BEATRIZ FELICIO RIBEIRO
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA MOLECULAR E DA EXPRESSÃO DOS GENES ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncFOXO3A, ncMYLIP E ncSLC44A2 EM PACIENTES COM LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA EM USO DE INIBIDORES DE TIROSINA
QUINASE DE SEGUNDA GERAÇÃO
CAMPINAS 2015
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Ciências Médicas
BEATRIZ FELICIO RIBEIRO
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA MOLECULAR E DA EXPRESSÃO DOS GENES ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncFOXO3A, ncMYLIP E ncSLC44A2 EM PACIENTES COM LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA EM USO DE INIBIDORES DE TIROSINA
QUINASE DE SEGUNDA GERAÇÃO
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências na Área de Concentração em Clínica Médica.
ORIENTADORA: DRA. KATIA BORGIA BARBOSA PAGNANO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA BEATRIZ FELICIO RIBEIRO, E ORIENTADA PELA DRA. KATIA BORGIA BARBOSA PAGNANO.
Assinatura da orientadora
_____________________________
CAMPINAS 2015
RESUMO
A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma neoplasia mieloproliferativa crônica caracterizada pela presença do cromossomo Filadélfia (Ph) e produção da fusão proteica BCR-ABL que possui atividade tirosina quinase. O tratamento da LMC é realizado com inibidores de tirosina quinase (TKIs) e apesar das altas taxas de respostas obtidas com imatinibe, alguns pacientes são resistentes ou intolerantes ao tratamento, sendo necessário a troca para um TKI de segunda geração (nilotinibe ou dasatinibe). O monitoramento das respostas obtidas ao longo do tratamento permite identificar os pacientes que estão em um “estado seguro” (resposta ótima) e os que podem falhar ao tratamento. Os mecanismos de resistência ao tratamento são multifatoriais e a identificação desses mecanismos pode contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento dos casos resistentes. Em um trabalho anterior do nosso grupo foram identificados diversos genes e RNAs longos não codificantes diferencialmente expressos em pacientes responsivos e não responsivos ao dasatinibe, entre eles os genes ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncFOXO3A, ncMYLIP e ncSLC44A2. O objetivo desse trabalho foi avaliar a resposta molecular em pacientes com LMC em uso de inibidores de tirosina quinase de segunda geração (dasatinibe ou nilotinibe) após falha ou intolerância a um ou dois TKIs e avaliar a expressão dos genes ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncFOXO3A, ncMYLIP e ncSLC44A2 em pacientes responsivos e resistentes ao dasatinibe. A metodologia utilizada para avaliação dos níveis de trancritos BCR-ABL e da expressão gênica foi o PCR quantitativo em tempo real. A pesquisa de mutações no domínio quinase do BCR-ABL foi realizada nos casos resistentes, através da técnica de sequenciamento direto. Setenta e um pacientes tratados com dasatinibe ou nilotinibe após falha ou intolerância ao imatinibe foram avaliados quanto à resposta molecular. Sessenta e sete porcento, 43% e 33% dos pacientes em fase crônica (FC), acelerada (FA) e crise blástica (CB) obtiveram resposta molecular maior (RMM), respectivamente, ao longo do tratamento. Os pacientes com respostas moleculares precoces (transcritos BCR-ABL <10% aos 3 meses e <1% aos 6 meses) apresentaram maiores SLP e SLE do que os casos
que não alcançaram esses níveis de transcritos BCR-ABL aos 3 e/ou aos 6 meses. A avaliação molecular aos 3 meses e aos 6 meses permitiu a melhor identificação dos pacientes com pior prognóstico. Foram também avaliados 25 pacientes tratados com dasatinibe/nilotinibe após falha ou intolerância a dois TKIs. RMM foi obtida em somente 24% dos casos (em FC, um paciente em FA). As taxas de SG e SLP em 5 anos para pacientes em FC foram de 94% e 94%, respectivamente. Poucos pacientes alcançam respostas e essas respostas não são duráveis. Embora seja uma opção para pacientes não elegíveis ao TMO, é necessário o desenvolvimento de um tratamento mais eficaz para esses pacientes. Para avaliação da expressão dos genes ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncFOXO3A, ncMYLIP e ncSLC44A2 foram utilizadas amostras de 9 pacientes ao diagnóstico (sem tratamento prévio), 39 pacientes tratados com dasatinibe (25 responsivos com RCC e 14 resistentes) e 13 doadores saudáves. Não houve diferença de expressão do gene ncSLC44A2 entre os grupos avaliados. Os genes ALOX15B e ncMYLIP estavam hipoexpressos em pacientes com LMC ao diagnóstico em relação aos pacientes com LMC tratados com dasatinibe e ao grupo controle. O gene ncFOXO3A apresentou expressão diminuída em pacientes com LMC ao diagnóstico em relação aos pacientes tratados com dasatinibe. O genes ABCF2 e PAWR estavam hipoexpressos em pacientes ao diagnóstico e nos pacientes tratados com dasatinibe em relação ao grupo controle. Além disso, o gene PAWR estava pouco expresso em pacientes resistentes ao dasatinibe em relação aos pacientes responsivos. Portanto, os genes ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncMYLIP e ncFOXO3A foram encontrados com expressão alterada nos grupos estudados e podem estar associados a mecanismos importantes relacionados ao desenvolvimento e resistência da LMC, o que deve ser elucidado em estudos prospectivos.
ABSTRACT
Chronic myeloid leukemia (CML) is a chronic myeloproliferative neoplasm characterized by the presence of Philadelphia chromosome (Ph) and production of BCR-ABL fusion protein that has tyrosine kinase activity. Currently, the treatment of CML is accomplished with tyrosine kinase inhibitors (TKIs). Despite the high rates of responses obtained with imatinib, some patients are resistant or intolerant to treatment and need to switch to second generation TKIs (dasatinib or nilotinib). Monitoring responses during treatment allows the identification of patients who are in a “safe haven” (optimal response) and patients who may fail to treatment. Mechanisms of resistance to treatment are multifactorial and identification of these mechanisms may contribute to the development of new strategies for treatment of resistant cases. In a previous report of our group were identified several genes and long non-coding RNAs differentially expressed in CML patients responders and non-responders to dasatinib, including ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncFOXO3A, ncMYLIP and ncSLC44A2 genes. The aim of this study was to evaluate molecular responses in CML patients treated with second generation TKIs (dasatinib or nilotinib) after failure or intolerance to one or two TKIs and to evaluate the expression of ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncFOXO3A, ncMYLIP and ncSLC44A2 genes in patients responsive and resistant to dasatinib. The methodology used to evaluate BCR-ABL transcript leves and the gene expression was quantitative real time PCR. BCR-ABL kinase domain mutations analysis was performed in resistant cases by direct sequencing. Seventy-one patients treated with dasatinib/nilotinib after failure or intolerance with imatinib were evaluated according to molecular responses. Sixty-seven percent, 43% and 37% of chronic phase (CP), accelerated phase (AP) and blast crisis (BC) CML patients achieved major molecular response (MMR), respectively, during treatment. Patients with early molecular responses (BCR-ABL1<10% at 3 months and <1% at 6 months) had superior PFS and EFS than patients that not achieved these landmarks. The evaluation at 3 and 6 months allows better identication of patients with worse prognosis. We analyzed molecular responses in 25 patients treated with dasatinib/nilotinib after failure or intolerance
with two TKIs. MMR was achieved in 24% of cases (all in CP, one in AP). Five-year OS and PFS rates for CP-CML patients were 94% and 94%, respectively. Few patients achieved responses and these responses are not durable. Although, dasatinib/nilotinib had been options for patients not elegible for bone morrow transplantation, its necessary the development of a treatment more effective to these patients. To evaluate the expression of ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncFOXO3A, ncMYLIP e ncSLC44A2 genes was used samples of 9 patients newly diagnosed (without treatment), 39 patients treated with dasatinib (25 responsives with CCyR and 14 resistant) and 13 healthy donors. There’s no difference of ncSLC44A2 gene expression between the groups analized. ALOX15B and ncMYLIP genes were down-regulated in CML patients newly diagnosed in comparison with CML patients treated with dasatinib and control group. ncFOXO3A gene presented decreased expression in CML patients at diagnosis in comparison with patients treated with dasatinib. ABCF2 and PAWR genes were down-regulated in CMl patients newly diagnosed and in CML patients treated with dasatinib in comparison with control group. Moreover, PAWR gene was down-regulated in CML patient’s resistants to dasatinib in comparison with responsives. ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncMYLIP and ncFOXO3A were found with altered expression between the groups evaluated and may be associated with mechanisms related to the development and resistance of CML, which should be elucidated in prospective studies.
SUMÁRIO
RESUMO... vii
ABSTRACT ... ix
SUMÁRIO... xi
AGRADECIMENTOS ... xvii
LISTA DE FIGURAS ... xxi
LISTA DE TABELAS ... xxv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... xxvii
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Leucemia Mielóide Crônica (LMC) ... 1
1.2 Patogênese da LMC ... 2
1.3 Tratamento da LMC ... 4
1.4 Monitoramento da resposta ao tratamento ... 7
1.5 Mecanismos de resistência ao tratamento ... 12
1.6 Genes e RNAs longos não codificantes diferencialmente expressos em pacientes com LMC tratados com dasatinibe após falha ao imatinibe ... 14
2. OBJETIVOS ... 19
2.1 Objetivos gerais ... 19
2.2 Objetivos específicos ... 19
3. PACIENTES E MÉTODOS ... 21
3.1 – Aspectos éticos da pesquisa ... 21
3.2 - Pacientes e controles ... 21
3.3 Monitoramento do tratamento ... 21
3.4. PCR quantitativo em tempo real (RQ-PCR) para detecção de transcritos BCR-ABL em pacientes com Leucemia Mielóide Crônica ... 22
3.4.1 Amostras ... 22
3.4.2 Extração de RNA... 22
3.4.3 Síntese de DNA complementar (cDNA) ... 25
3.5 Pesquisa de mutação no domínio quinase do ABL de pacientes com
LMC ... 30
3.5.1 Coleta e extração de RNA ... 30
3.5.2 Síntese de DNA complementar (cDNA) ... 30
3.5.3 PCR Semi-Nested ... 30
3.5.4 Purificação do produto da PCR Semi-Nested ... 31
3.5.5 Reação de Sequenciamento ... 31
3.6 PCR quantitativo em tempo real (RQ-PCR) para avaliação da expressão dos genes ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncMYLIP, ncFOXO3A e ncSLC44A2 em pacientes com Leucemia Mielóide Crônica ... 34
3.6.1 Coleta das amostras ... 34
3.6.2 Separação de células mononucleares do sangue periférico ... 34
3.6.3 Síntese de DNA complementar (cDNA) ... 35
3.6.4 Verificação da síntese de cDNA ... 36
3.6.5 Desenho dos primers para avaliação da expressão dos genes ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncMYLIP, ncFOXO3A e ncSLC44A2 ... 36
3.6.6 Padronização da concentração dos primers ... 38
3.6.7 Eficiência da reação ... 38
3.6.8 PCR Quantitativo em tempo real (RQ-PCR) para avaliação da expressão dos genes ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncMYLIP, ncFOXO3A e ncSLC44A2 ... 40
3.7 Análise Estatística ... 41
4. RESULTADOS ... 43
4.1 Avaliação da resposta molecular de pacientes com LMC tratados com TKIs de segunda geração após falha ao imatinibe ... 45
4.1.1 Características dos pacientes e respostas ... 45
4.1.2 Análise de mutações do domínio quinásico do BCR-ABL ... 50
4.1.3 Análise de sobrevida ... 51
4.2 Avaliação das respostas moleculares de pacientes com LMC tratados com TKIs de segunda geração em terceira linha após falha a dois TKIs ... 56
4.2.2 Análise de sobrevida ... 60
4.2.3 Resultados a longo prazo ... 62
4.3 Avaliação da expressão dos genes ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncMYLIP, ncFOXO3A e ncSLC44A2 em pacientes com LMC e doadores normais ... 63
4.3.1 Perfil de expressão do gene ABCF2 em células mononucleares de pacientes com LMC ... 63
4.3.2 Perfil de expressão do gene ALOX15B em células mononucleares de pacientes com LMC ... 64
4.3.3 Perfil de expressão do gene PAWR em células mononucleares de pacientes com LMC ... 66
4.3.4 Perfil de expressão do ncFOXO3A em células mononucleares de pacientes com LMC ... 67
4.3.5 Perfil de expressão do ncMYLIP em células mononucleares de pacientes com LMC ... 69
4.3.6 Perfil de expressão do ncSLC44A2 em células mononucleares de pacientes com LMC ... 70 5. DISCUSSÃO ... 73 6. CONCLUSÕES ... 83 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 85 ANEXO 1 ... 97 APÊNDICES ... 105
“O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis”
AGRADECIMENTOS
À Dra. Katia Borgia Barbosa Pagnano por ter me recebido em seu laboratório e me confiado este trabalho, pelos constantes ensinamentos e pelo apoio ao longo dele.
À Dra. Dulcinéia Martins de Albuquerque e à Regiane Aparecida Ferreira do laboratório de Hemoglobina e Genoma do Hemocentro da Unicamp, pelos ensinamentos, pela disponibilidade e pela contribuição ao longo de todas as etapas desse trabalho.
Ao Dr. Fernando F. Costa pelo uso do seu laboratório.
À Rosana Antunes da Silveira, ex-aluna de doutorado da Dra. Katia, e à Angela Aguirres Fachel, do laboratório de Expressão Gênica em Eucariotos, IQ, USP, por compartilhar seus conhecimentos sempre que precisei.
À Eliana Miranda por ser sempre solicita e paciente, e pelas inúmeras análises estatísticas que fizemos e refizemos ao longo deste trabalho.
A todos os funcionários do hemocentro que contribuiram de alguma forma e aos funcionários do laboratório de diagnóstico de doenças oncohematológicas, em especial agradeço à Daiane, Bruna e Valquíria por ter me recebido no laboratório e me ensinado tudo que sabiam e faziam, pelo auxílio e contribuição durante todas as etapas desse trabalho.
A todos os pós-graduandos, graduandos, estagiários e queridos amigos que fiz ao longo dessa jornada pela convivência, troca de ideias e pelo auxílio quando precisei.
Ao meu marido Bruno pelo amor, pela amizade, pelo incentivo, apoio e compreensão.
À minha mãe Sandra que apesar dos poucos recursos priorizou em me dar o que é de mais valia, o que ninguém poderá me roubar, o conhecimento. Por acreditar em mim, estar sempre ao meu lado e pelo constante apoio.
Aos meus irmãos Letícia e Eduardo pelo apoio e pelo privilégio de como irmã mais velha ser um exemplo para vocês.
A toda minha família e amigos pelo carinho e incentivo.
A realização deste estudo contou com o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema do procedimento de lise de hemácias ... 23
Figura 2. Esquema do procedimento de extração de RNA utilizando o reagente Trizol ... 24
Figura 3. Gel desnaturante de agarose a 1,2% para avaliação de integridade do RNA ... 25
Figura 4. Programa para transcrição reversa utilizando o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosistems) ... 26
Figura 5. Disposição das amostras na placa de 96 poços para RQ-PCR .... 28
Figura 6. Temperaturas de ciclagem utilizadas para quantificação dos transcritos BCR-ABL ... 28
Figura 7. Curvas padrões do PCR quantitativo BCR-ABL ... 29
Figura 8. Obtenção de células mononucleares de sangue periférico utilizando Ficoll-PaqueTM Plus (GE Healthcare Bio-Science) ... 35
Figura 9. Gel de agarose a 1,5% com amplificação do gene GAPDH. ... 36
Figura 10. Análise da eficiência de amplificação dos primers ABCF2(A), ALOX15B(B), PAWR (C), ncFOXO3A(D), ncMYLIP(E), ncSLC44A2 (F) ... 39
Figura 12. SG, SLP e SLE em 71 pacientes com LMC tratados com inibidores de segunda geração após falha/intolerância ao imatinibe. ... 53
Figura 13. Sobrevida livre de progressão e livre de eventos de acordo com RQ-PCR aos 3 e 6 meses ... 55
Figura 14. Sobrevida global de acordo com as fases da LMC. ... 61
Figura 15. Sobrevida livre de progressão de acordo com as fases da LMC. 61
Figura 16. Sobrevida livre de eventos de acordo com as fases da LMC. ... 62
Figura 17. Perfil de expressão do ABCF2 em pacientes com LMC responsivos versus (vs.) resistentes ao tratamento com dasatinibe.. ... 63
Figura 18. Perfil de expressão do ABCF2 em doadores saudáveis versus (vs.) pacientes com LMC tratados com dasatinibe versus (vs.) pacientes com LMC ao diagnóstico. ... 64
Figura 19. Perfil de expressão do ALOX15B em pacientes com LMC responsivos versus (vs.) resistentes ao tratamento com dasatinibe.. ... 65
Figura 20. Perfil de expressão do ALOX15B em doadores saudáveis versus (vs.) pacientes com LMC tratados com dasatinibe versus (vs.) pacientes com LMC ao diagnóstico. ... 65
Figura 21. Perfil de expressão do PAWR em pacientes com LMC responsivos versus (vs.) resistentes ao tratamento com dasatinibe ... 66
Figura 22. Perfil de expressão do PAWR em doadores saudáveis versus (vs.) pacientes com LMC tratados com dasatinibe versus (vs.) pacientes com LMC ao diagnóstico. ... 67
Figura 23. Perfil de expressão do ncFOXO3A em pacientes com LMC responsivos versus (vs.) resistentes ao tratamento com dasatinibe. ... 68
Figura 24. Perfil de expressão do ncFOXO3A em doadores saudáveis versus (vs.) pacientes com LMC tratados com dasatinibe versus (vs.) pacientes com LMC ao diagnóstico.. ... 68
Figura 25. Perfil de expressão do ncMYLIP em pacientes com LMC responsivos versus (vs.) resistentes ao tratamento com dasatinibe. ... 69
Figura 26. Perfil de expressão do ncMYLIP em doadores saudáveis versus (vs.) pacientes com LMC tratados com dasatinibe versus (vs.) pacientes com LMC ao diagnóstico.. ... 70
Figura 27. Perfil de expressão do ncSLC44A2 em pacientes com LMC responsivos versus (vs.) resistentes ao tratamento com dasatinibe.. ... 71
Figura 28. Perfil de expressão do ncSLC44A2 em doadores saudáveis versus (vs.) pacientes com LMC tratados com dasatinibe versus (vs.) pacientes com LMC ao diagnóstico. ... 71
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Critérios de classificação da fase acelerada e crise blástica de acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) ... 02
Tabela 2. Definições da resposta hematológica, citogenética e molecular .... 08
Tabela 3. Definições de respostas ao TKI em primeira linha ... 10
Tabela 4. Definições de respostas ao TKI de segunda linha após falha ao imatinibe ... 11
Tabela 5. Master mix para a síntese de DNA complementar (cDNA) ... 25
Tabela 6. Primers e sondas utilizados para monitoramento dos níveis de transcritos BCR-ABL em pacientes com LMC através de RQ-PCR ... 27
Tabela 7. Descrição dos programas utilizados em cada etapa das reações da PCR para análise de mutação ... 32
Tabela 8. Primers utilizados nas reações para o sequenciamento ... 33
Tabela 9. Primers utilizados para análise do perfil de expressão gênica em pacientes com LMC responsivos e resistentes ao dasatinibe ... 37
Tabela 10. Características clínicas e laboratoriais dos pacientes com LMC ao diagnóstico (n=71) ... 46
Tabela 11. Características clínicas e laboratoriais dos pacientes com LMC ao início do 2º TKI (n=71) ... 47
Tabela 12. Características clínicas e laboratoriais dos pacientes com LMC em FC ao diagnóstico (n=54) ... 48
Tabela 13. Características clínicas e laboratoriais dos pacientes com LMC em FC ao inicio do 2º TKI ... 49
Tabela 14. Respostas moleculares dos pacientes com LMC em FC, FA e CB tratados com o 2º TKI (n=71) ... 50
Tabela 15. Mutações no domínio quinásico BCR-ABL (n=36/71) ... 51
Tabela 16. Sobrevidas em 3 anos de acordo com os níveis de transcritos BCR-ABL1 aos 3 e 6 meses após início do tratamento com dasatinibe ou nilotinibe em segunda linha ... 54
Tabela 17. Características clínicas e laboratoriais ao diagnóstico de pacientes com LMC tratados com TKIs de segunda geração em terceira linha (n=25)... 57
Tabela 18. Características clínicas e laboratoriais dos pacientes com LMC ao início do 3º TKI ... 58
Tabela 19. Respostas moleculares dos pacientes com LMC tratados com o 3º TKI ... 59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA – ácido aracdônico ATP – adenosina trifosfato BID – duas vezes ao dia BU – bussulfan
CAS – do inglês, p130 CRK-associated substrate CB – crise blástica
cDNA – DNA complementar
CEP – Comitê de Ética em Pesquisa CLPs – progenitores linfoides comuns CMPs – progenitores mielóides comuns CRKL – do inglês, CRK-like
Ct – cycle threshold
DAXX – proteína associada à morte celular DEPC – dicarbonato de dietila
DP1 – proteína dirigente 1
EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético FA – fase acelerada
FAK – do inglês, focal adhesion kinase FC – Fase Crônica
G – granulócitos
GAB2 – do inglês, GRB2-associated binding protein 2 GMPs – progenitores de granulócitos e macrófagos GRB2 – do inglês, growth factor receptor-bound protein 2 GSH – glutationa reduzida
GVHD – doença do enxerto versus hospedeiro HDAC – deacetilase de histona
HSC – células-tronco hematopoiéticas HU – hidroxiuréia
IFNα – Interferon-alfa recombinante humano IM – imatinibe
KIT – protooncogene do receptor do fator de célula- tronco LMC – leucemia mielóide crônica
LOXs – lipoxigenases M – macrófagos
MAPK – do inglês, mitogen activated protein kinase MEG – megacariócitos
MEK – quinase ativadora da MAP quinase
MEPs – progenitores de células sanguíneas vermelhas e megacariócitos NALC – n-acetil cisteína
ncRNA – RNA não codificante
OMS – Organização Mundial da Saúde
PARP – do inglês, Poli ADP-ribosio polimerase
PDGFRβ – receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas, do tipo beta Ph – cromossomo Filadélfia
PI3K – do inglês, phosphatidyllinositol-3 kinase P-loop – alça do fosfato
PUFAs – ácido graxos poli-insaturados
Raf – do inglês, proto-oncogene serine/threonine kinase
RAS – proteínas de ligação trifosfato de guanidina (proteína G) RCC – resposta citogenética completa
RCE – rebordo costal esquerdo RCM – resposta citogenética maior RCP – resposta citogenética parcial RHC – resposta hematológica completa RM – resposta molecular
RMC – resposta molecular completa RMM – resposta molecular maior ROS – espécies reativas de oxigênio
SG – sobrevida global
SH2 – do inglês, SRC homology 2
SHP – do inglês, SH2-containing inositol-S-phosphatase SLD – sobrevida livre de doença
SLE – sobrevida livre de eventos SLF – sobrevida livre de falha
SLP – sobrevida livre de progressão SOS – do inglês, son of sevenless
TCLE – termo de consentimento livre e esclarecido TK – tirosina quinase
TKIs – inibidores de tirosina quinase TMO – transplante de medula óssea TRAIL – ligante indutor de apoptose TSA – do inglês, trichastatin A Y177 – do inglês, tyrosine 177
1. INTRODUÇÃO
1.1 Leucemia Mielóide Crônica (LMC)
A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma neoplasia mieloproliferativa que se origina em uma célula-tronco pluripotente anormal na medula óssea e resulta em proliferação exacerbada de células da linhagem granulocítica e em alterações em todas as linhagens hematopoiéticas1.
A LMC tem uma incidência anual no mundo de 1-2 casos em cada 100.000 habitantes e apesar de ocorrer em qualquer faixa etária, a idade mediana ao diagnóstico é de 50 a 60 anos, com uma leve predominância em indivíduos do sexo masculino1.
A maioria dos pacientes são diagnosticados na fase crônica (FC) da doença e podem apresentar fadiga, perda de peso, sudorese noturna, esplenomegalia e anemia, além de leucocitose com desvio à esquerda até mieloblastos/promielócitos. Cerca de 20-40% dos pacientes são assintomáticos e as anormalidades na contagem de leucócitos são detectadas em exames de rotina. Se não tratada evolui para a fase acelerada (FA) e/ou para a crise blástica (CB) no período de aproximadamente cinco anos. Os critérios de avaliação na classificação da FA e CB podem ser visualizados na tabela 1.
Tabela 1. Critérios de classificação da fase acelerada e crise blástica de acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS)1,2
Fase Critérios da OMS 2008
Acelerada
Blastos 10-19%
Basófilos ≥ 20%
Plaquetas < 100 x 109/L não relacionado com a terapia; ou >
1000 x 109/L não responsivo à terapia
Citogenética Evolução Clonal (não presente no momento do diagnóstico)
Baço e contagens de leucócitos
Aumento do tamanho do baço e aumento da contagem de leucócitos não responsiva à terapia Crise Blástica
Blastos ≥ 20%
Blastos extra
medulares
Presentes
Outros Grandes focos ou aglomerados de blastos na biópsia de medula óssea
1.2 Patogênese da LMC
A patogênese da LMC envolve um rearranjo cromossômico específico: a translocação recíproca entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22, t(9;22)(q34;q11), que dá origem a um novo cromossomo, o 22q encurtado, denominado cromossomo Filadélfia (Ph). Cerca de 95% dos casos de LMC apresentam o cromossomo Ph; nos demais casos ocorrem translocações variantes ou crípticas1.
A fusão do gene Abelson murine leukemia (ABL) do cromossomo 9 com o gene breakpoint cluster region (BCR) do cromossomo 22 codifica uma oncoproteína BCR-ABL de 210 kD (p210) com a região tirosina quinase do ABL ativa1,3. A LMC é iniciada pela atividade dessa oncoproteína BCR-ABL em
em progenitores mielóides comuns (CMPs), que então se diferenciam em progenitores granulocíticos/macrófagos (GMPs; progenitores de granulócitos (G) e macrófagos (M)) e progenitores de megacariócitos/eritrócitos (MEPs; progenitores de células sanguíneas vermelhas (RBCs) e megacariócitos (MEGs). Os MEGs produzem plaquetas4.
As HSCs podem também se diferenciar em progenitores linfoides comuns (CLPs), que são os progenitores dos linfócitos T e B. A FC inicial da LMC é caracterizada pela expansão maciça das séries de células granulocíticas. A aquisição de mutações genéticas adicionais durante a expressão do BCR-ABL causa a progressão da LMC da FC para a CB, caracterizada por um acumulo de células blásticas mielóides (em aproximadamente 2/3 dos pacientes) ou células blásticas linfoides (em 1/3 dos pacientes). Embora a célula-tronco da LMC seja multipotente, a produção de células B derivadas do clone neoplásico ocorre apenas em baixos níveis, e apenas raros precursores de células T podem ser detectados. Isso indica que a linfopoiese, particularmente o desenvolvimento de células T, é comprometida pela expressão do BCR-ABL4.
A sinalização da proteína BCR-ABL na LMC se dá da seguinte maneira: a proteína ligante ao receptor de fator de crescimento 2 (GRB2) interage com a BCR-ABL através do sítio de ligação proximal do homólogo 2 da SRC (SH2) quando o resíduo de tirosina 177 (Y177) da BCR-ABL é auto-fosforilado. GRB2 se liga ao ABL e interage com a proteína SOS. O complexo resultante, BCR-ABL-GRB2-SOS, ativa a Ras. As proteínas CRKL (CRK-like) e SHC também podem mediar a ativação da Ras. As vias de Ras e da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) são acopladas pela Raf (uma serina/treonina quinase), que catalisa a fosforilação do mitógeno ativado e o sinal extracelular regulado pelas quinases 1 e 2 (MEK1 e MEK2). Através da estimulação das vias Ras-Raf, a BCR-ABL aumenta o crescimento celular independente de fator de crescimento5.
A BCR-ABL também se associa e ativa a via PI3-K (phosphatidylinositol-3 kinase), suprimindo a morte celular programada e aumentando a sobrevida das células. A BCR-ABL é associada a componentes de adesão como actina, paxilina e quinase de adesão focal (FAK); a ativação de CRKL-FAK-PYK2 leva a uma
diminuição na adesão celular. A BCR-ABL também está associada às vias Janus quinase e JAK-STAT, à vias que levam a um aumento na migração celular e está associada com proteínas de sobrevida que interagem com a família BCL25.
Dessa forma, a atividade tirosina quinase da proteína BCR-ABL favorece o crescimento e transformação celular independentes de citocinas, atua na inibição da apoptose, leva a alterações na adesão da célula hematopoiética à matriz extracelular e à instabilidade genômica1,3.
1.3 Tratamento da LMC
Os tratamentos inicialmente utilizados na LMC incluíam radioterapia esplênica e drogas quimioterápicas convencionais, como Bussulfan (BU) e Hidroxiuréia (HU), que ajudavam a limitar a expansão do tecido mielóide, mas não preveniam ou retardavam significativamente a progressão para a fase acelerada ou crise blástica6.
O transplante de medula óssea (TMO) alogênico foi o primeiro tratamento capaz de erradicar a população de células clonais malignas em pacientes com LMC. O TMO alogênico permanece até hoje um importante tratamento que oferece uma possibilidade de cura. Porém, nem todos os pacientes possuem doadores ou são elegíveis para o transplante. Além disso sua indicação deve ser analisada cuidadosamente, pois o TMO alogênico está associado com possíveis riscos como, por exemplo, mortalidade, doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), infecções e maior risco de neoplasias secundárias7,8.
Um avanço na terapia ocorreu com a introdução do interferon-alfa recombinante humano (IFNα), que foi capaz de induzir remissão citogenética completa em 15% a 30% dos pacientes, resultando numa vantagem significativa na sobrevida dos pacientes sobre a quimioterapia convencional6.
O tratamento atual da LMC é feito com os inibidores de tirosina quinase (TKIs). O primeiro TKI a ser aprovado para uso clínico foi o mesilato de imatinibe (Glivec@), desenvolvido por Druker et al.9 em colaboração com Cibageigy
(Novartis). O mesilato de imatinibe é uma pequena molécula inibidora de tirosina quinase ABL que se liga no sítio de ligação da proteína BCR-ABL com o ATP, o que impede a transferência do grupo fosfato do ATP (adenosina trifosfato) para o
substrato e bloqueia as vias de transdução de sinais. Ou seja, o imatinibe inibe a proliferação e induz as células BCR-ABL positivas à apoptose10,11.
O imatinibe (IM) foi aprovado para o tratamento da LMC em 2002, inicialmente para pacientes que não respondiam ou eram intolerantes ao Interferon-α (IFNα)9. Dois anos depois, o estudo randomizado internacional IRIS,
que comparou o tratamento em primeira linha com IFNα associado à citarabina versus IM, demonstrou a superioridade do IM sobre o IFNα/citarabina nos pacientes com LMC recém-diagnosticados, com taxas estimadas de resposta citogenética completa (RCC) de 76,2% para o grupo tratado com IM e 14,5% para o grupo tratado com IFNα/citarabina12.
A superioridade do IM sobre o IFNα/citarabina em termos de resposta hematológica e citogenética, tolerabilidade e probabilidade de progressão, levou à sua aprovação para terapia de primeira linha da LMC, mudando o padrão de tratamento e melhorando dramaticamente o prognóstico de pacientes na FC12,13.
Na atualização do estudo IRIS, após 6 anos de seguimento dos pacientes com LMC recebendo IM em primeira linha, a taxa cumulativa de RCC observada foi 82%. A sobrevida global (SG) foi de 88% (95% se for considerado apenas morte relacionada à LMC), a sobrevida livre de progressão para FA e CB foi de 93% e a sobrevida livre de eventos (SLE) foi 83%14.
Apesar dos bons resultados com o IM como terapia de primeira linha, alguns pacientes são resistentes ou intolerantes ao tratamento. Para esses pacientes é recomendada a mudança da terapia para outros TKIs, como o nilotinibe ou dasatinibe, ou o TMO alogênico após falha ao segundo TKI ou mutações resistentes15.
O nilotinibe foi desenvolvido a partir de uma modificação no grupo metilpipepazinil do IM para melhorar as características de ligação à BCR-ABL. Ele é 10-30 vezes mais potente do que o IM. Além disso, possui atividade contra a maioria das mutações resistentes ao IM, com exceção da mutação T315I. Comparado ao IM, o nilotinibe tem uma especificidade relativamente maior contra a BCR-ABL e atividade reduzida contra TK PDGFRβ (receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas, beta) e KIT (protooncogene do receptor de
fator de célula tronco). As mutações do domínio quinase do BCR-ABL menos sensíveis ao nilotinibe são: Y253H, E255K/V, e F359V/C16–18.
O nilotinibe mostrou ser efetivo para o tratamento de pacientes resistentes ou intolerantes ao IM. Em um estudo de fase II com pacientes com LMC em FC em tratamento com nilotinibe após intolerância ou resistência ao IM acompanhados por 4 anos, foi observado que 45% dos pacientes alcançaram RCC e esta resposta foi estável. A SG em 4 anos foi de 78% e a sobrevida livre de progressão (SLP) de 57%19.
O dasatinibe, por sua vez, não possui relações estruturais com o IM. Ele é capaz de se ligar à conformação ativa e inativa da proteína BCR-ABL1. O dasatinibe é 325 vezes mais potente do que o IM contra o tipo selvagem do BCR-ABL1 e possui atividade contra a maioria das mutações do BCR-BCR-ABL1 (exceto a T315I) e contra as enzimas da família de quinase SRC. As mutações menos sensíveis ao dasatinibe são: F317L e V299L16–18.
O dasatinibe também mostrou-se eficaz no tratamento de pacientes resistentes ou intolerantes ao IM. Em um estudo de fase III com pacientes com LMC em FC resistentes ou intolerantes ao IM, tratados com dasatinibe em diferentes doses (100 ou 140 mg por dia ou 50 ou 70 mg duas vezes ao dia) foi observado taxas de SG de 70% a 77% e de SLP de 40% a 51% em 6 anos de acompanhamento. Resposta molecular maior (RMM) foi alcançada por 40% dos pacientes20.
Entretanto, cerca de 52% dos pacientes tratados com TKI de segunda geração após falha ao IM descontinuam o tratamento, a maioria devido à resistência ou intolerância21. O TMO alogênico tem sido reservado para o
tratamento de terceira linha, após falha ao TKI de segunda geração, exceto nos casos com a mutação T315I, onde é indicado após a falha ao IM 15. No entanto,
nem todos os pacientes são elegíveis para o transplante, seja por comorbidades ou disponibilidade de doador.
Alguns trabalhos mostraram que alguns pacientes que falharam a dois TKIs prévios podem alcançar respostas e resultados clínicos a longo prazo utilizando um terceiro TKI. Pacientes com LMC em tratamento com dasatinibe ou nilotinibe
em terceira linha alcançam resposta hematológica completa (RHC) em 43%-70% e RCC em 30% dos casos. A taxa de SG desses pacientes foi de 86%. Embora essas respostas não sejam duradouras, o dasatinibe ou nilotinibe em terceira linha de tratamento são opções terapêuticas para pacientes que não são elegíveis para o transplante de medula óssea22,23.
1.4 Monitoramento da resposta ao tratamento
A resposta ao tratamento com TKIs é o fator prognóstico mais importante. A resposta do paciente frente ao tratamento é avaliada sob três aspectos: 1) resposta hematológica, definida como completa se houver normalização de valores de leucócitos no sangue periférico e ausência de esplenomegalia; 2) resposta citogenética, definida pela proporção de metáfases Ph-positivas; e 3) resposta molecular, definida por meio da quantificação dos transcritos BCR-ABL através de PCR quantitativo. Na tabela 2 encontram-se as definições conforme os Critérios da European LeukemiaNet (ELN)24. As novas definições de resposta
Tabela 2. Definições da resposta hematológica, citogenética e molecular6,24
Tipo de resposta Definições
Hematológica
Completa Contagem de Leucócitos < 10 x 109/L
Plaquetas < 450 x 109/L
Basófilos < 5%
Ausência de células imaturas Ausência de esplenomegalia Parcial Persistência de células imaturas
Plaquetas abaixo de 50% dos níveis do pré-tratamento, mas acima de 450 x 109/L
Citogenética
Completa Ausência completa de células Ph+
Parcial 1% a 35% de células Ph+
Menor 36% a 65% de células Ph+
Mínima 66% a 95% de células Ph+
Molecular
Completa Transcritos BCR-ABL indetectáveis pelo PCR em tempo real quantitativo e/ou Nested PCR em duas amostras consecutivas de sangue de qualidade adequada
Maior (RM3.0*) Relação BCR-ABL/ABL (ou outro gene controle)
≤ 0,1% na escala internacional (IS)
RM4.0* Relação BCR-ABL/ABL (ou outro gene controle)
≤ 0,01% (IS)
RM4.5* Relação BCR-ABL/ABL (ou outro gene controle)
≤ 0,0032% IS * RM = Resposta Molecular
A resposta ao tratamento é baseada na obtenção de cada uma dessas respostas ao longo do tempo. A resposta pode ser classificada como ótima, alerta
(“warning”) ou falha. Resposta ótima significa que o paciente é apto a ter uma sobrevida próxima ao normal e o tratamento deve ser mantido. A situação de alerta (“warning”) é intermediária entre a resposta ótima e falha e significa que o paciente tem uma pequena probabilidade de alcançar uma resposta ótima e deve ser monitorado mais cuidadosamente do que os outros pacientes. Falha significa que o paciente não alcançará uma resposta ótima e por essa razão deve ser encaminhado para outra terapia disponível 15,24. Os critérios de resposta para o
Tabela 3. Definições de respostas ao TKI em primeira linha15
Ótima Alerta Falha
Baseline Não aplicável -Alto risco, e/ou -Anormalidades cromossômicas adicionais ao Ph+,(major route) Não aplicável 3 meses - BCR-ABL1≤10% e/ou - Ph+ ≤ 35% - BCR-ABL1>10%, e/ou - Ph+ 36%-95% - Falha em alcançar RHC, e/ou -Ph+ > 95% 6 meses - BCR-ABL1<1% e/ou - Ph+ 0 - BCR-ABL1 1-10% e/ou - Ph+ 1-35% - BCR-ABL1>10% e/ou Ph+ > 35%
12 meses - BCR-ABL1≤0,1% - BCR-ABL1 0,1-1% - BCR-ABL1 >1% e/ou Ph+ > 0 Após 12 meses a qualquer momento - BCR-ABL1≤0,1% - Anormalidades cromossômicas adicionais ao Ph- (-7, ou 7q-) - Perda de RHC - Perda de RCC - Perda confirmada de RMM -Mutações - Anormalidades cromossômicas adicionais ao Ph+
Tabela 4. Definições de respostas ao TKI de segunda linha após falha ao imatinibe15
Ótima Alerta Falha
Baseline Não aplicável - Não ter obtido RHC ou ter perdido RHC com o imatinibe, ou - Falta de Resposta citogenética com o 1º TKI, ou -Alto risco Não aplicável 3 meses - BCR-ABL1≤10%, e/ou - Ph+ < 65% - BCR-ABL1>10%, e/ou - Ph+ 65-95% - Não alcançar RHC, ou - Ph+ > 95%, ou - Novas mutações 6 meses - BCR-ABL1≤10%, e/ou - Ph+ <35% - Ph+ 35-65% - BCR-ABL1>10%, e/ou - Ph+ > 65%, e/ou - Novas mutações 12 meses - BCR-ABL1<1%, e/ou - Ph+ 0 - BCR-ABL1 1-10% e/ou - Ph+ 1-35% - BCR-ABL1 >10%, e/ou - Ph+ >35%, e/ou - Novas mutações Depois dos 12 meses a qualquer momento - BCR-ABL1≤0,1% - Anormalidades cromossômicas adicionais ao Ph- (-7 ou 7q-), ou - BCR-ABL1 > 0,1% - Perda de RHC - Perda de RCC ou RCP - Novas mutações - Perda confirmada de RMM - Anormalidades cromossômicas adicionais ao Ph+
Na última atualização dos critérios de resposta da Leukemia Net 2013, os critérios moleculares foram incorporados na definição das respostas. O monitoramento da resposta molecular permite identificar os pacientes que obterão estabilidade a longo prazo, com manutenção de respostas moleculares profundas e também os casos com resposta inadequada, que pode estar relacionada com resistência ou má adesão25.
Vários estudos mostraram que a obtenção de respostas moleculares precoces é preditiva de melhor sobrevida livre de progressão e de eventos a longo prazo em pacientes com LMC tratados com TKIs em primeira ou segunda linha26,27.
Entretanto, ainda é controverso se uma única avaliação do BCR-ABL é suficiente para definir o prognóstico e indicar uma troca da terapia. Um trabalho recente mostrou que respostas moleculares aos 3 e 6 meses são complementares e preditivas de resultados clínicos a longo prazo em pacientes com LMC em FC tratados com inibidores de segunda linha após falha com IM28.
1.5 Mecanismos de resistência ao tratamento
O desenvolvimento de resistência em pacientes tratados com TKIs é mais frequente nas fases avançadas da doença e esta pode ser considerada primária se o paciente nunca apresentou resposta ao tratamento e secundária quando ocorreu perda da resposta adquirida29.
A resistência ao imatinibe pode ser multifatorial e os principais mecanismos conhecidos são: biodisponibilidade oral, ligação com proteínas plasmáticas, mudanças na disponibilidade intracelular do imatinibe, aumento da expressão do BCR-ABL, evolução clonal, células-tronco quiescentes e mutações no domínio quinase do ABL29.
Pelo fato do IM ser um medicamento oral, pode haver problemas na ingestão (má aderência ao tratamento), absorção, metabolização, ligação com proteínas plasmáticas, influxo e efluxo do medicamento para dentro das células e inativação enzimática, que podem interferir na ação terapêutica, levando a uma diminuição dos níveis plasmáticos da droga30–37.
Células CD34+ de pacientes com LMC em CB com alta expressão de
BCR-ABL são menos sensíveis ao imatinibe e levam menos tempo para produzir subclones mutantes resistentes ao inibidor do que células com baixos níveis de expressão38.
A presença de evolução clonal (aquisição de cromossomos anormais adicionais na população de células Ph+) está correlacionada com diminuição da resposta ao IM em termos de resposta citogenética, resposta hematológica e SG e ainda é associada à evolução da doença para fases avançadas39–41.
Além disso, vários estudos mostraram que o tratamento com TKIs não erradicam todas as células leucêmicas. Dessa forma, a descontinuação com o tratamento pode levar ao paciente a uma recaída e em caso de resistência, mesmo em estado de repouso ou quiescente as células-tronco leucêmicas permanecem resistentes ao TKI42–44.
A causa mais frequente de resistência secundária é a perda de inibição do BCR-ABL, resultante da presença de mutações do ABL. Já foram descritas mais de 70 mutações em mais de 50 aminoácidos e muitas delas clinicamente relevantes45–47.
As mutações podem ocorrer em diversos domínios da quinase, como na alça do fosfato (P-loop), alça de ativação e domínio catalítico. Mutações que ocorrem em sítios de contato com o TKI eliminam pontes de hidrogênio críticas para a ligação. Outras que ocorrem na alça do fosfato impedem que a quinase assuma uma conformação adequada para a ligação do TKI e, por fim, aquelas da alça de ativação que estabilizam uma forma ativa da proteína, inacessível para o TKI45,48.
Vários estudos indicam que mutações no BCR-ABL são detectadas em cerca de 43%-63% dos pacientes resistentes ao IM. As mutações mais comumente associadas à resistência ao IM são T315I, M244V, G250E, E255K, Y253H, F359V49–51.
Embora a maioria das mutações clinicamente relevantes em pacientes resistentes ao IM sejam inibidas pelo dasatinibe e pelo nilotinibe, com exceção da mutação T315I, algumas mutações são menos sensíveis ao nilotinibe (Y253H,
E255K/V, e F359V/C) ou ao dasatinibe (F317L e V299L).52 Apesar dos TKIs de
segunda geração serem mais potentes, novas mutações podem ocorrer com o tratamento sequencial com TKIs53,54.
Müller et al.55 mostraram que as mutações mais comuns com o tratamento
com dasatinibe são T315I, F317L, e V299L. Outros trabalhos descrevem que as mutações mais comuns com o tratamento com nilotinibe são: E255K/V, T315I, F359C/V, G250E, e Y253H53,54.
A mutação T315I é uma das mais frequentemente detectadas em pacientes em tratamento com IM ou com TKIs de segunda geração. É uma mutação que confere resistência aos TKIs: imatinibe, dasatinibe, nilotinibe e bosutinibe56.
Dessa forma, vários TKIs que são ativos contra a mutação T315I estão sendo desenvolvidos. Dentre eles estão o XL288, o PHA-739.358 (danusertib), o AT9283 e o Ponatinibe (AP24534) que é um inibidor de quinase multiativo BCR-ABL/SRC com potente atividade pré-clínica e clínica contra todos os mutantes testados do BCR-ABL incluindo a T315I57.
Entretanto, embora algumas causas de resistência sejam conhecidas, ainda há diversos mecanismos ainda não elucidados. A identificação de outros mecanismos de resistência pode contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento dos casos resistentes.
1.6 Genes e RNAs longos não codificantes diferencialmente expressos em pacientes com LMC tratados com dasatinibe após falha ao imatinibe
Em um estudo anterior do nosso grupo foram identificados alguns genes e RNAs longos não codificantes (ncRNA) que podem estar relacionados com a resistência ao dasatinibe. Nesse trabalho foram analisados pacientes com LMC tratados com dasatinibe após resistência ao imatinibe. As amostras utilizadas foram coletadas pré e pós tratamento com dasatinibe e os pacientes foram agrupados em pré-responsivos ou pré não-responsivos e pacientes pós-responsivos ou pós não-pós-responsivos.
A análise do perfil de expressão dos pacientes foi realizada através de microarranjos utilizando duas plataformas: a primeira com sondas que mapeavam exclusivamente em genes codificadores de proteínas e a segunda, customizada,
com 44.000 elementos que mapeavam em regiões intrônicas e exônicas de mesmo locus58. Os principais genes diferencialmente expressos identificados
nesse trabalho foram: ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncFOXO3A, ncMYLIP e ncSLC44A2.
Entre os resultados encontrados nesse trabalho, entre os grupos pré-responsivo e pós-resistente ao tratamento com dasatinibe, o gene ABCF2 foi encontrado com expressão aumentada e o ncFOXO3A com expressão diminuída no grupo pós-resistente.
O gene ABCF2 é um membro da superfamília de transportadores ABC, a qual é a maior e mais diversa família de transportadores de membrana e está associada a muitos processos biológicos importantes, incluindo a resistência a múltiplas drogas em diversos tipos de câncer59. Alguns membros dessa família
assim como ABCB1, ABCC1, ABCG2 e ABCA3 estão associados à respostas a TKIs in vitro60–62. Porém, apesar desse gene ser descrito com expressão alterada em diversos tipos de tumores, como câncer de mama63, câncer de útero64,
cânceres de ovário65,66 e câncer colo retal67, o papel do gene ABCF2 na LMC
ainda não foi elucidado.
O gene FOXO3A, também conhecido como forkhead in rhabdomyosarcoma like protein 1 (FKHRL1), é um membro da família FOXO, a qual pode ser fosforilada diretamente pela AKT ativada e serve como importante fator de transcrição durante a embriogênese, diferenciação e tumorigênese68,69.
Na LMC foi demonstrado que a transformação mediada pelo BCR-ABL e sinalização da sobrevida na LMC requer a ativação da FOXO3A. A FOXO3A é constitutivamente fosforilada em linhagens celulares que expressam BCR-ABL e sua fosforilação é inibida pelo IM70. Adicionalmente, FOXO3A transcricionalmente
ativa pode aumentar a resistência ao IM em células de LMC, em parte pelo aumento da expressão do fator de necrose de tumor relacionado ao ligante indutor de apoptose (TRAIL)71.
Na análise de expressão gênica entre os grupos de pacientes pré-responsivos e pré-resistentes, o gene ALOX15B foi encontrado com expressão
aumentada e o ncMYLIP e ncSLC44A2 com expressão diminuída no grupo pré-resistente.
O gene ALOX15B também conhecido como 15-LOX-2 é um membro da família das lipoxigenases (LOXs) que são responsáveis por catalisar a adição do oxigênio molecular em ácido graxos poli-insaturados (PUFAs)72,73. O ALOX15B
oxigena principalmente o ácido aracdônico (AA) em 15-(S)-HPETE que é reduzido a 15-(S)-HETE74.
Chen et al.75 em um estudo recente identificaram o 15-LOX como um gene
regulatório crítico para a sobrevivência da célula-tronco da LMC. Mahipal et al.74
mostraram a capacidade dos metabólitos do 15-LOX em exercer feitos inibitórios de crescimento e rápida indução de apoptose nas células K562 através da liberação do citocromo c, ativação da caspase-3, clivagem do PARP e fragmentação do DNA induzida pelos metabólitos da 15-LOX-2: 15-(S)-HPETE e 15-(S)-HETE.
O gene MYLIP (myosin regulatory light chain interacting protein) é frequentemente associado a dislipidemias 76. Não há relatos do papel do gene
MYLIP e de seu RNA longo não codificante na LMC, porém o gene MYLIP foi identificado como um potencial supressor tumoral em leucemias humanas, uma vez que MYLIP é alvo do cluster miR-106-363, cujo aumento de expressão foi encontrado em leucemias de células T77.
O gene SLC44A2 [solute carrier family 44 (choline transporter), member 2] é um membro da família de transportadores de colina SLC44. A colina é um componente essencial para a síntese de membrana celular e desempenha um papel adicional no cérebro como precursor para a síntese do neurotransmissor acetilcolina. O SLC44A2 é pouco expresso no sistema nervoso e também é encontrado na língua, músculo, rim, coração, pulmões, intestino e estômago. Ele tem sido relacionado a doenças autoimunes, porém seu papel na LMC é desconhecido78.
O gene PAWR foi identificado com expressão diminuída nos pacientes resistentes pré e pós tratamento ao dasatinibe em comparação com os pacientes pré-responsivos. O gene PAWR (PRKC, apoptosis, WT1, regulator), também
conhecido como PAR-4 (prostate apoptosis response protein 4), é um supressor tumoral capaz de induzir apoptose em células cancerígenas enquanto mantém as células normais intactas. Muitos estudos destacaram a importância do gene PAWR não apenas em prevenir o desenvolvimento ou recorrência do câncer, mas também como um agente terapêutico anticâncer promissor79.
Estudos com linhagens de células K562 mostraram que expressão elevada de PAWR aumenta a expressão dos níveis de BCL-2 e proteína associada à morte (DAXX). A incubação com inibidores de Trichostatin A (TSA) deacetilase de histona (HDAC) e LAQ824 ou imatinibe (STI571) aumentou a taxa de apoptose em células K562-PAWR positivas80. Porém, o papel do PAWR na LMC ainda não está
claro.
Dessa forma, é importante avaliar o perfil de expressão desses genes em pacientes ao diagnóstico (pré-tratamento) para observar como eles se comportam na LMC sem tratamento e em pacientes responsivos e resistentes ao dasatinibe, onde a princípio foram identificados pelos microarranjos. Além disso, existem poucas informações do perfil de expressão desses genes na LMC e sua influência na evolução da doença. O melhor entendimento do papel desses genes pode auxiliar na identificação de novos alvos moleculares para o desenvolvimento de novas terapias efetivas para a LMC.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
Avaliar as respostas moleculares em pacientes com LMC em uso de inibidores de tirosina quinase de segunda geração e avaliar a expressão dos genes ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncFOXO3A, ncMYLIP e ncSLC44A2 em pacientes responsivos e resistentes ao dasatinibe.
2.2 Objetivos específicos
- Avaliar as respostas moleculares de pacientes com LMC tratados com dasatinibe/nilotinibe após falha ou intolerância a um ou dois TKIs
- Avaliar a sobrevida global, sobrevida livre de progressão e sobrevida livre de eventos segundo a fase da doença de pacientes com LMC tratados com dasatinibe/nilotinibe após falha ou intolerância a um ou dois TKIs
- Verificar a presença de mutações no domínio quinásico do BCR-ABL em pacientes com LMC tratados com dasatinibe/nilotinibe após falha ou intolerância a um ou dois TKIs
- Correlacionar os níveis de transcritos BCR-ABL aos 3 e 6 meses de tratamento com sobrevida global, sobrevida livre de progressão e sobrevida livre de eventos de pacientes com LMC em FC tratados com dasatinibe/nilotinibe após falha ou intolerância ao imatinibe.
- Avaliar a expressão dos genes ABCF2, ALOX15B, PAWR, ncFOXO3A, ncMYLIP e ncSLC44A2 em células mononucleares de pacientes com LMC tratados com dasatinibe e comparar com pacientes ao diagnóstico (sem tratamento prévio) e doadores saudáveis.
3. PACIENTES E MÉTODOS
3.1 – Aspectos éticos da pesquisa
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp sob registro nº 236.752 em 21/03/2013, segundo as determinações do Conselho Nacional de Saúde (Resoluções 196/96 e 251/97). Todos os pacientes e indivíduos controle leram e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) contendo os procedimentos da pesquisa (ANEXO 1).
3.2 - Pacientes e controles
Foram avaliados pacientes consecutivos, com diagnóstico de LMC, de ambos os sexos, independente da fase da doença, maiores de 18 anos de idade, pré-tratamento ou em tratamento com inibidores de tirosina quinase acompanhados no Hemocentro-UNICAMP. O diagnóstico foi confirmado através da presença do cromossomo Ph em análise citogenética e/ou presença de transcritos BCR-ABL através da técnica de RT-PCR. Os pacientes foram tratados com imatinibe e receberam um TKI de segunda geração após falha ou intolerância ao imatinibe. O monitoramento da resposta ao tratamento foi realizado segundo as recomendações do European LeukemiaNet24.
Os critérios utilizados para classificação dos pacientes em fase crônica (FC), fase acelerada (FA) e crise blástica (CB) foram os estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde (OMS)1. As definições utilizadas para resposta
hematológica, citogenética e molecular, bem como os critérios de resposta foram os estabelecidos pelo European LeukemiaNet24.
O grupo controle consistiu de indivíduos sadios, de ambos os sexos, com idade acima de 18 anos.
3.3 Monitoramento do tratamento
O monitoramento do tratamento com TKIs foi realizado na rotina do ambulatório, através de hemograma, avaliação citogenética (pré-tratamento e aos
3, 6, 12 e 18 meses até obtenção de resposta citogenética completa confirmada) e avaliação molecular (pré-tratamento e a cada 3 meses) realizada através da técnica de PCR quantitativo em tempo real (RQ-PCR).
Além disso, analisou-se a presença de mutação no BCR-ABL nos pacientes que apresentavam critérios de falha ou resposta sub-ótima conforme descrito nas recomendações da European LeukemiaNet24.
3.4. PCR quantitativo em tempo real (RQ-PCR) para detecção de transcritos BCR-ABL em pacientes com Leucemia Mielóide Crônica
3.4.1 Amostras
Foram coletados 16mL de sangue periférico em tubos contendo ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA). As amostras foram mantidas em temperatura ambiente e processadas em até 24 horas após coleta para evitar a degradação do RNA.
3.4.2 Extração de RNA
As amostras de sangue periférico em tubos contendo EDTA foram homogeneizadas, vertidas para tubo do tipo Falcon e centrifugadas a 3000rpm por 5 minutos a 4ºC. Após o descarte do plasma, foi adicionada solução de lise (8 volumes de NH4Cl 0,144M para cada volume de NH4HCO3 0,01M) e os tubos
foram agitados vigorosamente e incubados em gelo por 15 minutos. Após, foram centrifugados a 3000rpm por 10 minutos a 4ºC. Após retirada do sobrenadante e nova adição de solução de lise, os tubos foram centrifugados novamente a 3000rpm por 10 minutos a 4ºC. Esse procedimento foi repetido até a obtenção de um botão de leucócitos livre de hemoglobina. O botão de leucócitos obtido foi ressuspendido em 1mL de Trizol (Invitrogen, Life Technologies) e armazenado a -80ºC até ser realizada a extração de RNA. Na figura 1 encontra-se o esquema do procedimento de lise de hemácias.
Figura 1. Esquema do procedimento de lise de hemácias.
As amostras congeladas em Trizol foram mantidas por 5 minutos em temperatura ambiente para permitir uma dissociação completa do complexo nucleoprotéico. Após adição de 200 µL de clorofórmio (CHCL3), as amostras foram
agitadas vigorosamente e centrifugadas a 13.500rpm por 15 minutos a 4ºC. A fase orgânica, sobrenadante transparente onde se encontra o RNA, foi retirada cuidadosamente e transferida para um novo tubo onde procedeu-se o isolamento do RNA com adição de 500 µL de isopropanol 100%, agitação dos tubos por inversão e centrifugação a 13500 rpm por 10 minutos a 4ºC para precipitação do RNA. Após a precipitação, o sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 1mL de etanol 75%. Os tubos foram agitados vigorosamente e centrifugados a 11600 rpm por 5 minutos a 4ºC. Procedeu-se com a ressuspensão do RNA em 20 a 50µL de H2O tratada com diotilpirocarbonato (DEPC) e incubação a 55ºC por
10 minutos. Na figura 2 encontra-se o esquema do procedimento de extração de RNA.
Figura 2. Esquema do procedimento de extração de RNA utilizando o reagente Trizol.
Após o processo de extração o grau de pureza e a quantificação do RNA foram avaliados por espectrofotometria através do equipamento NanoDrop (NanoDrop Technologies). A integridade do RNA foi avaliada por eletroforese em gel desnaturante de agarose a 1,2%. As amostras íntegras apresentam duas subunidades ribossomais: 18S e 28S (figura 3).
Figura 3. Gel desnaturante de agarose a 1,2% para avaliação de integridade do RNA. Em A amostra íntegra. Em B amostra degradada.
3.4.3 Síntese de DNA complementar (cDNA)
A síntese de cDNA foi realizada a partir de 1 µg de RNA utilizando o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosistems). Primeiramente foi adicionado um volume de H2O tratada com DEPC, em seguida um volume de
RNA suficiente para perfazer 1µg de RNA total em um volume de 10µL. Os tubos com o RNA foram mantidos em gelo enquanto preparava-se o master mix para a transcrição reversa utilizando os seguintes componentes:
Tabela 5. Master mix para a síntese de DNA complementar (cDNA)
Componentes Volume dos componentes (µL)
H2O tratada com DEPC 7,12
10X RT Buffer 2,50
25X dNTP Mix (100mM) 1,00
10X RT Random Primers 2,50
MultiScribeTM Reverse Transcriptase 1,25
RNase Inhibitor 0,63
Volume final do mix 15,00
O volume necessário para o número de reações foi calculado de modo a incluir uma reação adicional devido a possíveis perdas de volume durante a
transferência dos reagentes. Em seguida o master mix foi adicionado a cada amostra resultando em um volume final de reação de 25µL e mantido em termociclador, com o seguinte programa:
Figura 4. Programa para transcrição reversa utilizando o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosistems).
3.4.4 PCR quantitativo em tempo real (RQ-PCR)
O cDNA foi amplificado utilizando o equipamento ABI 7300 (Applied Biosystems) e como sistema de detecção o reagente TAQMAN Universal Master Mix (Applied Biosystems), que é fornecido 2x concentrado e contém AmpliTaq Gold DNA polimerase, AmpErase UNG com dUTP, referência passiva ROX e componentes do tampão. Os primers e sondas utilizados na reação estão descritos na tabela 6. O gene controle utilizado foi o ABL. As sondas BCR-ABL e ABL foram duplamente embebidas em fluorocromo repórter (FAM) e em fluorocromo quencher (TAMRA). A concentração dos primers foi de 300nM e das sondas 100nM.
Tabela 6. Primers e sondas utilizados para monitoramento dos níveis de transcritos BCR-ABL em pacientes com LMC através de RQ-PCR
Primer/Sonda Sequência do primer/sonda
ABL Foward: 5’- GATACGAAGGGAGGGTGTACCA-3’ Reverse: 5’ – CTCGGCCAGGGTGTTGAA – 3’ BCR-ABL (p210) Foward: 5’- TCCGCTGACCATCAATAAGGA – 3’ Reverse: 5’ – CACTCAGACCCTGAGGCTCAA – 3’ Sonda fluorescente p/ p210
5’ FAM – CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGA – TAMRA 5’
Sonda fluorescente
p/ ABL
5’ FAM – TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT – TAMRA 5’
As reações foram realizadas com um volume final de reação de 25 μL, sendo 5μL de cDNA e 20μL de mix de reagentes: 12,5 μL do reagente TAQMAN Universal Master Mix, 4 μL de água DEPC, 1,5 μL de primer forward, 1,5 μL de primer reverse e 0,5 μL de sonda. Foram feitos dois mix de reagentes, um para o gene BCR-ABL e um para o gene ABL.
As reações foram realizadas em duplicata. A linhagem K562 e amostras com redução de 3 log foram utilizadas como controle positivo e a linhagem HL60 e o branco (NTC) como controle negativo da reação. Além disso, para cada placa foi utilizada uma curva padrão com diluições seriadas (4 a 6 diluições – 109 a 104) de
um plasmídeo linear contendo sequências BCR-ABL e ABL inseridas 81. Na figura
5 é possível observar a disposição das amostras na placa de 96 poços. As temperaturas de ciclagem utilizadas estão ilustradas na figura 6.
Figura 5. Disposição das amostras na placa de 96 poços para RQ-PCR.
Figura 6. Temperaturas de ciclagem utilizadas para quantificação dos transcritos BCR-ABL.
Para análise das placas o threshold foi ajustado de maneira que a eficiência da reação (R2) fosse igual ou acima de 0,99 (melhor que 99%) e o slope
(inclinação da curva) estivesse entre -3,3 e -3,6. Na figura 7 observamos as curvas padrões dos genes BCR-ABL e ABL.
A.
B.
Figura 7. Curvas padrões do PCR quantitativo BCR-ABL. Em A curva padrão do gene BCR-ABL e em B curva padrão do gene ABL.
Além disso, os Ct (cycle threshold) entre as duplicatas não deveriam exceder mais de 1 Ct e os valores de Ct referentes ao NTC deveriam ser indeterminados. As amostras positivas foram consideradas aceitáveis quando o número de cópias ABL estava acima de 10.000, já para amostras indetectáveis foram consideradas aceitáveis quando o número de cópias ABL estava acima de 40.000.
