Peptídeos antimicrobianos e peptídeo imunomodulador P10
a. Identificar, selecionar e sintetizar peptídeos identificados em seqüências de proteínas expressas pelo patógeno P. brasiliensis isolado Pb01 (transcriptoma) e codificadas no genoma humano;
b. Investigar a atividade antifúngica in vitro dos peptídeos selecionados;
c. Formular e preparar sistemas de liberação sustentada com diferentes concentrações do peptídeo P10, em blenda polimérica de PLGA funcionalizada com o DMSA; d. Avaliar a eficácia da terapia do peptídeo P10 nanoestruturado combinado com a
droga sulfametoxazol/trimetropim no tratamento da PCM experimental murino;
e. Quantificar a produção de citocinas in situ (pulmão) dos animais infectados e submetidos à terapia combinada descrita acima.
IV. METODOLOGIA
Este tópico será subdividido em Parte I e Parte II. As metodologias comuns às duas partes (experimentos in vivo e preparação das nanopartículas) serão apresentadas em um único sub-tópico. O experimento denominado “Anfotericina B - PLGA-DMSA” foi realizado na Universidade de Brasília (UnB) e o denominado “Peptídeo P10 - PLGA-DMSA” foi realizado na Universidade de São Paulo (USP).
Experimentos in vivo 1. Infecção experimental 1.1. Animais
Anfotericina B - PLGA-DMSA
Foram utilizados camundongos fêmeas da linhagem BALB/c, com a média de idade entre 6 e 8 semanas. Os animais foram adquiridos do biotério da Universidade de São Paulo, Campus Ribeirão Preto - USP/RP e mantidos no alojamento de animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília – UnB.
Peptídeo P10 - PLGA-DMSA
Foram utilizados camundongos machos da linhagem BALB/c, com média de idade entre 6 e 8 semanas. Os animais foram adquiridos do biotério de camundongos isogênicos do Departamento de Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo - USP e mantidos no alojamento de animais de experimentação do Instituto de Ciências Biomédicas II.
Para os dois experimentos, os animais foram acomodados em gaiolas de polipropileno sob condições controladas de luminosidade com livre acesso a água e a comida. As técnicas utilizadas para infecção, manuseio durante os tratamentos e sacrifício dos animais foram seguidas de acordo com as normas éticas de manuseio de animais e aprovadas pelos Comitês de Ética da UnB e da USP.
1.2. Preparação do inóculo
Foi utilizado o isolado virulento Pb18 do fungo P. brasiliensis para ambas as infecções experimentais. A virulência do fungo é garantida pela manutenção mensal no laboratório de animais infectados com este isolado.
Anfotericina B - PLGA-DMSA
O isolado Pb18 foi cultivado em meio de cultura YPD (yeast 10g, dextrose 20g, peptona bacteriológica 20g, água destilada 1L) líquido a 36 ºC sob agitação (220rpm). A viabilidade celular foi determinada pelo corante verde-Janus 0.05% (Merck, Alemanha). Peptídeo P10 - PLGA-DMSA
O isolado Pb18 foi cultivado em meio de cultura líquido Mc Veigh & Morton (McVM) quimicamente definido, a 35 ºC sob agitação de 220 rpm (Restrepo & Arango, 1980). A viabilidade celular, entre 90 e 95%, foi determinada pelo uso do corante azul de Evans (Sigma, EUA).
Foram usados diferentes meios de cultura para a preparação do inóculo apenas em função da rotina de cada laboratório (UnB e USP). Após 5 dias de cultivo, todo o meio foi
centrifugado a 1000rpm durante 3 minutos. O fungo foi coletado e lavado duas vezes em solução salino-tamponada com fosfato (PBS; pH 7.4; NaCl 8g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.122g,
Na2HPO4.7H2O 1.716g, água destilada 1L) estéril. Depois da última lavagem, o sedimento
foi ressuspendido em volume de 3mL de PBS e as células foram contadas com auxílio de câmara de Neubauer.
1.3. Infecção endovenosa Anfotericina B - PLGA-DMSA
Foi preparada uma suspensão de 3×107 células viáveis/mL do isolado Pb18 em PBS estéril (pH 7.4). Os animais foram previamente anestesiados com solução de éter e inoculados com 100µL (3×106 células) da suspensão de leveduras pela via endovenosa do
plexo venoso retro-orbital.
1.4. Infecção intratraqueal Peptídeo P10 - PLGA-DMSA
Foi preparada uma suspensão de 6×106 células viáveis/mL do isolado Pb18 em PBS estéril (pH 7.4). Os animais foram previamente anestesiados por via intraperitoneal com 200µL de solução contendo 80mg/kg de ketamina (União Química, Brasil) e 10mg/kg de xilazina (União Química, Brasil). Depois de dez minutos, quando os animais estavam insensíveis a dor, seus pescoços foram hiperextendidos e uma pequena incisão na pele do pescoço foi realizada para a exposição da traquéia e, com o auxílio de uma seringa de 1mL, 50µL da suspensão de leveduras (3×105 células) foram injetados. Esta quantidade 10 vezes menor do que a usada na UnB foi devido ao local da infecção, onde o fungo é injetado diretamente nos pulmões. As incisões foram imediatamente suturadas e os animais foram mantidos aquecidos até passar o efeito da anestesia.
2. Grupos experimentais e tratamento 2.1. Grupos experimentais
Anfotericina B - PLGA-DMSA
Os camundongos infectados (n= 10 por grupo de tratamento) foram separados em grupos experimentais que receberam os seguintes tratamentos pela via intraperitoneal: (i) 100µL diários de PBS, (ii) 40µg/100µL diários de Fungizon®, (iii) 120µg/100µL a cada 3 dias de anfotericina B em blenda polimérica de PLGA-DMSA. O grupo controle composto de animais sadios, não infectados, recebeu 100µL diários de PBS. O experimento foi conduzido seguindo o desenho experimental da Figura 6.
O tratamento de todos os grupos foi iniciado 30 dias após os animais terem sido inoculados com o fungo Pb18 e duraram 30 e 60 dias. Nos dias 60 e 90 após o inóculo, metade do número de animais de cada grupo foi sacrificada em cada um destes pontos e foram realizadas análises para avaliar a evolução do tratamento.
Figura 6: Cronograma de tratamento para os camundongos infectados com P. brasiliensis por via endovenosa. Nano= anfotericina B em blenda polimérica de PLGA-DMSA; AmB= anfotericina B desoxicolato de sódio, Fungizon®.
Peptídeo P10 - PLGA-DMSA
Os animais foram randomicamente separados em nove grupos de 6 animais cada e submetidos a terapia com sulfametoxazol/trimetropim (15mg/kg e 3mg/kg respectivamente em PBS pH 7.4) combinado ou não com o peptídeo P10 formulado na blenda polimérica ou solubilizado com o adjuvante de Freund. Foram usados os seguintes grupos de tratamento: (i) controle, infectado e administrado com PBS; (ii) infectado e tratado apenas com
sulfametoxazol/trimetropim; (iii) infectado e tratado com sulfametoxazol/trimetropim e blenda de PLGA vazia; (iv) infectado e tratado com 20µg/50µL de P10 livre em adjuvante de Freund; (v) infectado e tratado com 1µg/50µL de P10 em blenda de PLGA; (vi) infectado e tratado com 5µg/50µL de P10 em blenda de PLGA; (vii) infectado e tratado com 10µg/50µL de P10 em blenda de PLGA; (viii) infectado e tratado com 20µg/50µL de P10 em blenda de PLGA; (ix) infectado e tratado com 40µg/50µL de P10 em blenda de PLGA. Os grupos de (iii) a (ix) receberam a terapia combinada com o sulfametoxazol/trimetropim.
O regime de tratamento foi iniciado 30 dias depois da infecção e seguiu durante 30 dias, conforme esquematizado na Figura 7. Os animais dos grupos (ii) ao (ix) receberam injeções diárias de sulfametoxazol/trimetropim, 15mg/kg e 3mg/kg, respectivamente. Os animais dos grupos (iv) ao (ix) receberam o peptídeo conforme descrito acima, administrado quatro vezes, uma dose por semana; na primeira semana o peptídeo foi injetado no coxim plantar e as e ultimas doses foram administradas intraperitonealmente.
Figura 7: Esquema de tratamento para os camundongos infectados com P. brasiliensis por via intratraqueal. Os animais foram submetidos a terapia combinada do sulfametoxazol/trimetropim com o peptídeo P10 em diferentes formulações.
2.2. Agentes antifúngicos
2.2.1. Anfotericina B desoxicolato de sódio
As doses da droga anfotericina B desoxicolato de sódio, produto comercial Fungizon®, contendo 45% de anfotericina B pura (Bristol-Meyers Squibb, EUA) foram
Dia 30 após infecção
Início do tratamento
-P10 nas diferentes formulações 4 doses, 1 por semana,
-15mg/Kg e 3mg/kg
sulfametoxazol/trimetropim - diário
Dia 60 após infecção Interrupção tratamento Sacrifício de 3 animais
Histopatológico CFU
Dosagem de citocinas
Dia 120 após infecção Sacrifício de 3 animais Histopatológico CFU Dosagem de citocinas Infecção Intratraqueal Camundongos BALB/c 3×105 células 06 machos por grupo
preparadas diariamente no momento da aplicação partindo-se de uma solução estoque de 5mg/mL. Esta solução foi mantida a 4 ºC no escuro e no momento do uso foram preparadas alíquotas contendo 40µg de Fungizon® em 100µL de PBS (pH 7,4).
2.2.2. Anfotericina B - PLGA-DMSA
A formulação da anfotericina B em blenda polimérica do PLGA-DMSA contendo 120µg de anfotericina B desoxicolato de sódio (45% de anfotericina B pura) (Sigma, EUA) em 100µL de nanopartículas, foi preparada pela equipe do professor Dr. Cláudio Tedesco da USP/RP. Para tanto foram utilizados os polímeros pré-formados dos ácidos poliláctico (PLA, 15 a 75%) e poliglicólico (PGA, 15 a 75%) e o ácido dimercaptosuccinico (DMSA, 0.05M), todos comprados da Sigma (EUA).
Os polímeros pré-formados foram primeiro dissolvidos em diclorometano com 50mg de PLA e 50mg de PGA (proporção 50:50). A esta solução orgânica foi adicionado poli-vinil álcool (PVA, 1%) e 120mg de anfotericina B com o aditivo DMSA. O material foi submetido à agitação vigorosa (10000rpm) para obter a emulsificação inicial água-óleo. O solvente orgânico foi removido da solução sob agitação a temperatura ambiente e evaporação sob pressão reduzida. As nanopartículas foram centrifugadas (25 ºC, 5000rpm) em intervalos de 10 minutos e lavadas três vezes em água destilada e ressuspendidas em 1.0mL de PBS estéril e armazenadas a 4 ºC. Imediatamente antes do uso, o frasco contendo a dose a ser injetada nos animais foi agitado vigorosamente, durante dois minutos, em vórtex, para ressuspender as nanopartículas. Todos os procedimentos foram realizados em condições estéreis. O processo de preparação descrito e a sua utilização estão protegidos pelo depósito da patente no Instituto Nacional de Propriedade Intelectual (INPI, Brasil) sob registro PI # 0700446-0.
2.2.3. Peptídeo P10 - PLGA-DMSA
As formulações contendo as quantidades de 1µg, 5µg, 10µg, 20µg ou 40µg do peptídeo P10 em 50µL de nanopartículas de PLGA-DMSA foram preparadas pela equipe do professor Dr. Cláudio Tedesco da USP/RP seguindo a mesma metodologia descrita no subitem anterior, modificando apenas a adição da anfotericina B pela adição das
quantidades do peptídeo P10 descritas acima. O processo de preparação descrito e a sua utilização estão protegidos pelo depósito da patente no INPI sob registro (aguardando o número do PI).
2.3. Determinação do tamanho dos sistemas poliméricos 2.3.1. Espectroscopia de correlação fotônica
A análise do tamanho foi realizada, na suspensão total e no sobrenadante de amostras de Nano-D-AMB (Anfotericina B - PLGA-DMSA) por espectroscopia de correlação fotônica em equipamento ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments, Reino Unido) do laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal de Goiânia, GO. O princípio de funcionamento deste equipamento baseia-se na aplicação de um campo elétrico na suspensão, induzindo a movimentação das partículas em direção ao eletrodo de carga oposta. Isto promove a passagem das partículas por um detector de tamanho (Malvern, 2004).
2.3.2. Microscopia óptica
Foram capturadas imagens em microscópio de luz óptico na amostra total e no sobrenadante. Uma gota de cada amostra foi pingada em lâminas e cobertas por lamínulas e imediatamente observadas no microscópio.
3. Acompanhamento da evolução do tratamento
Para ambos os experimentos (Anfotericina B - PLGA-DMSA e Peptídeo P10 - PLGA- DMSA) foi usada a mesma metodologia, variando apenas o tipo de antibiótico adicionado ao meio de cultura para a recuperação das unidades formadoras de colônia (CFU, do Inglês Colony Forming Units): na UnB foi usado 40mg/L de gentamicina (Schering-Plough, EUA) e na USP foram usados 10000UI/ml de penicilina (Cultilab, Brasil) e 10mg/ml de estreptomicina (Cultilab, Brasil), de acordo com a rotina de preparação de meios de cultura de cada laboratório.
A eficácia terapêutica do tratamento foi avaliada pela recuperação de fungos viáveis presentes nos pulmões (Anfotericina B - PLGA-DMSA) e pulmões, fígados e baços (Peptídeo P10 - PLGA-DMSA) dos animais infectados. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e os órgãos, após terem sido retiradas as amostras para o histopatológico, foram macerados com o auxílio de um homogeneizador de tecidos manual em PBS estéril (pH 7.4). O homogenato foi plaqueado em duplicata em placas de Petri contendo meio de cultura sólido Brain Heart Infusion (BHI, Acumedia®, EUA) suplementado com 4% (v/v) de soro de cavalo (Gibco, EUA), 5% (v/v) do sobrenadante filtrado da cultura do isolado Pb192 e 40mg/L de gentamicina (Schering-Plough, EUA). O filtrado foi preparado de acordo com metodologia descrita anteriormente (Singer-Vermes et al., 1992). As unidades formadoras de colônia (CFU, do Inglês Colony Forming Units) foram contadas no 14º dia após o plaqueamento dos macerados e incubação a 36 ºC. As diferenças entre as médias dos números de CFU’s entre os grupos experimentais foram analisadas pelos testes estatísticos Student’s t- test e ANOVA.
3.2. Histologia
Fragmentos dos pulmões e fígado (Anfotericina B - PLGA-DMSA) e pulmões, fígado e baço (Peptídeo P10 - PLGA-DMSA) dos animais foram fixados em solução de 10% de formol tamponado e preparados de acordo com as técnicas de rotina para embebição em parafina. Secções histológicas de 5µm de espessura foram coradas por hematoxilina e eosina e observadas em microscopia de luz.
4. Parâmetros clínicos
Em função da conhecida toxicidade causada pela anfotericina B, as análises toxicológicas foram realizadas apenas nos animais submetidos ao tratamento Anfotericina B - PLGA-DMSA.
4.1. Toxicidade
Para investigar os efeitos toxicológicos do sistema de liberação sustentada para a anfotericina B, os títulos séricos de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), creatinina e uréia foram dosados pelo método colorimétrico de Jaffé. Para tanto, o sangue de cada animal foi coletado e o soro foi separado por centrifugação e armazenado a -80 ºC até o momento das análises bioquímicas, que foram realizadas no laboratório Sabin de Brasília, DF.
4.2. Aparência física
Os animais foram observados diariamente para o monitoramento de possíveis alterações em suas aparências físicas. Seus pesos foram registrados antes do início dos tratamentos e imediatamente antes do sacrifício. Eles foram anestesiados levemente com dietil éter para serem pesados e fotografados.
4.3. Genotoxicidade e citotoxicidade
Os efeitos genotóxicos e citotóxicos do sistema sustentado para a anfotericina B foram acessados pelo ensaio de micronúcleo. Esta investigação hematológica é recomendada pelas agências regulatórias para testar novos agentes farmacêuticos (OECD, 1997). Após serem sacrificados, os fêmures dos animais foram dissecados e suas epífises foram cortadas para a exposição do canal da medula óssea. O material da medula óssea foi coletado pela lavagem com 1mL de soro fetal bovino (Gibco, EUA) e centrifugado por 5 minutos a 1000rpm. Foram preparados esfregaços com uma gota do material em duplicata para cada animal. As lâminas foram mantidas em cima da bancada durante 24 horas para secarem e evitar a perda das células durante a fixação do material com metanol (5min) e coradas com Giemsa:PBS (1:14) durante 8 min antes de serem lavadas. As lâminas foram avaliadas por microscopia de luz óptica para cada animal. O controle positivo (n= 6) recebeu 40mg/kg por via intraperitoneal de ciclofosfamida 24 horas antes do sacrifício. A seguinte fórmula foi usada para calcular a porcentagem de eritrócitos múltiplos (%PCE): %PCE=
[PCE/(PCE+NCE)]×100, onde PCE eritrócitos policromático e NCE eritrócitos normocromático. Para os testes de genotoxicidade, foi determinada a freqüência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos (MNPCE). Estes ensaios foram realizados em colaboração com a estudante de mestrado Danielle Guedes Peixoto.
Parte II
Peptídeos antimicrobianos e o imunomodulador P10
1.1. Seleção in silico e síntese química dos peptídeos antimicrobianos
As seqüências peptídicas foram selecionadas utilizando um programa computacional desenvolvido pela equipe do Dr. Carlos Bloch do Cenargen/Embrapa. Este programa tem como base a combinação de diversas características presentes nos peptídeos antimicrobianos descritos na literatura, tais como a presença de resíduos de aminoácidos de cargas positivas e de segmentos anfipáticos (comunicação pessoal). Os bancos de dados do transcriptoma do fungo Paracoccidioides brasiliensis (https://dna.biomol.unb.br/Pb/) e do genoma humano foram submetidos para análise utilizando este programa e foram identificadas treze seqüências peptídicas potencialmente antimicrobianas. Destas, quatro foram sintetizadas (10mg na forma bruta) com a extremidade carboxílica amidada, no departamento de Bioquímica da Universidade Federal de São Paulo, SP. Para preservar o sigilo das seqüências peptídicas (as mesmas estão sujeitas a serem patenteadas), os peptídeos foram identificados como P1, P2, P3 e P4.
1.2. Purificação dos peptídeos sintetizados
Para cada corrida da purificação, foram dissolvidas 2mg de cada peptídeo em 500µL de água destilada contendo ácido trifluoroacético 0,1% (Sigma, EUA). Esse material foi aplicado em uma coluna semi-preparativa C18 de fase reversa (5µm, 300Å) Vydac 218TP510 (Hesperia, EUA) em um sistema cromatográfico HPLC (Shimadzu Co., Japão) As frações foram eluídas em 60 minutos em um gradiente linear de água (solvente A) e acetonitrila (solvente B; JT Baker, México), ambos contendo 0,1% de ácido trifluoroacético.
O experimento foi monitorado nas absorbâncias de 216 e 280nm. Massas moleculares (em Da): P1= 1.756,12; P2= 1.918,20; P3= 1.612,92; P4= 1.697,03; KP= 998,47; Anfotericina B= 924,08.
2. Testes in vitro
2.1. Fungos e condições de crescimento
O fungo C. albicans, isolado clínico fornecido pelo Laboratório Sabin de Análises Clínicas de Brasília, DF, foi cultivado em placas de Petri contendo meio de cultura ágar Saboraud (Acumedia, EUA), durante 24 horas antes do início dos testes. O fungo P. brasiliensis isolado Pb18, da coleção de fungos do laboratório de Biologia Molecular da UnB, foi cultivado em meio de cultura BHI líquido (Merck, Alemanha) a 36 ºC em shaker rotatório (220rpm) por 5 dias. Para os ensaios in vitro, foram preparadas suspensões de células na concentração de 2×105 células viáveis/mL e foi utilizada 50µL por poço desta suspensão em
placas de microtitulação de 96 poços de fundo chato. 2.2. Testes in vitro
Foram utilizados dois diferentes protocolos para os testes dos peptídeos visando investigar a influência do período de incubação nos ensaios. O protocolo I foi usado para testar a atividade contra P. brasiliensis e C. albicans. O protocolo II foi usado apenas para o P. brasiliensis, pois o mesmo foi adaptado de outro experimento no qual foi testado um peptídeo, killer peptide (KP), por um período de incubação menor do que o usado no protocolo I para este fungo (Travassos et al., 2004).
Protocolo I: a concentração mínima inibitória (MIC, do Inglês Minimum Inhibitory
Concentration) foi determinada utilizando ensaios para testes de antifúngicos do NCCLS com modificações (M27-A - NCCLS, 1997). Os peptídeos P1, P2, P3 e P4 purificados foram dissolvidos em meio de cultura (Muller-Hinton para C. albicans e RPMI1640 para P. brasiliensis). Para cada peptídeo foram preparadas diluições seriadas em concentrações de 2 até 256µg/mL. Em cada poço de uma placa de 96 poços de fundo chato, foram acrescentados 50µL de cada uma das diluições para cada peptídeo e 50µL da suspensão
de células de C. albicans (2×104 células viáveis/mL) ou P. brasiliensis (2×105 células viáveis/mL). A quantidade menor (10 vezes) de células usadas para C. albicans do que para P. brasiliensis, deve-se ao rápido crescimento apresentado por este fungo. As placas foram incubadas a 36 ºC durante 24h para C. albicans e por 6 dias para P. brasiliensis. Após estes tempos, o MIC foi obtido pela leitura da absorbância a 595nm (equipamento Bio-Rad 450 Microplate Reader).
Protocolo II: os peptídeos P1, P2, P3 e P4 purificados foram dissolvidos em água MiliQ.
Para cada peptídeo foram feitas diluições em concentrações de 16 até 500µg/mL em PBS pH 7,2. Volumes de 100µL de cada uma das diluições foram acrescentadas em tubos do tipo eppendorf e adicionados 100µL da suspensão de 2×104 células viáveis do fungo. Os tubos foram incubados a 36 ºC em shacker rotatório (100rpm) durante 12 horas. Após este período, 100µL de cada diluição foram plaqueadas em placas de Petri contendo meio de cultura sólido Brain Heart Infusion (BHI, Acumedia®, EUA) suplementado com 4% (v/v) de
soro de cavalo (Gibco, EUA), 5% (v/v) do sobrenadante filtrado da cultura do isolado Pb192 e 40mg/L de gentamicina (Schering-Plough, EUA). O filtrado foi preparado de acordo com metodologia descrita anteriormente (Singer-Vermes et al., 1992). O crescimento das unidades formadoras de colônia foi observado durante 21 dias. Para o controle do experimento em ambos os protocolos foi utilizada a droga anfotericina B (Sigma-Aldrich, EUA) nas concentrações que variaram de 2 até 256µg/mL. Para o protocolo II foi usado o peptídeo KP como controle.
Peptídeo P10 - PLGA-DMSA 3. Síntese do peptídeo P10
A síntese química e a purificação do peptídeo P10, cuja seqüência peptídica é Q-T- L-I-A-I-H-T-L-A-I-R-Y-A-N (glutamina – treonina – leucina – isoleucina – alanina – isoleucina – histidina – treonina – leucina – alanina – isoleucina – arginina – tirosina – alanina - asparagina), foi realizada no departamento de Bioquímica da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), SP. Foi utilizada a tecnologia de fase sólida usando 9-
fluorenimetoxicarbonil (Fmoc) em um sintetizador automático PSSM8 (Shimadzu, Tóquio, Japão) como descrito por Taborda et al., (1998).
4. Dosagens das citocinas pela técnica de ELISA
Para investigar a produção de citocinas, os níveis de interferon-gama (IFN- ), interleucinas- 4 (IL-4), 10 (IL-10) e 12 (IL-12) foram quantificados nos pulmões. Frações dos pulmões foram assepticamente removidas, pesadas e homogeneizadas em PBS estéril (pH 7.4) com inibidor de protease (Roche, EUA). As citocinas foram determinadas usando kits comerciais e as suas respectivas recomendações (BD Biosciences – Pharmigen, EUA).
5. Análise estatística
As análises estatísticas de todos os experimentos foram realizadas usando o Statistical Package for Social Sciences (SPSS) versão 15. Todos os resultados estão expressos como média ± desvio padrão da média. A análise de variância (ANOVA) com o pós-teste de Tukey foram usados para testar as diferenças intergrupos na recuperação da carga fúngica, os dados bioquímicos, os testes de micronúcleos e as alterações no peso. Diferenças entre os grupos pareados foram analisadas pelo teste Man-Whitney. Os dados foram considerados significativos quando p< 0,05.
V. RESULTADOS Parte I
Anfotericina B - PLGA-DMSA
A eficácia terapêutica da formulação nanoestruturada Anfotericina B - PLGA-DMSA (Nano-D-AMB) foi investigada usando o modelo experimental murino crônico da PCM. Para isto, camundongos BALB/c foram infectados com o fungo P. brasiliensis e, após 30 dias da infecção, foram submetidos ao tratamento com Nano-D-AMB. Os experimentos in vivo foram