Perfil de expressão do ncSLC44A2 em células mononucleares de

Não houve diferença de expressão do ncSLC44A2 entre os grupos analisados (Figura 27 e 28) (P=NS).

ncSLC44A2

P=0,45

Figura 27. Perfil de expressão do ncSLC44A2 em pacientes com LMC responsivos versus (vs.) resistentes ao tratamento com dasatinibe. Análise estatística realizada pelo teste t não paramétrico de Mann-Whitney considerando P<0,05 como significativo.

ncSLC44A2

Doadores normais (n=13) LMC pós dasatinibe (n=39) LMC ao diagnóstico (n=9) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 P=0,28 U .A .

Figura 28. Perfil de expressão do ncSLC44A2 em doadores saudáveis versus (vs.) pacientes com LMC tratados com dasatinibe versus (vs.) pacientes com LMC ao diagnóstico. Análise estatística realizada pelo teste ANOVA não paramétrico de Kruskal-Wallis comparando todos os pares de coluna considerando P<0,05 como significativo.

5. DISCUSSÃO

A introdução dos inibidores de tirosina quinase (TKIs) no tratamento da LMC mudou drasticamente o prognóstico dos pacientes com LMC9_{. Porém, os}

TKIs não erradicam todas as células leucêmicas e alguns pacientes podem desenvolver intolerância e/ou resistência ao TKI utilizado. Dessa forma, é imprescindível que os pacientes com LMC sejam monitorados quanto a obtenção de respostas hematológica, citogenética e molecular15_.

O monitoramento molecular permite identificar os pacientes que obterão estabilidade a longo prazo, com manutenção de respostas moleculares profundas, e também os casos com resposta inadequada, que pode estar relacionada com resistência ou má adesão25_.

Além disso, vários estudos mostraram que a redução precoce dos níveis de transcritos BCR-ABL1 (< 10% aos 3 meses) tem significância prognóstica e é preditiva de maior sobrevida livre de progressão e de eventos a longo prazo em pacientes tratados com TKIs em primeira ou segunda linha. Alguns deles mostraram que apenas uma análise aos 3 meses é suficiente para predizer respostas20,21,26,27,83–86.

Entretanto, ainda é controverso se uma única avaliação do BCR-ABL1 é suficiente para definir o prognóstico e indicar uma troca de terapia. Um trabalho recente mostrou que respostas moleculares aos 3 e 6 meses são complementares e preditivas de resultados clínicos a longo prazo em pacientes com LMC em FC tratados com inibidores de segunda linha após falha com IM28_.

Nossos resultados confirmam que que avaliação dos níveis de transcritos BCR-ABL1 aos 3 e 6 meses em pacientes com LMC em FC em segunda linha de terapia com nilotinibe ou dasatinibe pode identificar pacientes com pior prognóstico. Além disso, a avaliação combinada em dois tempos mostrou-se mais eficaz para predizer respostas a longo prazo.

A SG, SLP e SLE foram significativamente inferiores nos pacientes com níveis de transcritos BCR-ABL1 > 10% e 1-10% aos 3 meses em relação aos pacientes com RQ-PCR<1%. Os mesmos resultados foram encontrados quando

analisamos a SG, SLP e SLE de pacientes com níveis de transcritos BCR-ABL1 aos 6 meses. Os pacientes com transcritos >10% e 1-10% apresentaram sobrevidas inferiores.

A análise combinada do RQ-PCRs aos 3 e 6 meses, mostrou que pacientes com RQ-PCR <10% aos 3 meses e < 1% aos 6 meses tiveram SLP e SLE superiores aos outros grupos de pacientes. Pacientes com RQ-PCR > 10% aos 3 meses e > 1% aos 6 meses tiveram resultados a longo prazo inferiores. Por outro lado, pacientes com transcritos BCR-ABL1 < 10% aos 3 meses mas que não alcançaram <1% aos 6 meses também tiveram SLP e SLE inferiores em relação aos pacientes que obtiveram essas respostas aos 3 e aos 6 meses, mostrando assim, a importância da análise aos 6 meses como complementar.

Boquimpani et al.28 _{tiveram achados similares. Nesse trabalho os autores}

mostraram que pacientes que alcançaram resultados ótimos aos 3 meses e 6 meses tiveram sobrevida livre de falha (SLF) em 3 anos de 85%. Entretanto, pacientes que não alcançaram respostas ótimas nessas avaliações, tiveram SLF em 3 anos de 20%.

Adicionalmente, os autores mostraram que aproximadamente 17% dos pacientes com RQ-PCR > 10% aos 3 meses alcançaram RQ-PCR <1% aos 6 meses, e a SLF em 3 anos desses pacientes foi de 50%. A importância da avaliação posterior aos 6 meses foi demonstrada por esses autores, pois os casos que alcançaram RQ-PCR <10% aos 3 meses e na avaliação dos 6 meses PCR >1%, tiveram uma SLF em 3 anos de apenas 38%. No nosso estudo, todos os pacientes com RQ-PCR >10% aos 3 meses apresentaram RQ-PCR >1% aos 6 meses.

Nossos resultados são consistentes com Giles et al.87_{, que demonstraram}

que alcançar BCR-ABL1 ≤ 10% aos 3 meses e ≤ 1% aos 6 meses é preditivo de respostas a longo prazo favoráveis em pacientes com LMC em FC tratados com nilotinibe após falha com imatinibe. As taxas de SLP foram de 85%, 67% e 42% em pacientes com níveis de transcritos BCR-ABL1 ≤1%, >1 a 10% e > 10% aos 3 meses; e 86%, 58% e 39% em pacientes com níveis de transcritos BCR-ABL1 ≤1%, >1 a 10% e > 10% aos 6 meses.

Milojkovic et al.21 _{analisaram 119 pacientes com LMC em FC resistentes ao}

imatinibe tratados em segunda linha com dasatinibe, nilotinibe ou bosutinibe. Os autores descreveram que pacientes com taxas de BCR-ABL/ABL ≤ 10% aos 3 meses obtiveram taxas de SG (91,3% vs. 72,1%, P=0,02), SLP (91,0% vs. 67,9%, p=0,07) e SLE (49,3% vs. 13%, p<0,001) em 4 anos significativamente superiores em comparação com pacientes com RQ-PCR > 10%. Na análise dos 6 meses, os pacientes com taxas de BCR-ABL/ABL ≤ 1% tiveram SLE (58,5% vs 18,3%, p<0,001) superiores aos pacientes que não alcançaram essa resposta.

Nossos dados também estão de acordo com as recomendações do European LeukemiaNet15_{, onde níveis de transcritos BCR-ABL1 >10% aos 6}

meses é considerado como critério para falha ao 2º TKI. Na nossa análise, apenas um teste molecular aos 3 meses não foi suficiente para discriminar o grupo com pior evolução, o que poderia implicar em uma mudança no tratamento nesse momento.

Nesse trabalho também observamos resultados semelhantes a de outros estudos, que respostas e resultados após tratamento com TKI de segunda geração são melhores em pacientes na FC do que nas fases mais avançadas da doença 88–92.

A frequência de mutações encontradas nos casos resistentes também corroborou dados de outros estudos51,93–95. Mutações do BCR—ABL foram encontradas em 30,5% dos casos. Três mutações foram detectadas antes do início do 2º TKI, enquanto que 9 foram encontradas durante o tratamento com o 2º TKI, incluindo a T315I, detectada em 5 pacientes, a qual confere resistência ao tratamento com inibidores de tirosina quinase de primeira e segunda linha53,54_.

Em relação à duração do tratamento em segunda linha, 31/71 pacientes (43%) descontinuaram o 2º TKI numa mediana de 6 meses, devido à resistência (58% dos casos) ou intolerância (16%). Os pacientes que falham ao tratamento com o segundo TKI, e não são elegíveis para o TMO, têm como alternativa trocarem o tratamento para outro TKI não usado previamente ou outras medicações (Hidroxiuréia, Interferon)15_.

Nós avaliamos 25 pacientes tratados com dasatinibe/nilotinibe em 3ª linha. Resposta hematológica completa foi obtida em 89% dos pacientes em FC, em 3 pacientes em FA e em nenhum paciente em CB. No entanto, RCC foi obtida em somente 16% dos pacientes e RMM em 24% dos casos. Os pacientes em FC obtiveram SG, SLP e SLE em 5 anos de 94%, 94% e 22%, respectivamente, superiores aos pacientes em fase avançada da doença. Nossos resultados são consistentes com os encontrados por outros pesquisadores.

Quintas-Cardama et al.22_{, em um estudo com 23 pacientes com LMC (19}

deles em FA e CB) tratados com dasatinibe após falha com imatinibe e nilotinibe, mostraram que o dasatinibe pode ser ativo em alguns pacientes após falha a dois TKIs prévios, uma vez que 43% dos pacientes alcançaram RHC e 30% alcançaram resposta citogenética.

Giles et al.23_{, em um estudo com 60 pacientes tratados com nilotinibe após}

falha ao imatinibe e dasatinibe, mostraram que 79% dos pacientes em FC alcançaram RHC e 43% alcançaram resposta citogenética maior (RCM). Aos 18 meses, a SLP foi 59% nos pacientes em FC e a SG de 86%. Na FA, a SG foi 80% em 12 meses.

Ibrahim et al.96_{, em um estudo com 26 pacientes com LMC que falharam a}

dois TKIs prévios mas continuavam na primeira FC, mostraram que a probabilidade de SLE e SG em 30 meses para esses pacientes foi de 45,7% e 46,7%, respectivamente.

Garg. et al.97_{, em um estudo com 48 pacientes com LMC, mostraram que}

respostas podem ser alcançadas com dasatinibe ou nilotinibe após falha prévia a dois TKIs, mas que essas respostas geralmente não são duráveis, exceto em alguns pacientes na FC que obtiveram uma mediana de SLF de 20 meses em comparação com 5 meses para pacientes em FA e 3 meses para pacientes em CB.

Na nossa população, confirmamos os dados da instabilidade das respostas obtidas em 3ª linha, principalmente nas fases avançadas da LMC: 50% dos pacientes em FC e 33% dos pacientes em FA perderam RHC. Dois pacientes em FC perderam RCC e um paciente em FC e um em FA perderam RMM. Nenhum

paciente em CB sobreviveu mais que 18 meses. No entanto, vale ressaltar que esses meses de resposta podem ser o tempo necessário para a localização de um doador compatível ou preparo para o TMO e dessa forma beneficiar os pacientes.

As mutações do BCR-ABL são um mecanismo frequente de resistência nesses pacientes. No nosso estudo, identificamos várias mutações durante o tratamento de 3ª linha, conforme relatado por outros autores, que demonstraram que novas mutações podem surgir com o tratamento sequencial com TKIs 53,54_.

Além dessa causa conhecida de resistência, outros fatores podem estar envolvidos. Isso nos motivou a estudar outros genes que poderiam estar relacionados à resistência ao dasatinibe. Os genes ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncFOXO3A, ncMYLIP e ncSLC44A2, foram previamente identificados pelo nosso grupo através da análise de microarranjos e foram diferencialmente expressos em pacientes responsivos e resistentes ao dasatinibe 58_.

O gene ABCF2 faz parte de uma família de transportadores de membrana e apesar de ter sido descrito com expressão alterada em diversos tipo de cânceres, seu papel na LMC não é conhecido. Nesse estudo nós não encontramos diferença de expressão entre os pacientes responsivos e resistentes ao dasatinibe, porém, encontramos o ABCF2 com expressão diminuída em amostras de pacientes com LMC ao diagnóstico e após o tratamento com dasatinibe (resistentes e responsivos), em relação ao grupo controle.

O papel do ABCF2 é controverso na literatura. O perfil de expressão do ABCF2 é variável em diferentes tipos de cânceres. Enquanto alguns estudos mostraram que expressão aumentada do ABCF2 está relacionada com um bom prognóstico, outros observaram que expressão aumentada está relacionada com resistência à quimioterapia.

Ogawa et al.63_{, em um estudo que mensurou a expressão do ABCF2 em}

câncer de mama, mostraram que tumores ABCF2-positivos possuem maior sobrevida livre de doença (SLD) do que tumores negativos em pacientes com metástases nos linfonodos. Em pacientes tratados com terapia endócrina, tumores ABCF2-positivos também tiveram uma SLD maior quando os tumores eram negativos para o receptor de estrógeno ou progesterona. Os autores também

sugeriram que o ABCF2 pode exercer um papel na supressão de tumor metastático e em vias endócrinas do câncer de mama.

Hlavata et al.67 _{observaram que níveis de transcritos ABCF2 foram}

significativamente menores em pacientes com câncer colo retal não responsivos à quimioterapia paliativa em comparação com responsivos.

Tsuda et al.65_{, por exemplo, mostraram o ABCF2 com expressão}

aumentada em câncer ovariano de células claras (frequentemente mais resistente à quimioterapia sistêmica do que outros tipos histológicos de câncer ovariano) em comparação com carcinoma ovariano seroso e que ABCF2 poderia ser um marcador potencial para o prognóstico de câncer ovariano.

Nishimura et al.64 _{em um estudo que mensurou o ABCF2 em câncer de}

útero, mostraram que entre os casos de câncer cervical a SG foi maior nos casos ABCF2-negativos do que nos positivos e que a expressão do ABCF2 poderia ser um marcador prognóstico em câncer cervical, mas não no endometrial. Os autores também sugeriram que o papel do ABCF2 pode ser diferente dependendo do tipo de câncer.

Nossos resultados presentes também foram controversos aos encontrados no estudo prévio de análise de microarranjos, onde o ABCF2 foi encontrado com expressão aumentada em pacientes pós-tratamento com dasatinibe resistentes em relação aos pacientes pré-tratamento responsivos. Porém temos que considerar que o grupo e número de pacientes avaliados foram diferentes. A hipoexpressão do ABCF2 observada no nosso estudo nos casos de LMC ao diagnóstico é dado inédito na literatura e pode estar relacionada a patogênese da LMC. Dessa forma, estudos prospectivos são necessários para elucidação da função do ABCF2 na LMC.

Em relação ao gene ALOX15B, não observamos diferença de expressão do gene ALOX15B entre pacientes resistentes e responsivos ao tratamento com dasatinibe em segunda linha. ALOX15B foi hipoexpresso nos pacientes com LMC ao diagnóstico em relação aos pacientes pós-tratamento com dasatinibe e ao grupo controle.

Nossos resultados estão de acordo com observações prévias que mostraram que os produtos da 12/15-LO (ALOX15) foram encontrados diminuídos em células mielóides e tecidos hematopoiéticos humanos e que esses produtos podem suprimir a leucemia mielóide humana 98_{. Além disso, a ALOX15A e a}

ALOX15B são duas isoenzimas da ALOX15 que parecem exercer efeitos anticarcinogênicos importantes através do metabolismo dos PUFAs 99_.

Nossos dados também são consistentes com outros trabalhos. Tang et al.100 _{sugeriram que o ALOX15B poderia ser um supressor do desenvolvimento de}

câncer de próstata devido a suas funções em restringir a progressão do ciclo celular.

Middleton et al.101 _{demonstraram que camundongos deficientes em enzimas}

12/15-LO (ALOX15) desenvolvem desordens mieloproliferativas que progridem para leucemias transplantáveis. Os autores também estabeleceram a ALOX15 como um importante supressor de desordens mieloproliferativas devido ao seu papel efetor crítico na regulação da fosforilação da ICSBP dependente de PI3-K.

Mahipal et al. 74 _{mostraram que os metabólitos da ALOX15 são capazes de}

induzir apoptose em linhagens de células K562. Os autores também sugeriram que a indução da morte celular pelos metabólitos da ALOX15 [15-(S)-HPETE e 13- (S)-HPODE] e [15-(S)-HETE e 13-(S)-HODE] em linhagens celulares K562 é realizada pelas vias de morte celular intrínsecas através da ativação do citocromo c e da caspase-3, mediados por espécies reativas de oxigênio (ROS) gerados pela ativação da NADPH oxidase.

Chen et al.75 _{identificaram o gene ALOX15 como um gene regulatório crítico}

para a sobrevida das células-tronco de LMC. Os autores mostraram que a deficiência ou inibição da função desse gene causa depleção das células-tronco de LMC e previne o surgimento da LMC induzida pela BCR-ABL em camundongos. Esses resultados são consistentes com nossos resultados prévios encontrados nos microarranjos, onde o gene ALOX15B foi identificado com expressão aumentada em pacientes com LMC pré-resistentes ao tratamento com dasatinibe em segunda linha em comparação com pacientes pré-responsivos58_,

mas não com os resultados do presente estudo onde o ALOX15B estava hipo- expresso em pacientes com LMC em relação ao grupo controle.

Devido a sua importância como potencial supressor tumoral e sua relação com as células-tronco hematopoiéticas leucêmicas, é necessária uma maior investigação do papel do gene ALOX15B na LMC.

O gene PAWR é um supressor tumoral capaz de induzir apoptose seletivamente em células cancerígenas sem afetar células normais 79_{. A}

expressão de PAWR foi descrita como diminuída em diversos tipos de tumores, como no carcinoma de células renais 102_{, neuroblastoma} 103_{, cancer endometrial} 104_{, cancer de mama} 105,106 _{e em leucemia linfoblástica crônica e aguda} 107_.

Além disso, García-Cao et al. 108 _{demonstraram que PAWR em}

camundongos knock-out estavam inclinados a desenvolver tumores espontaneamente e com tratamento carcinogênico e que o endométrio e a próstata desses camundongos eram particularmente sensíveis a desenvolver lesões proliferativas.

Kukoc-zivojnov et al.109 _{mostraram pela primeira vez que o gene PAWR}

possui uma capacidade anti-transformadora na proliferação, independente de fator induzida pela p185BCR-ABL _{em células hematopoiéticas. Brieger et al.}80 _observaram

que em células mielóides BCR-ABL positivas resistentes aos agentes quimioterápicos convencionais a expressão de PAWR aumentava a sensibilidade ao imatinibe (STI571). Entretanto, não há outros dados relacionados ao papel do PAWR na LMC.

Nós mostramos pela primeira vez que o gene PAWR possui expressão diminuída em pacientes com LMC em relação a doadores saudáveis. Observamos também hipoexpressão nos casos resistentes ao dasatinibe em relação aos responsivos, corroborando os dados encontrados na análise de microarranjos 58_.

Nossa hipótese é que o gene PAWR possa ter um papel importante na resistência ao dasatinibe através da inibição da apoptose. Devido à sua função como supressor tumoral, aumentar sua expressão poderia execer efeitos anti- carcinogênicos importantes na LMC auxiliando no aumento da apoptose de

células leucêmicas, enquanto células normais não são afetadas. Estudos futuros são necessários para elucidar nossa hipótese.

Dois grupos relataram experimentos para induzir um aumento na expressão de PAWR em células cancerígenas. Zhao et al.110 _{mostraram que injeção}

intravenosa de proteína PAWR ou SAC recombinante inibe células cancerígenas em camundongos. Yang et al.111 _{identificaram saRNAs (small activating RNAs)}

sintéticos que poderiam ativar a expressão de PAWR em células cancerígenas humanas.

Quanto ao gene MYLIP (myosin regulatory light chain interacting protein) não há relatos sobre seu papel e de seu RNA longo não codificante na LMC, porém o gene MYLIP foi identificado como um potencial supressor tumoral em leucemias humanas, uma vez que MYLIP é alvo do cluster miR-106-363, cujo aumento de expressão foi encontrado em leucemias de células T77_.

Os RNAs longos não codificantes (lncRNA) são moléculas de RNA que podem funcionar como transcrito primário ou transcrito de splicing e não se encaixam em classes conhecidas de pequenos RNAs ou em classes de RNAs estruturais 112_{. Os lncRNs são transcritos de regiões intrônicas, intergênicas ou de}

UTRs, mas não são traduzidos em proteínas. Os lncRNAs podem estar envolvidos em carcinogênese e progressão de tumores através de uma variedade de mecanismos, já que estas moléculas podem exercer funções reguladoras essenciais sobre a proliferação celular, apoptose, ou metástase113–116. Alguns lncRNA já foram descritos, porém a maioria ainda não foi caracterizada funcionalmente.

Demonstramos pela primeiro vez no presente estudo que ncMYLIP é um lncRNA com expressão diminuída em pacientes com LMC ao diagnóstico em relação com pacientes pós-tratamento com dasatinibe e ao grupo controle. O ncMYLIP é um ncRNA intrônico senso. Estas são as mensagens mais difíceis de caracterizar, porque podem se confundir com o pré-mRNA do gene de mesmo locus. A caracterização do ncRNA intrônico senso não foi realizada neste trabalho, porém deverá ser avaliada prospectivamente.

Os resultados são semelhantes ao dados encontrados na análise de microarranjos, onde ncMYLIP foi hipoexpresso em pacientes resistentes pré- tratamento ao dasatinibe em relação aos pacientes responsivos pré-tratamento. Entretanto, no presente trabalho não encontramos diferenças entre pacientes resistentes e responsivos após o tratamento com dasatinibe e não comparamos os pacientes pré-tratamento como no trabalho anterior.

Outro RNA longo não codificante que apresentou expressão diminuída em pacientes com LMC ao diagnóstico em relação aos pacientes com LMC tratados com dasatinibe foi o ncFOXO3A. Na LMC foi demonstrado que a transformação mediada pelo BCR-ABL e sinalização da sobrevida na LMC requer a ativação da FOXO3A 70_{. Porém, o papel de seu RNA longo não codificante não é conhecido na}

LMC.

Nossos resultados foram semelhantes aos encontrados na análise de microarranjos onde o ncFOXO3A estava hipoexpresso em pacientes resistentes pós-dasatinibe em relação aos responsivos pré-dasatinibe. No presente estudo não avaliamos pacientes pré e pós dasatinibe, porém o ncFOXO3A estava hipoexpresso em amostras com maior número de células leucêmicas (ao diagnóstico) que em amostras com menor número de células lecêmicas (tratados com dasatinibe). Também não caracterizamos o ncRNA intrônico neste trabalho.

Em resumo, os genes ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncMYLIP e ncFOXO3A foram encontrados com expressão alterada nos grupos estudados e podem estar envolvidos com mecanismos importantes relacionados à resistência e/ou à patogênese da LMC e devem ser avaliados em futuros estudos.

6. CONCLUSÕES

- Entre os pacientes tratados com dasatinibe/nilotinibe após falha ou intolerância ao imatinibe com avaliação molecular, 67%, 43% e 33% dos pacientes em FC, FA e CB obtiveram RMM, respectivamente. Poucos pacientes tratados com dasatinibe/nilotinibe após falha ou intolerância a 2 TKIs obtiveram respostas moleculares durante o tratamento e essas respostas não foram duráveis. Entre os pacientes analisados 24% alcançaram RMM, desses 40% perderam a RMM em sete meses.

- Pacientes com LMC tratados com dasatinibe/nilotinibe após falha ou intolerância a um ou dois TKIs em fases avançadas da doença possuem taxas de SG, SLP e SLE menores do que pacientes na FC.

- Foram detectadas 11 mutações entre os 36/71 pacientes com LMC tratados com dasatinibe/nilotinibe após falha ou intolerância ao imatinibe avaliados quanto à presença de mutações, entre elas estavam: L387M (1), E255K (1), M351T(1), E255V (1), Y253H (1), M244V (2), T315I (5). Entre os 14/25 pacientes com LMC tratados com dasatinibe/nilotinibe após falha ou intolerância a dois TKIs,