Potenciais consequências e impactos de um ataque

La micro-injection intrahippocampique a été utilisée afin d’étudier le processus

d’épileptogenèse chez la souris C57BL/6. Les animaux anesthésiés ont été placés dans un

cadre stéréotaxique adapté (Kopf Instrument, Roucaire, France) sur une banquette chauffante

pour limiter la baisse de température corporelle induite par l’anesthésie générale. Après

protection contre le desséchement oculaire (Ocrygel^® ; Virbac, Carros, France) et

décontamination alcoolique de la surface de la peau du crâne, une incision médio-sagittale a

été effectuée pour exposer le crâne de l’animal, et un trou (~1 mm de diamètre) a été foré à

l’aide d’une fraise adaptée au-dessus de l’hippocampe dorsal droit selon les coordonnées

stéréotaxiques suivantes : antéropostérieures (AP) : -2 mm ; médiolatérales (ML) : -1,5 mm ;

dorsoventrales (DV) : -2 mm ; en utilisant le bregma comme référence (Figure 46), d’après

Paxinos et Franklin (2001). Les coordonnées DV du lambda ont été également contrôlées afin

de vérifier l’horizontalité du crâne au sein de l’appareil stéréotaxique. La solution appropriée

(soman, KA ou sérum physiologique) a ensuite été injectée dans l’hippocampe dorsal droit de

la souris (hippocampe ipsilatéral) en utilisant une canule en acier inoxydable (diamètre

extérieur de 0,28 mm ; Phymep, Paris France) connectée à une microseringue de contenance

0,5 µL (Hamilton, Bonaduz, Suisse) via un tube en polyéthylène (PE-20 ; Becton-Dickinson,

Le Pont de Claix, France). Les injections ont été effectuées pendant 1 min en utilisant une

canule a été laissée en place 2 min supplémentaires pour limiter le reflux le long du trajet

d’injection. Toutes les injections de soman ont été effectuées entre 8 à 13 h afin de limiter

l’impact circadien sur les expérimentations effectuées. La grande majorité des injections de

KA ont également été effectuées durant cette plage horaire.

Une autre procédure d’injection a été effectuée chez certains animaux afin d’étudier les

effets électrophysiologiques précoces de la micro-injection intrahippocampique de soman.

Les procédures liées à cette expérimentation sont consignées page 185.

III.1. Préparation des solutions d’injection intrahippocampique

III.1.1.Acide kaïnique

Le syndrome d’EMLT a été modélisé chez la souris par l’injection intrahippocampique

d’1 nmol de KA (Bouilleret et coll., 1999 ; Riban et coll., 2002). La solution d’injection

(20 mM) a été constituée par la dilution de 10 mg d’acide kaïnique (MM de 231,25 g/mol ;

Sigma-Aldrich, Lyon, France) dans 2,16 mL de sérum physiologique, distribuée en aliquotes

de 50 µL conservés à -80°C jusqu’à leur utilisation. Cinquante nanolitres de cette solution ont

permis l’injection intrahippocampique d’1 nmol de KA. Chaque aliquote a été conservé à 4°C

entre chaque injection et renouvelé quotidiennement.

III.1.2.Soman

a.Caractéristiques physiques et données de sécurité

Le soman (densité de 1,02 et MM de 182 g/mol ; pureté > 97% par analyse

chromatographique en phase gazeuse) a été fourni par le Centre d’Etudes du Bouchet (CEB,

Vert-Le-Petit, France). La préparation des solutions diluées de soman a été effectuée sous

hotte filtrante par une personne habilitée, équipée de gants butyl et d’un masque de protection

respiratoire (F. Dorandeu). Le principal danger associé à la procédure de micro-injection

intrahippocampique réside dans l’inhalation des vapeurs toxiques émises par la solution

d’injection. Ainsi, les expérimentations ont été effectuées dans une pièce de grand volume et

la période durant laquelle la dilution est susceptible d’émettre des vapeurs en dehors d’une

hotte a été minimisée. La procédure a impliqué deux personnes, toutes deux équipées d’un

masque de protection respiratoire muni d’une cartouche filtrante A2B2P3. La protection

respiratoire était notamment indispensable durant les phases d’aspiration et de purge de la

solution d’injection.

i.Préambule

Pour réaliser l’injection de 11 nmol de soman (soit 2 µg) dans un volume de 50 nL

(volume basé sur l’injection intrahippocampique de KA), il a été nécessaire de constituer une

solution de 40 mg/mL. Cette solution ne peut pas être préparée directement dans le sérum

physiologique en raison de la solubilité du soman dans ce véhicule (environ 21 g/L d’après la

fiche de données de sécurité du CEB). Elle a donc été préparée dans de l’isopropanol anhydre

à partir d’aliquotes de soman pur et conservée en aliquote de 100 µL à -30°C dans des

flacons adaptés. Le jour de l’expérimentation, les aliquotes nécessaires ont été décongelées et

placées sous hotte dans un portoir placé dans du charbon actif. Contrairement à ce qui

pouvait être fait avec la solution de KA, il n’a pas été possible de contrôler visuellement

l’apparition d’une goutte de 50 nL à l’extrémité de la canule d’injection à la fin de l’injection.

Il est possible qu’une différence de tension de surface et de volatilité de la solution soit en

cause. Ce contrôle visuel permettait notammant de s’assurer que la canule n’était pas bouchée

lors de l’injection. De plus, l’étude préliminaire qui portait sur trois souris de souche Swiss

(Janvier) n’a pas permis d’observer d’effets physiologiques, EEG et histologiques notables

(données non illustrées). L’ensemble de ces éléments a conduit à renoncer à ce protocole

d’injection.

ii.Protocole d’injection du soman

Une solution de 20 mg/mL a pu être obtenue par dilution extemporanée de soman pur dans

du sérum physiologique et ainsi permettre l’injection intrahippocampique des 11 nmol dans

un volume de 100 nL. La solution de soman à 20 mg/mL a été effectuée sous hotte avec une

protection cutanée adaptée, quelques heures avant l’injection et conservée dans la glace. Du

soman pur (5 µL soit 5 mg) a été aspiré à l’aide d’une pipette à déplacement positif à embout

jetable (0-10 µL) et placé dans un flacon en verre contenant 245 µL de sérum physiologique.

La dilution a été longuement agitée au vortex.

Pour les doses d’injection inférieures à 11 nmol (4 ; 2,8 ; 2 ; 1 ; 0,75 et 0,53 nmol), un

volume d’injection de 50 nL a été utilisé en référence aux études utilisant le KA (Bouilleret et

coll., 1999) ; les différentes doses ont été obtenues en faisant varier la concentration de la

solution préparée extemporanément (1,9 à 20 mg/mL).

III.1.3.Constitution du groupe témoin des procédures

Le groupe témoin (TEM) a été constitué par des animaux injectés dans l’hippocampe

dorsal droit avec 50-100 nL de sérum physiologique, afin d’évaluer les effets propres du KA

ou du soman en maintenant comparables les autres facteurs. Certaines expérimentations ont

fait appel à des souris naïves. Ce groupe a été formé par des animaux n’ayant pas subi

d’intervention chirurgicale ou d’injection intrahippocampique.