz (Olympus, BX50).
3.6.2 Análise histopatológica
Após o processamento, as lâminas foram coradas com hematoxilina-eosina (HE) para análise de possíveis alterações estruturais. As lâminas foram montadas e analisadas em microscópio de luz (Olympus, BX50).
3.6.3 Análise da distribuição da expressão de citoqueratina 8 (K8) e citoqueratina 14 (K14) por imunofluorescência.
A marcação das moléculas de interesse foi realizada com anticorpos primários específicos (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) e amplificada através da marcação com anticorpo secundário conjugado à molécula do fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC do inglês, fluorescein isothiocyanate). A contra coloração dos cortes foi feita com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), um corante fluorescente, capaz de se ligar fortemente a regiões do DNA ricas em A-T. Controles negativos incluíram a reação completa com ausência do anticorpo primário. As lâminas foram analisadas ao microscópio de fluorescência
(Olympus BX61) equipado com lâmpada de mercúrio HBO de 100W e acoplado a uma câmera digital Olympus DP70 para captura de imagens.
3.7 Análise de subpopulações celulares por citometria de fluxo
Após sacrifício dos animais, os timos foram removidos e macerados individualmente, em PBS- Soro fetal bovino (SFB) 10% com auxílio de peneiras e êmbolos estéreis. A suspensão celular obtida passou por um cell strainer com poros de 100µm (BD, San Diego, CA, EUA) sendo depois centrifugada por 10 minutos a 300g a 4ºC, o sobrenadante foi descartado e o sedimento de células resultante foi ressuspenso em PBS-SFB 10%.
O número de células presentes na suspensão foi contado em câmara hemocitométrica e a concentração ajustada para 106 células/mL. A análise fenotípica da citometria de fluxo multi-cor foi realizada no citômetro Gallios (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, EUA) usando isotiocianato fluorescente (FITC), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), PE-cianina 5 Cy5), PE-cianina 7 (PE-Cy7), clorofila peridinina-cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5), APC-cianina 7 (APC-(PE-Cy7), como fluorocromos. Foram usados anticorpos produzidos em ratos: anti-CD3/PE-Cy7 (clone 145-2C11), anti-CD4/FITC (clone H129.19), anti-CD4/PECy5 (clone RM4-5), anti-CD44/PE (clone IM7), anti-MHC-II/PERCP-Cy5.5 (M5/114.15.2) (BD Pharmigen, CA, EUA), anti-CD8/APC (clone 53-6.7), anti-CD11c/APC (clone N418), anti-CD24/FITC (clone M1/69), anti-CD80/FITC (clone 16-10A1), anti-CD86/PE (clone GL-1), IFN-γ/PE (clone XMG1.2) and IL-17/FITC (clone eBIO17B7) (eBioscience, CA, EUA). As células foram incubadas com esses anticorpos por 20 minutos a 4º C. Em seguida as células foram lavadas com PBS, centrifugadas por 5 minutos a 300g e logo após fixadas com formaldeído 1% e submetidas à leitura no
equipamento. Para a detecção intracelular de citocinas, as células do timo foram estimuladas com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, 50 ng/mL) e ionomicina (500 ng/mL) na presença de Brefeldina A (1 ug/mL) (Sigma-Aldrich, MO, EUA) por 4 horas à 37ºC. Posteriormente, as células foram incubadas com os anticorpos para moléculas de superfície anti-CD4/PECy5 e anti-CD8/APC (clone 53-6.7) por 20 minutos à 4ºC e depois fixadas e permeabilizadas com o tampão de permeabilização/fixação da eBioscience (CA, USA). Os anticorpos específicos para citocinas IFN-γ/PE (clone XMG1.2) e IL-17/FITC (clone eBIO17B7) foram adicionados e as suspensões celulares incubadas a 4ºC por 30 minutos.
A análise dos dados foi feita após adquirir 10.000 eventos para cada amostra, utilizando o software FlowJo vX.0.7 (Tree Star Inc., Ashland, OR, EUA).
3.8 Avaliação do tipo de morte celular, por citometria de fluxo
A análise da condição celular (viável ou em processo de apoptose) foi realizada em grupo celular selecionado a partir das seguintes características: (i) tamanho (tamanho e granulosidade), (ii) integridade da membrana plasmática (coloração por iodeto de propídio, PI) e (iii) redistribuição da fosfatidilserina da membrana plasmática (marcação pela anexina-V).
3.8.1 Timócitos
Após sacrifício dos animais, os timos foram removidos e macerados individualmente, em PBS- Soro fetal bovino (SFB) 10% com auxílio de peneiras e êmbolos estéreis. A suspensão celular obtida passou por um cell strainer com poros de 100µm (BD, San Diego, CA, EUA) sendo depois centrifugada por 10 minutos a
300g a 4ºC, o sobrenadante foi descartado e o sedimento de células resultante foi ressuspenso em PBS-SFB 10%.
O número de células presentes na suspensão foi contado em câmara hemocitométrica e a concentração ajustada para 106 células/mL. As células foram incubadas com a seguinte mistura de anticorpos monoclonais: anti-CD3-PeCy7 (clone 145-2C11), anti-CD4-FITC (clone H129.19), anti-CD8-PerCP-Cy5.5 (clone 53-6.7) (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA.) por 20 minutos a 4º C. Em seguida, foram lavadas com PBS e centrifugadas por 10 minutos a 380xg. As células foram então ressuspensas em 20μl de Tampão de ligação da Anexina-V (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA Cat Nº556454) e incubadas com 0,3 mg/ml da anexina-V-APC e 5 mg/ml de iodeto de propídio (PI) por 15 min. Após a incubação, as amostras foram diluídas 4 vezes com o mesmo tampão e analisadas por citometria de fluxo utilizando o citometro de fluxo Gallios (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA). Como controle negativo, para todos os procedimentos de marcação de anexina-V, as células foram lavadas exaustivamente em PBS livre de Ca2+ e corados com anexina-V, na ausência do tampão. A análise dos dados foi realizada após adquirir 10.000 eventos para cada amostra, utilizando o software FlowJo vX.0.7 (Tree Star Inc., Ashland, OR, EUA).
3.8.2 Células epiteliais tímicas (TECs)
Após o sacrifício do camundongo, o timo foi coletado e os timócitos mais frouxamente aderidos ao estroma foram excluídos por meio de fluxo contínuo de PBS utilizando seringa. Posteriormente, o timo foi submetido a duas digestões enzimáticas distintas e sequenciais (i: PBS-SFB 5%, 0,125% de colagenase D e 0,1% DNAase; e ii: PBS-SFB 5% 0,125% de colagenase-dispase e 0,1%DNAase)
de 20 minutos a 37°C cada. As suspensões celulares foram incubadas com anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromos anti-CD45-PECy7 (clone 30-F11), anti-Ly51-FITC (clone FG35.4), anti-MHCII-PerCP-Cy5.5 (clone M5/114.15.2) (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA) por 20 minutos a 4º C. Após lavagem, as células foram ressuspensas em 20μl de Tampão de ligação da Anexina-V (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA Cat Nº556454) e incubadas com 0,3 mg/ml da anexina-V-APC e 5 mg/ml de iodeto de propídio (PI) por 15 min. Após a incubação, as amostras foram diluídas 4 vezes com o mesmo tampão e analisadas por citometria de fluxo utilizando o citometro de fluxo FACSCanto II (Becton Dickinson, San Diego, Califórnia, EUA). Como controle negativo, para todos os procedimentos de marcação de anexina-V, as células foram lavadas exaustivamente em PBS livre de Ca2+ e corados com anexina-V, na ausência do tampão. A análise dos dados obtidos foi realizada utilizando o software FlowJo vX.0.7 (Tree Star Inc., Ashland, OR, EUA).
3.9 Análise da atividade do inflamassoma NLRP3
A análise da atividade do inflamassoma foi realizada através da técnica de immunobloting para o complexo macromolecular NLRP3 e seu substrato, responsável por mediar suas funções a caspase-1.
Para tanto, os timos de animais controle e infectados foram assepticamente retirados e rotineiramente processados para extração de proteína. O produto da extração foi quantificado pelo método de Bradford e, uma vez ajustadas as concentrações, as amostras foram aplicadas em gel de SDS- poliacrilamida como descrito por (Laemmli, 1970). A separação foi feita utilizando-se o tampão de corrida
constituído de Tris (0,025 M), glicina (0,192 M) e SDS (0,1%), pH 8.3 em uma voltagem constante de 80 V, por aproximadamente 90 minutos.
Immunobloting
A técnica de immunobloting foi realizada conforme descrito por Towbin e colaboradores (1979) (Towbin et al., 1979). Após a eletroforese em SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose por 90 minutos a 250mA em uma câmara de transferência. O bloqueio de antígenos livres foi feito com soro albumina bovina (BSA, do inglês bovine serum albumin) por 1h. A membrana foi incubada overnight à temperatura ambiente com o anticorpo anti-caspase-1 de coelho anti-camundongo (sc514; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) diluído 1:500 em solução PBS-BSA 1%, ou com o anticorpo anti-NLRP3 de cabra anti-camundongo (ab4207; Abcam. CA, UK) diluído 1:500 em solução PBS-BSA 1%. A membrana foi lavada quatro vezes por 5 min em solução salina tamponada com Tris (TBS, do inglês tris buffered saline) TBS-Tween 20 0,01% e incubada por duas horas, com anticorpo secundário anti-IgG de coelho, ou com anticorpo secundário anti-IgG de cabra (sc2004 e sc2020 respectivamente; Santa Cruz Biotechnology, Inc., TX, EUA). Para revelação e observação foi utilizado o método de quimiluminescência aumentada (ECL, do inglês enhanced chemiluminescence) com Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Amersham, PA, EUA). Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (sc25778 HRP; Santa Cruz Biotechnology, Inc., TX, USA) foi utilizado como controle de carga tanto para o NLRP3 quanto para caspase-1. O software Image J (NIH, MD, EUA) foi utilizado para estimar a quantidade de pro-caspase-1, a forma ativa da caspase-1 e a montagem do inflamassoma NLRP3, através da razão com GAPDH.
3.10 PCR quantitativo em tempo real (qPCR)
3.10.1 Extração de RNA
A extração do RNA total foi realizada com o reagente Trizol, seguindo-se o protocolo recomendado pelo fabricante (Gibco BRL, USA). Brevemente, para cada amostra, em um tubo tipo “eppendorf”, foi adicionado o reagente Trizol (1 ml para 1 mg de tecido), sendo agitado por 30 segundos e deixados a temperatura ambiente por 5 minutos. Para cada 1 mL da suspensão foi adicionado 0,2 mL de clorofórmio (Sigma) e centrifugado a 13000 rpm por 15 minutos a 4ºC. A fase aquosa foi transferida para um tubo novo, ao qual foi adicionado o mesmo volume de isopropanol, sofrendo agitação e sendo incubado por 20 minutos a -20º C para precipitar o RNA da fase aquosa. Novamente os tubos foram centrifugados a 13000 rpm por 15 minutos a 4º C. O precipitado foi lavado em etanol 100%, sendo então seco a temperatura ambiente, com o tubo invertido sobre um papel de filtro. As amostras de RNA foram suspensas em 50µL de água deionizada e livre de RNAse, sendo então armazenadas a –70º C. Uma alíquota de 5µL foi utilizada para a obtenção da concentração de RNA/mL nas amostras, determinada usando o aparelho Nanodrop (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA).
3.10.2 Reações de Real Time PCR
Diferentes oligonucleotídeos e sondas foram utilizadas nos ensaios para a amplificação do controle endógeno, GAPDH, e dos alvos, a saber: IL-1β, IL-4, IL-6, IL-17, IL-18, IFNγ, TNFα, TGF-β caspase-1, caspase-3, caspase-8, NLRP3,
utilizando-se os sistemas TaqMan em um aparelho ABI Prism 7500fast (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Esses correspondem aos seguintes números de referência (Applied Biosystems): Mm99999915_g1, Mm00434228_m1, Mm00445259_m1, Mm00446190_m1, Mm00439619_m1, Mm00434226_m1, Mm00801778_m1, Mm00443258_m1, Mm01178820_m1, Mm00438023_m1, Mm01195085_m1, Mm00802247_m1 e Mm00840904_m1. Primers adequados para tais reações foram adquiridos. O DNA complementar sintetizado a partir do RNA mensageiro foi utilizado juntamente com reagente TaqMan Gene Expression Master Mix™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os resultados foram analisados com base no valor de CT (cicle threshold – ou ciclo limiar), sendo este o ponto correspondente ao número de ciclos aonde a amplificação atinge um dado limiar, que permite a análise quantitativa da expressão do fator avaliado. Os dados foram apresentados como níveis relativos de mRNA calculado pelo método delta Ct (2 -ΔΔCt). ΔCt (ΔCt = Ct do gene de interesse menos Ct do GAPDH).
3.11 Determinação dos níveis intratímicos de IL-1β, IL-10, IL-17 IL-18, IFN-γ,
TNF-α, TGF-β por ELISA de captura
Para determinação dos níveis intratímicos de citocinas, os timos de animais controle e infectados foram assepticamente retirados e macerados individualmente em tampão de extração de proteínas (RIPA, do inglês Radioimmunoprecipitation assay) (Millipore, CA, USA), com inibidor de proteases. O produto da extração foi quantificado pelo método de Bradford e, uma vez ajustadas as concentrações de proteína, foram utilizados 100μg de proteína total para o ensaio de ELISA de captura seguindo as recomendações do fabricante R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA).
