Isolamento de tecidos dos nematoides
B). Pré-adipócitos de camundongo imortalizados (Células 3T3-F442A) ( As amostras foram
injetadas em um citômetro. Foi traçado um campo denominado de “Células Imortalizadas” onde se
encontram as células de camundongo. Os eixos X e Y se referem à área do Forward Scatter e Side
Scatter, respectivamente.
Sendo assim, buscamos verificar se estaria havendo uma morte geral das células do nematoide ou se se trata da morte de alguns tecidos em específico. Para isso, utilizamos os nematoides com marcação de GFP em músculo ou intestino. Primeiramente confirmamos que células GFP positivas eram detectadas por meio de citometria em ambos os tecidos (Figura 12). No entanto as células de intestino foram detectadas com fluorescência para GFP muito fraca, com pequena complexidade interna (SSC) e em quantidade menor (o que é esperado tendo em vista que há 10 células musculares para cada intestinal).
Figura 12 – Partículas GFP positivas são detectadas em lisados de nematoides com tecidos
fluorescentes - C. elegans foram lisados com o protocolo descrito em métodos e as amostras foram
injetadas em um citômetro de fluxo. Foram utilizados nematoides selvagens e expressando GFP no intestino ou músculo. Estão indicadas as porcentagens de células fluorescentes (GFP+) ou não (GFP-). No eixo x se encontra a intensidade da fluorescência de GFP enquanto no eixo y se encontra a área do
Side Scatter.
Células de músculo e intestino de C. elegans apresentam um tamanho maior que 5 µm 116. Portanto, se forem observadas células GFP positivas menores que esse diâmetro, elas provavelmente estão mortas. Utilizamos cell strainers de 5 µm para obter uma população de tamanho menor que seus
poros e comparamos a mesma com o lisado total do nematoide. Além disso, utilizamos de marcação por IP para observar a viabilidade das células no citômetro.
Em animais com fluorescência no músculo (AGD885) e intestino (SJ4144), a proporção de partículas GFP positivas é similar entre o lisado e o filtrado menor que 5 µm (Figura 13), indicando que as células estão se decompondo em partículas menores.
Figura 13 – São detectadas partículas GFP positivas <5 µm em lisados de nematoides com tecidos
fluorescentes - C. elegans com músculo (AGD885), ou intestino (SJ4144) fluorescentes foram lisados
com o protocolo descrito em métodos e a amostra obtida foi filtrada (< 5 µm) ou não (Lisado) com um filtro de 5 µm. As amostras foram injetadas em um citômetro de fluxo. O eixo x corresponde à fluorescência do GFP e o eixo y se refere ao número de eventos. No gráfico estão indicadas as populações de partículas marcadas (+) ou não (-) com GFP e suas porcentagens.
Como esses dados indicaram a presença de muitos debris e células mortas, realizamos mais um controle para verificar a viabilidade das células: a coloração do lisado com o marcador de morte celular 7-AAD, o qual apenas permeia membranas celulares danificadas e se liga ao DNA, emitindo
fluorescência. Por esse marcador, foram observadas poucas células mortas no lisado, evidenciado pelo pequeno número de partículas com marcação por 7-AAD (Figura 14 A). Como controle tratamos uma parte da amostra com um choque de calor de 60 °C por 15 minutos, observando um grande aumento no número de partículas marcadas (Figura 14 B).
Figura 14 – Há células sem marcação por 7AAD no lisado dos nematoides submetido à citometria - C. elegans selvagens foram lisados com o protocolo descrito em métodos. O lisado foi corado com 1 µg/mL de 7AAD, um marcador de viabilidade celular, e injetado em um citômetro. As células foram tratadas (direita) ou não (esquerda) com um choque de calor de 60°C por 15 minutos. O eixo X se refere à fluorescência do 7AAD e o eixo Y ao número de eventos. No gráfico estão indicadas as populações de partículas marcadas (7-AAD+) ou não (7-AAD-) com o corante e suas porcentagens.
Sendo assim, apesar da presença de material morto e debris, há células vivas GFP positivas que foram observadas por microscopia e pelas marcações com 7AAD e IP no citômetro. Para testar se conseguiríamos isolar essas células e caracterizá-las, testamos primeiramente o isolamento de músculo, tendo em vista que sua maior quantidade de células em relação ao intestino facilitaria a obtenção de uma maior quantidade de material. Para isso, aplicamos um lisado de AGD885 (fluorescente no músculo) em um cell sorter e isolamos células GFP positivas após a seleção por três gates: o primeiro exclui partículas com altos valores de FSC e SSC correspondentes aos ovos do nematoide; o segundo
exclui grumos com mais de uma célula que se encontram fora de uma faixa linear em um gráfico da área pela altura do sinal de FSC; e o terceiro seleciona células que apresentam fluorescência no comprimento de onda do GFP (Figura 15).
Figura 15 – Estratégia de gates para o sorting do músculo - C. elegans apresentando músculo fluorescente (AGD885) foram lisados com o protocolo descrito em métodos e as amostras foram injetadas em um citômetro de fluxo acoplado a um Cell Sorter. As células foram selecionadas por 3
gates, o primeiro ‘Material sem Ovos’ (A) exclui partículas muito grandes que correspondem aos ovos
do nematoide. O segundo ‘Células Únicas’ (B) exclui grumos com mais de uma célula e o terceiro ‘GFP +’ (C) seleciona células fluorescentes. O eixo X se refere à área da fluorescência do GFP (C) ou à área do Forward Scatter (A e B). O eixo Y se refere à altura do pico de fluorescência do Forward
Scatter (B e C) ou à área do Side Scatter (A). No gráfico estão indicadas as porcentagens das partículas
em cada gate.
Verificamos que houve um grande enriquecimento de partículas GFP positivas após o sorting (Figura 16). Essas apresentam uma tendência a enriquecimento na expressão do RNA mensageiro de GFP e de genes expressos no músculo, o que não ocorre com transcritos de outros tecidos como intestino e faringe (Figura 17). A predição da expressão tecidual dos genes foi obtida do WormBase (https://wormbase.org/), um site com um compilado de informações sobre C. elegans e outros nematoides.
A expressão gênica indica que o isolamento de células musculares foi bem-sucedido. No entanto, como há a perda de muitas células que morrem no processo, o material obtido ao final do cell
sorting foi pequeno, o que impossibilitou a realização de uma proteômica quantitativa com o músculo
isolado.
Sendo assim, optamos por realizar um sequenciamento de RNA mensageiro de nova geração tendo em vista que a quantidade de material necessário para essa técnica é pequena, podendo se restringir a uma única célula 117.
Figura 16 – Há um grande enriquecimento de células GFP+ após sorting do AGD885 - C. elegans apresentando músculo fluorescente (AGD885) foram lisados com o protocolo descrito em métodos e as amostras foram injetadas em um citômetro de fluxo acoplado a um Cell Sorter. As células foram isoladas de acordo com seleção pelos 3 gates descritos na figura anterior. Foi analisado em um
citômetro de fluxo o lisado do nematoide (esquerda) e células que sofreram sorting (direita). O eixo X se refere à fluorescência correspondente a GFP e o eixo Y ao número de eventos. No gráfico estão indicadas as populações de partículas marcadas (GFP+) ou não (GFP-) com GFP e suas porcentagens.
Ges -1 (I ntes tino) Myo -2 (F arin ge) Myo -3 (M úscu lo) Unc -45 (Mús culo ) GFP 0 1 2 3 4 20 40 60
Lisado
GFP+
E x p re ss ão R e la ti va d e R N AFigura 17 – Marcadores de tecido muscular e GFP apresentam tendência a aumento em RT-
qPCR com músculo isolado de AGD885 - C. elegans expressando GFP no músculo (AGD885) foram
lisados com o protocolo descrito em métodos (Lisado) e eventos GFP positivos foram isolados (GFP +). Foi dosado, por RT-qPCR, o RNA mensageiro de GFP e de marcadores teciduais. Foi utilizado o
his-10 como endógeno. O gráfico mostra a média ± o erro padrão da média. n = 2.
Primeiramente verificamos a qualidade do RNA obtido após o protocolo de isolamento do tecido. No lisado e em células GFP negativas foram observadas em um gel de agarose bandas bem definidas correspondentes aos RNAs ribossomais 18S e 28S, demonstrando que o RNA estava íntegro. Na amostra de células musculares as bandas estão fracas por conta da baixa concentração de RNA, não detectável em um nanodrop, mas com uma maior exposição a amostra aparenta estar integra (Figura 18).
Figura 18 – Foi obtido RNA integro após o processo de lise e isolamento de tecido muscular de C. elegans - Nematoides expressando GFP no músculo foram lisados com o protocolo descrito em
métodos (Lisado) e eventos GFP positivos (GFP +) e negativos (GFP -) foram isolados. O RNA dessas amostras foi injetado em um gel de agarose 1% e as bandas correspondentes aos RNAs ribossomais 18S e 28S foram observadas. O gel foi fotografado com duas exposições diferentes, uma menor (acima) e uma maior (abaixo).
Com essas amostras de músculo isolado preparamos uma biblioteca de sequenciamento de nova geração da Illumina. O RNA mensageiro foi isolado do RNA total por meio de beads, fragmentado quimicamente, poliadenilado e utilizado em uma reação de transcrição reversa. Esse material foi utilizado em um PCR para amplificar a biblioteca e introduzir os adaptadores da Illumina nas extremidades do produto.
O número de ciclos do PCR foi determinado de acordo com reações teste, nas quais amostras foram retiradas em diferentes momentos e analisadas em gel de agarose. Foi observado que com 21 ciclos a reação aparenta saturar (Figura 19 A), o que não ocorre com 20 ciclos (Figura 19 B, tendo em vista que a intensidade das bandas aumenta posteriormente.
Portanto, utilizamos 20 ciclos na preparação da biblioteca para amplificar ao máximo o material sem saturar a reação. Realizamos uma reação controle com água como substrato e não observamos a formação de uma biblioteca, a qual é observada como um arraste acima de 200 pares de base (Figura 19 B).
São observados dímeros de primer abaixo de 200 pares de base no gel, no entanto os mesmos são removidos com o tratamento com beads AMPure xp, as quais realizam uma seleção do DNA com
Lisado GFP - GFP + Menor
Exposição Maior Exposição
base no tamanho (Figura 19 B).
Figura 19 – Uma biblioteca de sequenciamento de nova geração foi gerada com o RNA isolado de
células musculares - Foram isoladas células musculares de C. elegans e seu RNA (GFP+) ou água
(Controle) foram utilizados para a preparação de uma biblioteca de sequenciamento de nova geração da Illumina. Foram retiradas amostras de biblioteca de músculo de C. elegans (A e B) ou controle (B) em diferentes ciclos do PCR utilizado para amplificação das bibliotecas. Na imagem está indicado o ciclo em que a amostra foi retirada. Uma alíquota do produto de 20 ciclos foi purificada com AMPure xp
beads (P) para eliminar dímeros de primer (B). Os produtos foram analisados em um gel de agarose de
2.5%. M = marcador de peso molecular, estão indicadas na imagem as bandas correspondentes a 50 e 200 pares de base.
Sendo assim, observamos que o protocolo de isolamento de tecidos descrito na literatura leva à morte de muitas células. Desenvolvemos adaptações no protocolo que parecem ter melhorado a
eficiência do processo, mas ainda são produzidos muitos debris celulares. Em contato com a autora correspondente do artigo que descreve esse protocolo verificamos que, de fato, há a geração de muitos debris, mas o grupo isola partículas GFP positivas independentemente do tamanho supondo que mesmo os fragmentos de célula podem conter RNA correspondente ao tecido que os originou. Com esse
protocolo o grupo determinou o transcriptoma de diversos tecidos revelando fenótipos importantes 89,91. Sendo assim, apesar das limitações, geramos uma biblioteca de sequenciamento de nova
geração com músculo isolado de C. elegans, validando uma técnica com potencial para revelar fenótipos relevantes. Estamos testando a viabilidade do isolamento de outros tecidos como intestino e
neurônio visando futuramente isolá-los dos mutantes estudados nesse projeto para determinar seus transcriptomas tecido-específicos.
Esses dados podem nos levar a descobrir quais fatores não autônomos são importantes para os fenótipos dos modelos com alterações nas mitocôndrias e na via de miRNAs.
Conclusões
Nesse trabalho observamos que há um grande remodelamento no proteoma de C. elegans mutantes para clk-1 e isp-1 e em nematoides superexpressando alg-1 ou dcr-1. Foi revelada uma grande sobreposição nas vias cujas proteínas estão alteradas dentre clk-1 e isp-1 que podem explicar parte do aumento em seus tempos de vida. Dentre essas vias estão as de biossíntese de aminoácidos e de
splicing alternativo.
Concluímos também que as vias de reprodução e desenvolvimento embrionário são potenciais candidatas a regularem o tempo de vida e resistência a estresse de C. elegans ao serem influenciadas por miRNAs aumentados em mutantes para clk-1 e isp-1 e em nematoides com superexpressão para
dcr-1 ou alg-1.
Nesse trabalho observamos também que um protocolo de lise de C. elegans publicado na literatura produz muitos debris e células mortas. Ao realizarmos uma adaptação no protocolo levando as células de C. elegans a serem liberadas em PBS com soro fetal bovino a viabilidade do material aumentou.
Com esse protocolo adaptado isolamos partículas GFP positivas de C. elegans com músculo fluorescente as quais apresentam tendência ao aumento de marcadores musculares e possibilitam a geração de uma biblioteca de sequenciamento de nova geração.
Sendo assim, esse trabalho melhorou uma técnica importante para o estudo de alterações tecido específicas em C. elegans e identificou diversas vias com potencial para influenciar o envelhecimento e resistência ao estresse do nematoide.
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