UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
THIAGO LEITE KNITTEL
ESTUDO DA INTERAÇÃO EM C. ELEGANS ENTRE A VIA DE
MIRNAS E A CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS
CAMPINAS 2019
ESTUDO DA INTERAÇÃO EM C. ELEGANS ENTRE A VIA DE
MIRNAS E A CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestre em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética Animal e Evolução.
Orientador: MARCELO ALVES DA SILVA MORI
CAMPINAS 2019
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO THIAGO LEITE KNITTEL E ORIENTADA PELO MARCELO ALVES DA SILVA MORI.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Marcelo Alves da Silva Mori
Profa. Dra. Fernanda Marques da Cunha
Prof. Dr. Pedro Manoel Mendes de Moraes Vieira
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico esse trabalho à minha família pelo todo apoio que me forneceram ao longo desses anos.
Gostaria de agradecer ao Prof. Dr. Daniel Martins-de-Souza, à Caroline Brandão Teles e ao Bradley Joseph Smith por terem realizado a técnica de espectrometria de massas descrita nesse projeto e auxiliado no processo de análise dos dados.
Gostaria de agradecer ao Prof. Dr. Alessandro dos Santos Farias e à Dra. Carolina Francelin-Rovaroto pelo auxílio na técnica de citometria de fluxo.
Gostaria de agradecer aos membros de minha banca de qualificação do mestrado Prof. Dr. Pedro Manoel Mendes de Moraes Vieira, Prof. Dr. Julio Cesar Batista Ferreira e Profa. Dra. Helena Cristina de Lima Barbosa Sampaio pela discussão e pelas ideias que ajudaram a enriquecer esse projeto.
Gostaria de agradecer ao Prof. Dr. Mário Henrique Bengtson e ao Erico Moreto Lins pelo auxílio na construção das bibliotecas de sequenciamento de nova geração.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
Gostaria ainda de agradecer à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) sob o processo nº 2017/03423-0, pela concessão da bolsa de mestrado.
Gostaria de agradecer ao Guilherme Tonon da Silva e ao Willian Goulart Salgueiro pelo auxílio na obtenção das amostras para proteômica.
Gostaria de agradecer aos membros do Laboratório de Biologia do Envelhecimento pelo auxílio nas discussões de resultados e em ideias para o projeto.
Gostaria de agradecer à UNICAMP por ter fornecido a infraestrutura necessária para a realização do projeto e aos Técnicos Administrativos em Educação do Instituto de Biologia da UNICAMP, em especial à Dra. Eliza Elisabeth Saviani, pelo auxílio técnico ao projeto.
Há uma tendência mundial de envelhecimento da população, fato que traz problemas socioeconômicos e de saúde pública. Alterações na função mitocondrial e na via de
microRNAs (miRNAs) podem interagir para retardar fenótipos associados ao envelhecimento, porém o mecanismo pelo qual isso ocorre permanece elusivo. O estudo da relação causal entre alterações nessas vias e o processo de envelhecimento é desafiador em mamíferos devido ao longo tempo de vida desses animais. Um modelo que permite esse tipo de estudo é o
Caenorhabditis elegans (C. elegans), dada à facilidade de manipulação genética do
organismo, seu tempo de vida curto e padrão de envelhecimento similar ao humano. Sendo assim, realizamos uma proteômica quantitativa com amostras de C. elegans apresentando mutações que levam a um estresse mitocondrial moderado ou com aumento na expressão de componentes da via de miRNAs. Essas linhagens de vermes foram identificadas como longevas e/ou resistentes ao estresse. Observamos alterações em vias de maneira exclusiva a uma linhagem ou comum a mais de uma, sendo algumas promissoras, como as de
“desenvolvimento embrionário e reprodução”, para explicar a interação entre miRNAs e estresses mitocondriais, ou a de “biossíntese de aminoácidos”, para explicar a longevidade dos mutantes mitocondriais. Essas vias podem ser estudadas para a identificação de novos mecanismos de controle do envelhecimento que têm o potencial de se tornarem alvos de drogas. Já foi demonstrado que células de um tecido podem atuar de forma determinante para coordenar o processo de envelhecimento do organismo. Sendo assim, buscamos isolar tecidos de C. elegans para compreender como os mutantes estudados nesse projeto afetam diferentes tipos celulares. Para isso, validamos em células musculares um método de isolamento de tecidos de C. elegans e construímos uma biblioteca de sequenciamento de nova geração com a amostra obtida. Isso permitirá o estudo das vias observadas nesse projeto de maneira tecido-específica.
There is a worldwide trend towards an increase of the age of the population, a fact that brings socioeconomic and public health problems. Mitochondrial stresses and the microRNA
(miRNA) pathway interact to delay phenotypes associated with aging, but the mechanism by which this occurs remains elusive. The study of the causal relationship between changes in these pathways and the aging process is challenging in mammals due to their long lifespan. A model that allows this type of study is the Caenorhabditis elegans (C. elegans), given the ease of genetic manipulation of the organism, its short life span and the aging pattern similar to that of humans. Thus, we performed a quantitative proteomic analysis with samples of C.
elegans presenting mutations that lead to mild mitochondrial stress or with increased
expression of components of the miRNA pathway. These worm strains exhibit increased longevity or stress resistance. We observed changes in pathways limited to a strain or common to more than one strain, some of these were promising to explain the interaction between miRNAs and mitochondrial stresses, such as “embryonic development and reproduction”, or to explain the longevity of mitochondrial mutants, such as “amino acid biosynthesis”. These pathways could be studied to identify new mechanisms of aging control that have the potential to become drug targets. It has already been shown that cells of a tissue can act in a determinant way to coordinate the aging process of the whole organism. Thus, we sought to isolate tissues of C. elegans to study how the mutants analyzed in this project affect different cell types. To do this, we validated in muscle cells a method of tissue isolation of C.
elegans and constructed a next generation sequencing library with the sample obtained. This
Sumário
Introdução ...11
Envelhecimento ...11
Mitocôndria e o controle do envelhecimento ...12
miRNAs e o controle do envelhecimento ...15
alg-1 e o processo de envelhecimento ...16
dcr-1 e o processo de envelhecimento ...17 Desenho Experimental ...18 Objetivos ...21 Objetivo Geral ...21 Objetivos Específicos ...21 Material e Métodos ...22 Manutenção de C. elegans ...22
Linhagens de C. elegans utilizadas ...22
Sincronização ...22
Proteômica Quantitativa ...23
Análise dos dados de Proteômica ...24
Isolamento das células de C. elegans ...25
Microscopia de Fluorescência ...26
Citometria de Fluxo e "Sorting" ...26
Manutenção das células 3T3-F442A ...27
Avaliação da Integridade e Quantidade do RNA...27
RT-qPCR ...28
Preparação da biblioteca para sequenciamento de nova geração ...29
Purificação do RNA poliadenilado ...29
Fragmentação, desfosforilação e polidenilação do RNA ...29
Síntese do cDNA com o sistema SMART...30
PCR para formação da biblioteca de sequenciamento e purificação de seu produto ...31
Determinação do número de ciclos para preparação da biblioteca ...32
Análise Estatística ...33
Resultados e Discussão ...34
Clk-1 ...37
Superexpressão de dcr-1 ...38
Superexpressão de alg-1...38
Efeitos comuns a mais de um mutante: ...39
Vias metabólicas ...39
Biossíntese de aminoácidos ...39
Splicing Alternativo ...39
Desenvolvimento embrionário e reprodução ...39
Isolamento de tecidos dos nematoides ...41
Conclusões ...58
Referências ...59
Apêndices ...65
Tabela Suplementar 1 ...65
Anexos ...75
Aprovação da pesquisa pela comissão de biossegurança ...75
Introdução
Envelhecimento
O envelhecimento pode ser definido como um acúmulo de danos que ocorre ao longo do tempo, levando a uma progressiva disfunção das células e tecidos, conduzindo a doenças e finalmente à morte 1.
Há uma tendência mundial de envelhecimento da população, que ocorre como consequência de taxas decrescentes de natalidade e mortalidade. Essa mudança decorre de avanços no planejamento familiar e na medicina.
Com relação ao planejamento familiar, a natalidade de diversos países tem sido abaixo da taxa de reposição, que é definida como o número de nascimentos por mulher suficiente para manter o tamanho da população. Até 2025 estima-se que 120 países apresentarão taxas de natalidade abaixo da de reposição 2.
Por outro lado, a taxa de mortalidade tem diminuído e se projeta que o número de pessoas com 60 anos ou mais no mundo suba de 810 milhões em 2012 (ou 11,5% da população) para dois bilhões em 2050 (ou 22% da população) 3.
Esse aumento do número de idosos na população vem associado a alguns problemas como o aumento dos gastos com previdência social e saúde e a diminuição na força de trabalho, tendo em vista que apenas 47% dos idosos e 23,8% das idosas exercem alguma atividade laboral 3.
Esses problemas são decorrentes, pelo menos em parte, do aparecimento de doenças incapacitantes, que acometem 60% dos indivíduos com mais de 60 anos 3. Dentre essas doenças, para as quais o envelhecimento é o principal fator de risco 4, estão o câncer, diabetes do tipo 2, doenças cardiovasculares e doenças neurodegenerativas.
Parte dos efeitos do envelhecimento se deve a defeitos em tecidos específicos e não a uma disfunção geral do organismo. Nesse sentido, foram realizados estudos em diversas espécies que demonstram que diferentes tecidos de organismos multicelulares influenciam e são influenciados pelo envelhecimento de maneira distinta.
Por exemplo, o padrão de metilação do DNA é alterado com o envelhecimento em ratos, humanos e camundongos e esta mudança difere entre diferentes tecidos 5–7. Além disso, células
musculares de Caenorhabditis elegans (C. elegans) perdem sua função mais rapidamente com o envelhecimento do que seus neurônios 8.
Outro exemplo dessa diferença tecidual no envelhecimento está no fato de que quando o complexo 1 de TOR (TORC1) é inibido no organismo como um todo pela droga rapamicina há um aumento no tempo de vida de camundongos 9. Consistentemente, quando o mesmo é nocauteado em adipócitos de camundongos há efeitos benéficos como maior tolerância à glicose e sensibilidade à insulina 10. Por outro lado, quanto o nocauteamento é realizado no músculo, efeitos deletérios como distrofia muscular e redução da capacidade oxidativa são observados 11. O mesmo tipo de pleiotropismo foi observado com relação ao receptor de insulina em alguns organismos, sendo que camundongos apresentando nocaute do receptor de insulina no tecido adiposo apresentam um maior tempo de vida 12–14.
Por muito tempo houve dúvidas de se era possível manipular a longevidade dos organismos. No entanto, recentemente foi demonstrado que mutações pontuais no genoma de C. elegans e camundongos 14,15 ou intervenções ambientais como a restrição calórica em C. elegans, camundongos e potencialmente primatas 16–18 podem estender o tempo de vida dos organismos.
Sendo assim, foi vislumbrada a possibilidade de se reduzir os impactos negativos do envelhecimento por meio de drogas que levem a um envelhecimento mais saudável, ou seja, a extensão do período da vida em que o organismo permanece livre de doenças crônicas 1, sendo também desejável que essas intervenções aumentem o tempo de vida dos indivíduos.
Para encontrarem-se tais fármacos se fazem necessários estudos aprofundados das vias moleculares que afetam o envelhecimento e como essas vias afetam cada tecido do organismo.
Mitocôndria e o controle do envelhecimento
Vias importantes no controle do envelhecimento estão presentes na mitocôndria. Essa organela apresenta uma disfunção com o passar do tempo levando a uma maior produção de espécies reativas de oxigênio (ROS do inglês: Reactive Oxygen Species) no seu interior e a uma menor capacidade respiratória 19.
A teoria de envelhecimento dos radicais livres propõe que as ROS geradas na mitocôndria resultam em danos nessa organela que levam a sua disfunção. Consequentemente, haveria um aumento na produção de ROS, em uma alça de retroalimentação positiva que levaria ao envelhecimento 20.
No entanto, experimentalmente se observou que camundongos com maior produção de ROS mitocondrial não necessariamente envelhecem prematuramente 21,22 e que animais com maior proteção contra essas moléculas também não vivem mais 23, levando ao questionamento da abrangência da teoria dos radicais livres para explicar o processo de envelhecimento.
Apesar disso, há evidências de que ROS influenciam o envelhecimento, sendo que essas moléculas parecem ter um efeito deletério ou benéfico quando presentes no citoplasma ou na mitocôndria, respectivamente 24. Esse fenótipo é dependente do grau do estresse sendo que uma dose moderada de paraquat, molécula que leva a um aumento de ROS mitocondrial 25, aumenta o tempo de vida de C. elegans 24 enquanto uma dose maior leva a morte do organismo 26.
De fato, há vias ativadas por um aumento moderado nos níveis de ROS no interior da mitocôndria que levam a efeitos benéficos para o organismo, como um aumento no tempo de vida de camundongos 27 e C elegans 28.
Tal fenótipo, que pode parecer estranho pelo fato de ROS levarem à oxidação das moléculas das células podendo danificá-las, é explicado pela comunicação da disfunção mitocondrial para o núcleo, levando à transcrição de genes para resolver o estresse que protegem as células de danos que vão além dos produzidos pelo indutor inicial 29. Essa comunicação por ocorrer pela ativação de fatores de transcrição por meio de mediadores como Ca2+, ROS e o balanço de NAD/NADH 30,31 ou por meio de proteínas que são transportadas da mitocôndria ao núcleo levando a mudanças na transcrição 32,33.
Há dois mutantes do nematoide C. elegans, com mutações hipomórficas nas proteínas codificadas por clk-1 e isp-1, que são muito utilizados para o estudo dessa via de longevidade induzida por ROS mitocondrial.
O mutante da proteína codificada por clk-1, uma hidroxilase mitocondrial necessária para a biossíntese de ubiquinona 34, apresenta uma diminuição na função da cadeia respiratória associada a um aumento no tempo de vida e redução de locomoção, reprodução e velocidade de desenvolvimento embrionário 35.
A ubiquinona é uma molécula que participa das reações de oxirredução que ocorrem na cadeia respiratória sendo sua ausência fatal para o verme. No entanto, o nematoide é capaz de absorver essa
molécula das bactérias de que se alimenta, compensando a mutação em clk-1. Os fenótipos são gerados porque a molécula produzida pelas bactérias é diferente da endógena e não é completamente funcional 34.
A mutação em heterozigose do gene ortólogo a clk-1 em camundongos, o Mclk1, também leva a um aumento no tempo de vida dos animais 27.
Outro mutante de C. elegans estudado apresenta defeito em um componente do complexo III da cadeia transportadora de elétrons codificado por isp-1, levando a um aumento no tempo de vida do animal devido a uma maior produção de superóxido mitocondrial 36,37.
Além do aumento no tempo de vida, essa mutação leva a um desenvolvimento cerca de duas vezes mais lento e a uma redução na produção de prole e defecação 38. Esses fenótipos provavelmente se devem à uma menor oferta energética às células.
O aumento no tempo de vida proporcionado pelas mutações em isp-1 e clk-1 requerem a ação do fator de hipóxia HIF-1 e da via de UPRmt39.HIF-1 é um fator de transcrição ativado por hipóxia cuja superexpressão promove um aumento no tempo de vida de C. elegans40. Já a via de UPRmt (do inglês:
mitochondrial unfolded protein response) é ativada pela presença de proteínas com defeito estrutural na
mitocôndria, promovendo a transcrição de chaperonas e proteases mitocondriais pelo núcleo para solucionar o estresse 41.
Mutações hipomórficas ou silenciamento de outros componentes da cadeia transportadora de elétrons também levam a um aumento do tempo de vida de C. elegans 42–44, demonstrando que o efeito observado não é específico para clk-1 e isp-1. Em contraste, mutações em gas-1 e mev-1, que afetam as atividades dos complexos I e II da cadeia respiratória, respectivamente, levam à diminuição no tempo de vida e da resistência à estresse oxidativo de C. elegans 45, demonstrando que não é todo estresse na cadeia respiratória que é benéfico para a longevidade. O fenótipo produzido provavelmente depende do nível do estresse que a mutação ocasiona.
Um aumento na longevidade em decorrência do silenciamento de componentes da cadeia respiratória também é observado quando a manipulação é limitada a neurônios em C. elegans, havendo ativação da via de resposta ao estresse mitocondrial em tecidos distintos. Tal fenótipo depende da secreção de moléculas pelos neurônios e da sinalização por Wnt nos tecidos alvo 46,47. Isso caracteriza uma função não-autônoma, o que reforça a importância de se investigar como cada tecido responde ao processo de envelhecimento de maneira individual e integrada.
Portanto, a resposta protetora desencadeada por defeitos na cadeia respiratória é uma via promissora para o desenvolvimento de fármacos para tratar os efeitos deletérios do envelhecimento, sendo importante entender sua atuação não autônoma no controle da longevidade.
miRNAs e o controle do envelhecimento
Outra via interessante a ser estudada no contexto do controle do envelhecimento é a de RNA de interferência (RNAi).
Essa via leva à produção de pequenas moléculas de RNA não codificadoras, dentre elas os microRNAs (miRNAs). Isso ocorre a partir da transcrição de moléculas de miRNAs primários que são processados no núcleo pela enzima Drosha para gerar miRNAs precursores. Esses são exportados para o citoplasma pela proteína Exportina-5 e clivados pela enzima Dicer para gerar um RNA dupla fita. Uma dessas fitas é degradada e a outra se torna o miRNA maduro, com cerca de 22 nucleotídeos48. O miRNA é então transferido para o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC, do inglês: RNA-induced
silencing complex), o qual guia a molécula para a região 3’-UTR do RNA mensageiro alvo com
sequências complementares ao seed do miRNA (nucleotídeos 2 a 8), levando à degradação do transcrito ou à inibição de sua tradução 49,50. Outras regiões do miRNA além do seed podem também influenciar a especificidade do pareamento 51.
A inibição da tradução pelo RISC ocorre na iniciação, via o impedimento da formação do ribossomo 80S por meio da interação do complexo com a proteína eIF6 52. Também há evidências de que o complexo pode interferir na etapa de elongação das proteínas 53.
A via de miRNAs é conservada evolutivamente, estando presente de leveduras até plantas e metazoários 54, sendo muito estudada em C. elegans. Foram descritos no miRBase (http://www.mirbase.org v.22.1) mais de 2600 miRNAs humanos, que tem como alvo cerca de 60% dos genes codificadores de proteínas 50.
A essas moléculas também têm sido atribuídas funções na manutenção da identidade e robustez celular, no desenvolvimento e na etiopatogênese de doenças e na proteção do organismo contra elementos genéticos móveis 55–58.
Tendo em vista a abrangência das funções dessas moléculas, não é surpreendente o fato de que as mesmas afetam o controle do envelhecimento, sendo que os miRNAs lin-4, 71, 238,
miR-239 e miR-246, por exemplo, afetam o tempo de vida e fenótipos associados ao envelhecimento em C.
elegans 59,60. Pelo menos alguns deles agem em vias importantes para o envelhecimento como a da insulina, HSF-1 e de checkpoints de dano ao DNA.
Os miRNAs também regulam fenótipos associados ao envelhecimento em Drosophila
melanogaster, espécie na qual a mutação em miR-14 reduz a expectativa de vida e afeta a resistência ao
estresse 61.
Já em mamíferos, há miRNAs que afetam a senescência, um fenótipo associado ao envelhecimento no qual a célula sai do ciclo celular e secreta citocinas, podendo prejudicar a função tecidual 62. A morte seletiva de células senescentes alivia alguns sintomas do envelhecimento 62.
O miR-34a e o miR-217 induzem senescência in vitro em células endoteliais progenitoras ou diferenciadas, respectivamente. Isso ocorre por meio da inibição de SIRT1, o que leva a níveis aumentados de FOXO1 acetilado, induzindo a senescência 63,64. Também há outros miRNAs que induzem a senescência 65.
Além disso, há miRNAs cuja expressão é preditiva do envelhecimento de C. elegans 66, humanos 67 e camundongos 68.
Portanto, os miRNAs são moléculas que apresentam padrão de expressão tecido-específica 69 e que influenciam o processo de envelhecimento, sendo importante seu estudo para entender os mecanismos de controle da longevidade.
alg-1 e o processo de envelhecimento
Um componente da via dos miRNAs que influencia o processo de envelhecimento em C. elegans é a proteína alg-1, um elemento conservado do RISC que se liga ao miRNA maduro e o guia ao RNA mensageiro alvo, levando à sua degradação ou inibição de sua tradução 48.
A expressão de alg-1 diminui com o envelhecimento 70 e seu silenciamento leva a desregulações nos níveis globais de miRNAs e uma diminuição do tempo de vida 71,72. Por outro lado, dados de nosso grupo demonstram que sua superexpressão leva a um aumento da resistência ao estresse térmico e oxidativo, fenótipo muito observado em mutantes longevos73.
A alg-1, portanto, é uma proteína conservada em humanos, que participa da via de miRNAs e que afeta fenótipos do envelhecimento em C. elegans.
dcr-1 e o processo de envelhecimento
Com o envelhecimento há uma diminuição nos níveis de expressão da maioria dos miRNAs em células mononucleares do sangue periférico de humanos 67, em tecido adiposo de camundongos 74 e em
C. elegans 75.
Uma possível explicação para esse fenômeno é uma diminuição dos níveis de expressão da enzima Dicer, que ocorre com o envelhecimento em C. elegans e no tecido adiposo de camundongos 74. Essa enzima converte pre-miRNAs em miRNAs e realiza um dos passos limitantes da biogênese dessas moléculas.
O nocauteamento do ortólogo de Dicer em C. elegans, dcr-1, leva à sensibilidade aos estresses térmico e oxidativo e diminui o tempo de vida 74. Por outro lado, a superexpressão de dcr-1 no intestino leva a um fenótipo de resistência aos mesmos estresses 74.
Importantemente, dados de nosso grupo demonstram que o silenciamento de dcr-1 induz a produção de ROS na mitocôndria e um aumento na expressão de sod-3, uma enzima antioxidante mitocondrial 76.
Além disso, nosso grupo descobriu que a longevidade induzida pela mutação em isp-1 e clk-1 dependem de dcr-1 76. Também foi realizado um sequenciamento de miRNAs nesses mutantes da cadeia respiratória e verificou-se um aumento global da expressão de miRNAs, consistente com a indução da via de biogênese de miRNAs nesses animais 76.
Portanto, o estudo de como dcr-1 e alg-1 influenciam o envelhecimento é importante para a compreensão desse processo e pode revelar como a via de miRNAs e a via de estresse mitocondrial se comunicam para regular a longevidade.
Desenho Experimental
Estudos para estabelecer uma relação causal entre alterações genéticas e o envelhecimento são praticamente inviáveis em humanos, devido à impossibilidade ética de se realizar manipulação genética nessa espécie, e desafiadores em camundongos, pois esses apresentam expectativa de vida de aproximadamente 28 meses 77, inibindo os estudos em larga escala. Como alternativa para sanar esses problemas, é utilizado um modelo invertebrado para estudos do envelhecimento, o nematoide C. elegans.
C. elegans é um pequeno nematoide de vida livre, com cerca de 1 mm de comprimento, que tem
sua população constituída de 99.9% de hermafroditas. Essa espécie é um bom modelo para o estudo do envelhecimento por diversos motivos: I) o nematoide vive apenas 20 dias em média em condições de laboratório 15 e apresenta um tempo de geração curto, de apenas três dias 78, permitindo que estudos de determinação do tempo de vida sejam realizados com rapidez e em larga escala; II) há facilidade de se avaliar a função de genes pela possibilidade de se realizar silenciamento gênico apenas alimentando o verme com bactérias que expressam RNA dupla fita complementar ao gene de interesse; III) estudos genéticos também são facilitados pela rapidez de se obterem mutantes a um baixo custo para perda de função e superexpressão de diversos genes, sendo fácil realizar cruzamento entre os animais obtendo-se linhagens com diversas mutações; IV) o verme apreobtendo-senta manuobtendo-seio fácil e relativamente barato no ambiente de laboratório; V) o nematoide é transparente, permitindo a determinação da localização e da quantidade de proteínas ligadas a marcadores fluorescentes facilmente e VI) seu padrão de envelhecimento se assemelha ao de vários mamíferos, incluindo ao dos humanos 79.
Apesar das vantagens citadas, a utilização de C. elegans para o estudo do envelhecimento humano apresenta limitações como a ausência, no nematoide, de características presentes em mamíferos como o sistema circulatório e respiratório ou órgãos complexos como o rim.
No entanto, apesar das diferenças do nematoide para humanos, em C. elegans já foram identificados diversos genes que regulam a longevidade de maneira conservada evolutivamente em mamíferos. Um exemplo disso é o fator de transcrição FOXO3A, que está associado com longevidade em humanos 80 e é ortólogo ao daf-16 de C. elegans, uma das primeiras proteínas identificadas a controlar o tempo de vida dos vermes 81.
Sendo assim, decidimos utilizar o nematoide para nosso estudo, que visa uma melhor compreensão de como estresses na cadeia respiratória e a via de miRNAs interagem para influenciar o envelhecimento.
Para isso, utilizamos a técnica de proteômica quantitativa. Essa metodologia utiliza a espectrometria de massas para a obtenção de dados da expressão relativa de inúmeras proteínas em uma amostra biológica. Esses dados são importantes, tendo em vista que frequentemente as proteínas são a parte funcional das vias metabólicas, sendo a informação de seus níveis de expressão valiosa para a compreensão de um fenótipo.
A técnica da proteômica quantitativa já está bem estabelecida em C. elegans, já tendo sido realizada em nematoides em diversas condições como envelhecimento 82, defeitos no reparo de DNA 83 e tratamentos com drogas 84.
Em nosso estudo utilizamos essa técnica com amostras de proteína extraída de nematoides que apresentam defeitos na cadeia respiratória, o clk-1 (e2519) e o isp-1 (qm150), e de vermes com superexpressão de componentes da via de miRNAs: alg-1 ou dcr-1.
Com os dados obtidos selecionamos proteínas com expressão alterada (p < 0.05 por ANOVA de uma via) e as inserimos no software DAVID 85,86 para verificar quais vias se encontram enriquecidas nos diferentes mutantes.
No entanto, a proteômica quantitativa de um organismo inteiro falha em obter informações sobre como diferentes tecidos são afetados pelas intervenções estudadas. Tendo em vista que, tanto os defeitos na cadeia respiratória quanto a via de miRNAs apresentam efeitos não autônomos sobre a longevidade 46,74, é importante entender como os diferentes tipos celulares são afetados por essas intervenções.
Uma alternativa para obter essas informações é isolar os tecidos de C. elegans e realizar uma proteômica quantitativa com essas amostras. A separação de tecidos do nematoide é desafiadora por se tratar de um organismo pequeno, com apenas cerca de 1000 células 87. Tal problema foi solucionado recentemente com uma técnica baseada em uma lise dos nematoides seguida por cell sorting que permite o isolamento de tipos celulares específicos de C. elegans 88,89.
No entanto, ao realizarmos o isolamento de células musculares com esta técnica, verificamos que não foi obtido material suficiente para uma análise de proteômica quantitativa. Isso nos levou a
buscar a realização de um sequenciamento de RNA para quantificar os transcritos expressos nos diferentes tecidos.
O sequenciamento de nova geração permite a quantificação do RNA mensageiro presente em pequenas quantidades de material, sendo possível realizar tal técnica com uma amostra obtida de apenas uma célula 90. Além disso, já foi demonstrada a viabilidade de se realizar essa técnica com tecidos de C. elegans isolados 89,91.
Sendo assim, buscamos isolar tecidos de C. elegans e preparar essas amostras para uma análise de transcriptoma. A padronização dessa técnica em nosso laboratório permitirá uma análise de como a cadeia respiratória e a via de miRNAs afetam os diferentes tipos celulares.
Objetivos
Objetivo Geral
Identificar vias que têm o potencial de explicar como a biogênese de miRNAs e o estresse mitocondrial promovem longevidade e resistência ao estresse em C. elegans.
Objetivos Específicos
1- Extrair proteína de animais no dia 0 da vida adulta de linhagens de C. elegans com mutações em proteínas envolvidas na cadeia respiratória (clk-1 e isp-1) ou com superexpressão de componentes da via de miRNAs (dcr-1 e alg-1) e de seus respectivos controles.
2 – Determinar quais proteínas são diferencialmente expressas por meio de proteômica quantitativa. 3 – Determinar quais vias se encontram enriquecidas dentre as proteínas diferencialmente expressas. 4 - Obter as linhagens necessárias para o isolamento de tecidos de C. elegans e validar seus fenótipos de expressão de GFP de maneira tecido específica.
5 - Validar se com o protocolo de lise de nematoides descrito na literatura são obtidas células isoladas e viáveis.
6 - Isolar tecidos de C. elegans por meio de cell sorting e validar a identidade das células obtidas por meio de RT-qPCR.
Material e Métodos
Manutenção de C. elegans
Os nematoides foram mantidos em incubadoras a 20ºC dentro de placas de Petri de 150 mm com meio semissólido Nematode Growth Medium [NGM – triptona 0.25%, cloreto de sódio 0.3%, cloreto de cálcio 1 mM, sulfato de magnésio 1 mM, tampão de potássio fosfato (2.7 g/l KH2PO4, 0.89 g/l K2HPO4) pH 6.0 25 mM, colesterol 5 µg/mL, agar 1.7%] contendo uma camada de bactéria E. coli OP50-1, a qual foi inoculada em LB e incubada a 120 rpm por 12 a 16 horas e teve a densidade óptica (OD) a 600 nm medida. De acordo com o valor obtido, a bactéria foi concentrada para OD de 10 por meio da centrifugação a 2600 x g por 15 minutos a 20ºC seguida da remoção do excesso de sobrenadante, mantendo apenas o necessário para a OD de 10. A bactéria foi pipetada nas placas de NGM (1.5 mL) e deixada para secar em um fluxo laminar.
Linhagens de C. elegans utilizadas
As linhagens de C. elegans utilizadas no projeto foram obtidas do Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ou geradas por nosso laboratório (MAM1 e MAM13.2 74). Utilizamos as linhagens: N2 Bristol - linhagem selvagem; AGD885 - expressa GFP no músculo sob comando do promotor myo-3; SJ4144 – expressa GFP no intestino sob comando do promotor ges-1; CB4876 – apesenta mutação em clk-1, alelo
e2519; MQ887 – apresenta mutação em isp-1, alelo qm150; MAM1 –apresenta os marcadores pUN24
(pY66H1B.3::Y66H1B.3::GFP) (Kovacevic e Cram, 2010) e pJK590 (plag-2::GFP); MAM13.2 - apresenta superexpressão de dcr-1 fusionada a GFP sob o comando do promotor de dcr-1 e os marcadores pUN24 (pY66H1B.3::Y66H1B.3::GFP) (Kovacevic e Cram, 2010) e pJK590 (plag-2::GFP); PE255 – apresenta fenótipo roller devido ao transgene rol-6 (su1006) e expressa GFP sob comando do promotor de sur-5; CT20 - apresenta superexpressão de alg-1 sob o comando do promotor de alg-1 e apresenta fenótipo roller devido ao transgene rol-6 (su1006). Todos as linhagens não selvagens foram cruzadas com o N2 Bristol de 4 a 6 vezes para remoção de mutações no background.
Hermafroditas grávidas foram lavadas das placas de NGM com água estéril. Foram acrescentados 0,5 mL de NaOH 5 M e 1 mL de hipoclorito de sódio 5%, completando o volume com água estéril para 5 mL. Após homogeneização em vórtex por aproximadamente 10 minutos, ou até os vermes dissolverem, a amostra foi centrifugada a 300 x g por 1 minuto levando os ovos a precipitar. Os ovos foram lavados com 15 mL de ddH2O estéril e pipetados em placas de NGM com comida. Como apenas os ovos resistem ao tratamento e todos eclodem depois de algumas horas do plaqueamento, a cultura foi considerada sincronizada.
Proteômica Quantitativa
Para a proteômica quantitativa, uma placa de NGM de 150 mm com comida em abundância contendo cerca de dois mil C. elegans adultos no dia 0 foi lavada com M9 (3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O para 1 litro) e os vermes foram coletados em um eppendorf de 1.5 mL. Os nematoides foram então lavados 5 vezes com M9 para remoção de bactérias e o precipitado foi congelado em nitrogênio líquido e armazenado em um freezer a -80 °C. O experimento foi realizado em triplicatas independentes.
O precipitado de vermes foi descongelado em gelo e foram adicionados imediatamente 200 µL de tampão de lise (1.5 mL SDS 20%, 5 mL glicerol, 1.5 mL Tris-HCl pH 6.8, 1.5 mL ddH2O, 3.5 µg bromofenol blue) com inibidor de protease (cOmplete, Roche). As amostras foram maceradas com um pistilo em gelo por 5 minutos, incubadas por 30 minutos a 4°C e sonicadas com um sonicador de ponta 5 vezes por 20 segundos em gelo.
O lisado foi então incubado por 30 minutos a 4°C, 10 minutos a 95 °C, centrifugado a 20.000 x g por 10 minutos a 4°C e o sobrenadante foi aplicado em um gel de poliacrilamida de 12 %. As amostras foram corridas em um sistema de eletroforese (Mini-PROTEAN, Bio-Rad) em tampão de corrida (3g de TRIS BASE, 14,4g glicina, 10mL SDS 10% e ddH2O para 1 litro) a 100 V até a marcação do azul de bromofenol atingir a metade do gel. Então foi cortado um pedaço da poliacrilamida do início do poço de cada amostra até a marcação em azul. A alíquota de gel foi fragmentada em pequenos pedaços e transferida para um eppendorf de 1.5 mL.
Esses fragmentos de gel foram lavados com 500 µL de 50% ACN em bicarbonato de amônia (AmBic) 50 mM por 5 minutos. Foram adicionados 100 µL de DTT 10 mM em 50mM AmBic e o
tubo foi mantido por 30 minutos a 80 °C com tal solução para redução das proteínas. Foram então adicionados 100 µL de iodacetamida 55 mM em 50 mM AmBic e a amostra foi mantida 20 minutos em temperatura ambiente no escuro para alquilação dos resíduos de cisteína das proteínas.
A amostra foi então lavada duas vezes com 200µL de acetonitrila (ACN) 100% por 10 minutos e colocada em um Speed Vac para secar os pedaços de géis por 40 minutos. Foram então adicionados 50 µL de uma solução de tripsina 10 ng/µL em 50 mM AmBic pH 8.0 (V5111, Promega Sequencing Grade Modified Trypsin) aos pedaços de gel e o tubo foi mantido a 37°C por 16 horas para digestão das proteínas em peptídeos.
Os tubos foram centrifugados para coleção das gotículas da tampa e foram adicionados 50 µL de 50 mM AmBic. O tubo foi mantido em temperatura ambiente por 20 minutos para os peptídeos passarem do gel para a solução e todo seu volume foi transferido para um microtubo de coleta de 1.5mL contendo 50 µL de 50% ACN e 5% de ácido fórmico em água, restando apenas os pedaços de gel.
No tubo contendo os pedaços de gel foram adicionados 50 µL de 50% ACN e 5% ácido fórmico em água para serem removidos os peptídeos restantes no gel. A solução foi mantida por 20 minutos e o líquido foi transferido para o tubo de coleta. O conteúdo desse tubo foi sonicado duas vezes por 5 minutos, seco no Speed Vac e guardado à -20°C.
As análises por LC-MS/MS foram realizadas com a ressuspensão da mistura de peptídeos em 15 μL de ácido fórmico a 0,1%. 4,5 μL deste volume foram analisados no espectrômetro de massas LTQ Velos Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) conectado ao sistema de cromatografia líquida EASY-nLC (Proxeon Biosystem) através da fonte de nanoeletrospray (Proxeon). A investigação dos dados da proteômica foi realizada utilizando o ProteinLynx Global SERVER (PLGS) para identificações, enquanto que Progenesis QI for Proteomics foi usado para realizar as análises qualitativas e quantitativas por label-free. Foram selecionados peptídeos com score >3 e
maximum error ppm > 20.
Análise dos dados de Proteômica
Os grupos foram comparados da seguinte maneira: N2 Bristol como controle do CB4876 e MQ887; MAM1 como controle no MAM13.2 e PE255 como controle do CT20.
As proteínas com diferença estatística na expressão, determinada como p < 0.05 em análise por ANOVA, foram inseridas no software DAVID 85,86. Selecionamos na lista de vias geradas pelo
software as com um valor de p menor que 0.05 para análise.
Isolamento das células de C. elegans
Foi preparada uma solução fresca de pronase (Sigma, P6911) 20 ou 5 mg/mL em ddH2O. As lavagens desse protocolo foram realizadas em uma microcentrífuga de bancada com um fast spin de cerca de 600 x g. Todas as etapas foram realizadas à temperatura ambiente.
Para o teste da influência da osmolaridade e pH da solução de enzima na viabilidade celular dissolvemos a enzima à 5 ou 20 mg/mL em DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium High glucose – Cultilab), PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, and 2 mM KH2PO4) ou egg buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3, osmolaridade ajustada para 340 mOsm com sacarose).
Três placas de 150 mm de vermes adultos no dia 0 sincronizados com alimento em abundância foram lavadas com uma solução de M9 (3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O para 1 litro) e os vermes passados para um tubo de 1,5 mL. Os vermes foram lavados 5 vezes com M9 e uma vez com 500μL de tampão de lise (DTT 200mM, SDS 0.25%, HEPES 20 mM pH 8.0, sacarose 3%). 750 μL de tampão de lise foram adicionados e mantidos por 6,5 minutos. Os nematoides foram então lavados rapidamente 5 vezes com M9 e 500 μL da solução de pronase foram adicionados e mantidos por 15 minutos.
No protocolo utilizado inicialmente, a solução de nematoides em pronase foi pipetada contra o fundo do tubo cerca de 30 vezes a cada 2 minutos com uma pipeta de 200 μL e, após 15 minutos, foram adicionados 250 μL de tampão fosfato (PBS) com 2% de soro fetal bovino (SFB) inativado por calor para interromper a reação. O lisado foi então filtrado em um cell strainer de 40 μm para a remoção de grandes pedaços de vermes.
Já no protocolo que desenvolvemos nesse projeto, os vermes foram incubados 15 minutos com a pronase sem estímulos mecânicos, com o tubo de lado para não se formar um precipitado grande de vermes que impediria o acesso da enzima à parte dos nematoides.
Após essa incubação, o tubo foi deixado de pé para os C. elegans decantarem para o fundo do tubo por gravidade e a enzima foi removida cuidadosamente para não se perder os vermes. Foram adicionados 500 μL de uma solução de PBS com 2% de SFB inativado por calor para interromper a reação. Essa solução foi pipetada 30 vezes contra o fundo do tubo com uma pipeta de 200 μL para lisar o restante dos vermes. O lisado foi então filtrado em um cell strainer de 40 μm para a remoção de grandes pedaços de vermes.
Para alguns dos experimentos houve uma filtragem subsequente do lisado por um cell strainer de 5 μm.
Microscopia de Fluorescência
Para a microscopia de fluorescência foi utilizado o aparelho Cytation 5 com aumentos de 20 ou 100 vezes e filtros para GFP, Hoescht 33342 e iodeto de propídeo.
Para verificar a viabilidade das células isoladas de C. elegans o material foi exposto a Hoescht 33342 1 µg/mL e Iodeto de Propídeo 1 µg/mL por 10 minutos e transferido para uma placa de 6 poços, onde foi realizada a microscopia.
Para a validação do padrão de expressão do transgene de GFP muscular e intestinal, C. elegans (AGD885 e SJ4144) adultos no dia 0 de vida foram transferidos para uma placa de 96 poços com 100 µL de M9 e fotografados.
Para a observação de que células do interior do nematoide se encontravam viáveis foi utilizado o aparelho Zeiss Axio Observer.Z1 com a câmera Axio 506 Color utilizando aumento de 630X e filtros para GFP, Hoescht 33342 e iodeto de propídeo.
Citometria de Fluxo e "Sorting"
A análise dos lisados de C. elegans foi realizada no citômetro de fluxo FACSVerse (BD Biosciences) com o software BD FACSuite™. Foram utilizadas 10.000 células de cada condição para se obter os parâmetros de granulosidade, tamanho e intensidade relativa de fluorescência.
Para testar a viabilidade celular foram realizadas colorações com 7AAD (7-Aminoactinomycin D) 1 µg / mL por 30 minutos em gelo ou com Iodeto de Propídeo 1 µg/mL aplicado imediatamente antes das amostras seres injetadas no citômetro à temperatura ambiente. Esses corantes são internalizados por
células mortas e apresentam fluorescência característica. Como controle positivo para o 7AAD foi utilizado um lisado de nematoides tratado com um choque de calor de 60ºC por 15 minutos, que leva à morte celular.
O Cell Sorting foi realizado no aparelho FACS ARIA III. Foram isoladas 20-40.000 células selecionadas por 3 gates, o primeiro exclui partículas com alto valor de Forward Scatter e Side Scatter, correspondentes aos ovos de C. elegans, o segundo exclui grumos de células, que se encontram fora de uma faixa linear em um gráfico da área pela altura do sinal de Forward Scatter, e o terceiro seleciona células GFP positivas em relação ao lisado de um verme não marcado.
Uma alíquota de células foi isolada em PBS com 2% de soro fetal bovino e injetada no aparelho FACS ARIA III para análise da qualidade do sorting. O restante das células foi coletado diretamente em Trizol® Reagent (Invitrogen).
Manutenção das células 3T3-F442A
As células foram cultivadas em incubadora a 37°C, com umidade controlada e 5% de CO2. O meio de cultura utilizado foi o DMEM com alta glicose (Cultilab D0620) com 10% de soro fetal bovino (Sigma-Aldrich) e 1% de Penicilina/Estreptomicina (10000 Units/ml Penicilina, 10000 µg/ml Estreptomicina). As células foram tratadas com tripsina (0,25% Tripsina-EDTA – Life Technologies 25200), passadas para um tubo cônico de 15 mL e centrifugadas à 300 g por 5 minutos. A tripsina foi removida e as células foram ressuspensas em PBS e transferidas para um tubo de citometria à 4ºC.
Avaliação da Integridade e Quantidade do RNA
Para a avaliação da integridade do RNA foi utilizado um gel de agarose 1% em TAE (Tris Base 40 mM, EDTA 10 mM, e 1.1 mL de ácido acético glacial para 1 litro de solução) suplementado com Sybr Safe 1X (Invitrogen). O RNA foi adicionado a uma solução de loading buffer (5% de glicerol, 0.04% de bromofenol blue e 0.04% de xileno cianol) e aplicado nos poços do gel. As bandas
correspondentes aos RNAs ribossomais 18S e 28S foram observadas para se avaliar a integridade do RNA. A imagem foi revelada em um sistema de Gel Doc (Bio-Rad). A intensidade da banda do RNA ribossomal 18S foi determinada pelo software ImageJ e o background foi subtraído para se obter uma quantificação relativa do RNA.
RT-qPCR
Ao lisado celular coletado em Trizol foi adicionado 1/5 (v/v) de clorofórmio e o tubo foi agitado vigorosamente. Após 10 minutos de repouso à temperatura ambiente as amostras foram centrifugadas a 12.000 x g, por 15 min à 4°C. A fase incolor aquosa superior do tubo, contendo o RNA, foi transferida para outro tubo, no qual foi realizada a precipitação do RNA à -20°C overnight em presença de álcool isopropílico 1/1 (v/v), 15 µg/mL de GlycoBlue (ThermoFisher) e 0.3 M de acetato de sódio. A amostra foi centrifugada a 12.000 x g, 10 min, 4°C e o sobrenadante foi removido. O precipitado foi lavado com etanol 75%, passado no vortex rapidamente e centrifugado a 7.600 x g, 5 min, 4°C. O sobrenadante foi removido, o precipitado foi seco e ressuspenso em água estéril. Para realizar a transcrição reversa utilizamos o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (AppliedBiosystems) de acordo com o protocolo do fabricante utilizando a maior quantidade possível de cDNA após normalizar sua concentração de acordo com a quantificação por densitometria do gel de integridade. Após a síntese dos cDNAs, foi quantificada a expressão dos genes de interesse por meio de PCR em tempo real. Foram utilizados na reação 250 nM de cada primer (sense e antisense), o cDNA e 1x Maxima SYBR-Green Master Mix, para um volume final de reação de 6 μL. A expressão gênica foi avaliada em um equipamento CFX384 (BioRad) com as seguintes especificações: 95°C10 min, e 40 ciclos de 95°C -15s, 60°C -30s, 72°C -30s. Utilizamos dois poços sem o cDNA como controle para amplificações inespecíficas da reação. Em nossos experimentos utilizamos primers padronizados com sequências dos nossos genes de interesse e de um gene constitutivo como controle endógeno, o his-10. Os dados de expressão gênica foram calculados como 2-ΔCt , sendo ΔCt = Ctalvo-Cthis-10.
Os genes medidos para validar a identidade das células isoladas foram: ges-1 (intestino), unc-45
e myo-3 (músculo), myo-2 (faringe) e GFP. Os primers utilizados para medir esses genes foram:
Ges-1 Forward: ACTTCGAAGCAACTCGCAGA Reverse: GTCCCAGTTGTCCATCCCTG Myo-2 Forward: GGAAGACTTGCGTGACCAGA Reverse: TCTTTTCAACACGGCGCTTG Myo-3 Forward: ACCATGTTCCAATCCCGCAT Reverse: TGCACCAAGCACGAACATTG Unc-45 Forward: TCTTTCCCTGGACAACGAGC Reverse: GCTTGCCAAGTTGGTGAGTG
GFP Forward: CAAAGATGACGGGAACTACAA Reverse: TTGTGTCCAAGAATGTTTCC His-10 Forward: GCAATTCGTCGTCCGC Reverse: GACTCCACGGGTTTCCT
Preparação da biblioteca para sequenciamento de nova geração
Purificação do RNA poliadenilado
O RNA extraído com trizol teve seu volume ajustado para 50 µL com água livre de RNAses, foi denaturado a 65°C por 5 minutos e colocado em gelo para evitar sua renaturação. 50 uL de Dynabeads Oligod(T) (Thermo Fisher) foram lavadas, ressuspendidas em 50 uL de Binding Buffer (20mM Tris HCl pH 7.5, 1M LiCl e 2mM EDTA) e adicionadas ao RNA. A mistura foi incubada com rotação à temperatura ambiente por 5 minutos para hibridização do oligod(T) das beads com a cauda poli(A) dos RNAs mensageiros presentes na amostra. As beads foram capturadas em um magneto Dynal e o líquido foi removido, eliminando RNAs não poliadenilados.
As beads foram então lavadas duas vezes com Washing Buffer (10mM Tris-HCl pH7.5 0.15M LiCl e 1 mM EDTA) com auxílio do magneto e ressuspendidas em 20 µL de Elution Buffer (5 mM Tris HCl pH 8.5). O híbrido beads-RNA foi então denaturado a 65°C por 5 minutos. O tubo foi colocado no magneto e o sobrenadante com o RNA poliadenilado foi transferido para outro tubo.
Fragmentação, desfosforilação e polidenilação do RNA
O RNA obtido foi quebrado em pedaços de cerca de 40 a 380 nucleotídeos com uma
fragmentação alcalina. Nesse protocolo 20 µL do RNA foram adicionados ao mesmo volume de um tampão de fragmentação [40mM Tris-OAc, 100mM KOAc, 30mM Mg(OAc)2] e a mistura foi mantida à 95°C por 2 minutos e 30 segundos. A reação foi interrompida com a imersão do tubo em gelo e com a adição de 4,4 µL de EDTA 0.5 M. O RNA obtido foi purificado com uma coluna RNeasy (QIAGEN) de acordo com as instruções do fabricante.
Os fragmentos gerados tiveram seu fosfato na região 3’ removido com a enzima T4
polynucleotide kinase (Thermo Fisher) em um tampão adequado (70 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 e 5 mM DTT). A reação foi realizada a 37°C por uma hora e a enzima foi inativada por temperatura em 20 minutos a 65°C.
O RNA desfosforilado foi poliadenilado adicionando-se ao tubo 2U da enzima Poly(A) RNA
Polymerase, (Thermo Fisher) 250 mM de NaCl e 1 mM de rATP. A reação ocorreu a 37°C por 30
minutos e a enzima foi inativada por temperatura a 65°C por 20 minutos.
Síntese do cDNA com o sistema SMART
O RNA poliadenilado foi purificado utilizando-se do kit RNA Clean & Concentrator (ZYMO research) segundo as instruções do fabricante com eluição em 9 µL. Esse material foi utilizado com molde para síntese do cDNA com o sistema SMART. Nele são adicionados adaptadores nas duas pontas do cDNA durante a reação de transcrição reversa.
Um resumo do funcionamento do sistema SMART se encontra no esquema abaixo. A transcrição reversa é realizada utilizando-se de um primer contendo o adaptador da Illumina e uma sequência de oligod(T), a qual se anela à cauda poli(A) adicionada nos fragmentos de RNA. Assim o primeiro adaptador da Illumina é adicionado na região 5’ do cDNA.
Quando a enzima Superscript II chega ao fim do transcrito, as condições da reação levam a mesma a adicionar uma cauda de citosina na região 3’ do cDNA. Isso torna possível o anelamento de um segundo primer, contendo um adaptador da Illumina e uma cauda de guanidina, sendo a última base da cauda um locked nucleic acid, contendo uma modificação que aumenta sua afinidade pela cauda de citosina do cDNA. Assim, a enzima Superscript II troca de molde para o primer e o adaptador da Illumina é adicionado à região 3’ do cDNA.
Para a reação de transcrição reversa com o sistema SMART, 9 µL do RNA eluído foram adicionados a 1 µL de Oligo(dT) 3’ Adapter Primer (10 µM) e a solução foi mantida a 72°C por 3 minutos para denaturação do RNA e do primer. Foram adicionados 9 µL do mix de RT (4 µl de 5X First-Strand Buffer, 2 µl de 0.1 M DTT, 6 mM de MgCl2, 1 μL de dNTP Mix 10 mM e 200U de Superscript II) e a solução foi aquecida a 20 °C por 3 minutos para anelamento do oligo d(T) primer (10 µM) ao RNA. O tubo foi mantido por 1 minuto a 25, 30, 37 e 42°C e foi adicionado 1 µL do primer Template 5’ Adapter à reação, que foi mantida a 42°C por 60 minutos para elongação do cDNA. A enzima foi então inativada por temperatura a 70°C por 15 minutos.
Reverse Transcription Oligod(T) Adapter:
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNTTTTTTTTTTTVN Reverse Transcription Template Adapter:
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCrGrG+G N indica onde está inserido o barcode que identifica as amostras.
Figura 1 - Esquema do sistema SMART para síntese de cDNA. Adaptado de Picelli et al. (2014).
PCR para formação da biblioteca de sequenciamento e purificação de seu produto
O cDNA foi utilizado como molde para uma reação de PCR na qual o material foi amplificado e foi adicionado o restante do adaptador para o sequenciamento da Illumina, que estava contido nos
primers da reação. 1.25 µL de cDNA foram adicionados à Phusion High-Fidelity Polymerase (NEB)
em seu buffer com um volume final de reação de 50 µL e 0.5 µM de cada primer. A amostra foi inserida em um termociclador com um programa de 98°C por 2’ e 21 ciclos de 98°C/15’’, 65°C/30’’, 72°C/1’. Para o teste de ciclos foram coletadas amostras durante esse PCR em diferentes etapas.
Os primes utilizados para o PCR foram: PE PCR Primer:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT Index PCR Primer:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG N indica onde está inserido o barcode que identifica as amostras.
A amostra obtida no PCR foi purificada para remoção de primers, dímeros de primers e bibliotecas derivadas de fragmentos pequenos de RNA. Para isso, foram utilizadas AMPure XP beads (Beckman Coulter), as quais realizam uma seleção por tamanho do DNA. No caso de nosso protocolo a reação foi otimizada para exclusão de fragmentos menores que 200 nucleotídeos.
Para isso, foram adicionados 50 µL de AMPure XP beads ao produto do PCR. A mistura foi incubada por 5 minutos para hibridização do DNA com as beads e essas foram capturadas em um magneto. As beads foram lavadas duas vezes com 180 µL de etanol 70% e foram adicionados 20 µL de
Elution Buffer (Tris-HCl 5 mM pH 8.5) para eluição do DNA. A mistura foi mantida por 2 minutos à
temperatura ambiente e as beads foram capturadas em um magneto. O sobrenadante com os fragmentos maiores que 200 nucleotídeos foi transferido para outro tubo, onde o procedimento de limpeza com
AMPure XP beads foi repetido, obtendo-se a biblioteca final para o sequenciamento de nova geração da
Illumina.
Determinação do número de ciclos para preparação da biblioteca
Amostras foram removidas durante o PCR de amplificação da biblioteca de sequenciamento após diferentes números de ciclos. As alíquotas foram injetadas em um gel de agarose de 2.5% em TBE (5.4g de tris base, 2.75g de ácido bórico e 2 mL de EDTA 0.5M para 1 litro) contendo Sybr Safe e a corrida foi realizada a 80V por 80 minutos. O gel foi revelado em um sistema de Gel Doc. A reação foi considerada saturada quando não houve aumento na intensidade do arraste acima de 200 nucleotídeos no gel, correspondente à biblioteca, entre um ciclo e o seguinte.
Análise Estatística
Os dados foram expressos como média ± Erro Padrão de Média. As diferenças entre os grupos no RT-qPCR foram analisadas por teste t não pareado. Na proteômica, a abundância das proteínas entre um grupo e seu controle foram comparadas por ANOVA de uma via. Foram consideradas diferenças significativas quando p < 0.05.
Resultados e Discussão
Proteômica
Obtivemos dados de proteômica de C. elegans mutantes para isp-1 ou clk-1 e de nematoides com superexpressão de dcr-1 ou alg-1. Foi obtida uma grande cobertura do proteoma, tendo sido identificadas em torno de 2800 proteínas com pelo menos 1 peptídeo único em todas as linhagens. Observamos um intenso remodelamento no proteoma desses mutantes, com 10-20% das proteínas (10,6% do alg-1 o/e; 15,8% do dcr-1 o/e; 17,5% do clk-1 e 20,3% do isp-1) detectadas apresentando um aumento ou diminuição com fold-change maior que 2 em relação aos seus respectivos controles (Figura 1).
Figura 1 – Há um intenso remodelamento no proteoma dos modelos estudados nesse projeto - Histograma mostrando a comparação da expressão de proteínas entre linhagens controle de C. elegans e mutantes para clk-1 ou isp-1 ou com superexpressão de dcr-1 (dcr-1 o/e) ou de alg-1 (alg-1 o/e). Foi calculado o fold change de cada proteína dos mutantes em relação a seus controles e o valor obtido foi convertido para escala logarítmica de base 2 e inserido no eixo x. Em azul estão indicadas as proteínas com fold-change > 2. n = 3.
Foram detectadas diferenças estatísticas (p < 0.05) na expressão de 211 proteínas dos nematoides
isp-1 (61 diminuídas e 150 aumentadas), 116 dos clk-1 (41 diminuídas e 75 aumentadas), 33 dos
superexpressão de alg-1 (24 diminuídas e 9 aumentadas) e 84 dos superexpressão de dcr-1 (39 diminuídas e 45 aumentadas) em relação a seus controles (Tabela suplementar 1). Interessantemente, observamos uma grande sobreposição entre as proteínas alteradas nos mutantes para clk-1 e isp-1, com 41 proteínas em comum sendo que surpreendentemente, todas se encontram alteradas no mesmo sentido em ambos os mutantes (Tabela suplementar 1).
Analisamos os dados obtidos inserindo as proteínas estatisticamente alteradas (p < 0.05) no
software DAVID 85,86, o qual nos retornou uma lista com as vias enriquecidas nos diferentes mutantes (p < 0.05) (Figura 2) e de quais proteínas se relacionam a cada via (Tabela suplementar 1).
Vias alteradas de maneira específica em cada modelo
Isp-1
Os nematoides mutantes para isp-1 apresentaram diversas alterações no metabolismo, como no ciclo dos ácidos tricarboxílicos, na beta-oxidação e na gliconeogênese (Figura 2). Provavelmente essas mudanças se tratam de uma adaptação à menor respiração devido ao defeito na cadeia respiratória provocado pela mutação em isp-1.
Também se encontra alterada a via das pentoses-fosfato, o que pode se tratar de uma tentativa de aumentar a síntese de NADPH para lidar com o estresse oxidativo advindo da mitocôndria. Essa molécula é utilizada como doadora de elétrons para reduzir a glutationa, permitindo sua reutilização na prevenção de estresse oxidativo 92.
V a lo r d e p 10 -15 10 -10 10 -5 10 0 R e g u la ç ã o N e g a t iv a d a S in a liz a ç ã o d a P r o t e ín a Q u in a s e C R e g u la ç ã o d o E s t a b e le c im e n t o d a P o la r id a d e C e lu la r R e p a r o d e D N A p o r ' m is m a t c h ' T r a d u ç ã o R ib o s s o m o F a s c ic u la ç ã o Ax o n a l V ia d a s P e n t o s e s - f o s f a t o P ir id o x a l- f o s f a t o M e t a b o lis m o d e G lio x ila t o e D ic a r b o x ila t o D e t e r m in a ç ã o d o T e m p o d e V id a C ic lo d o Ác id o T r ic a r b o x ílic o M e t a b o lis m o d a T ir o s in a E n z im a s q u e U t iliz a m N AD c o m o S u b s t r a t o G lic o n e o g ê n e s e C ic lo C e lu la r D e g r a d a ç ã o d e Ác id o s G r a x o s M e t a b o lis m o d e G lic in a R e g u la ç ã o d a T r a d u ç ã o P r o t e ín a d e Au t o r r e n o v a ç ã o d e C é lu la s - t r o n c o P iw i M e t a b o lis m o d e G lic in a , S e r in a e T r e o n in a M e t a b o lis m o d e P u r in a s B a ls a s L ip íd ic a s M e t a b o lis m o d e Ar g in in a e P r o lin a M e t a b o lis m o d e C a r b o n o V ia s M e t a b ó lic a s G lic o lis e M it o c ô n d r ia B io s s ín t e s e d e Am in o á c id o s S p lic in g Alt e r n a t iv o R e p r o d u ç ã o D e s e n v o lv im e n t o E m b r io n á r io a lg - 1 o /e d c r - 1 o / e is p - 1 c l k - 1 0 .0 5 0 .0 0 1
Figura 2 – Vias importantes para o envelhecimento se encontram alteradas nos modelos estudados
nesse projeto - Tabela descrevendo as vias que foram encontradas no software DAVID como
superexpressão de Dicer (dcr-1 o/e) ou superexpressão de Argonauta (alg-1 o/e) em relação a seus respectivos controles. No eixo x de encontra o valor de p em escala logarítmica de base 10.
Interessantemente, o metabolismo de glicina, serina, treonina e tirosina também está alterado nesse mutante. Mudanças nos níveis de diversos aminoácidos já foram descritas como controlando o tempo de vida de animais 93–95. Portanto a alteração nessas vias poderia explicar parte dos fenótipos desse mutante.
Essa linhagem de nematoides também apresenta alterações nas vias de ciclo celular e renovação de células tronco, o que é interessante pelo fato de C. elegans ter células somáticas pós-mitóticas, apenas havendo divisão celular na linhagem germinativa. A alteração nessas vias pode indicar a expressão ectópica de proteínas da linhagem germinativa no soma, o que ocorre em mutantes longevos e já foi descrito como algo benéfico ou deletério para o envelhecimento do organismo 96,97. Outra explicação possível para o enriquecimento dessas vias seria uma alteração na replicação das células germinativas.
Também estão alteradas proteínas relacionadas ao processo de tradução, o que é interessante tendo em vista que a inibição da tradução aumenta o tempo de vida de maneira conservada em diversas espécies 98–101. Uma das proteínas alteradas dessa via é a let-363, ortóloga a TOR de mamíferos, que se encontra com a expressão reduzida nos mutantes, o que já foi relacionado a um aumento na longevidade dos nematoides 100.
Próximo à significância (p = 0.06) se encontra a via de RNA de interferência com 5 dos 6
membros identificados tendo seus níveis reduzidos nos vermes isp-1 (Tabela suplementar 1), o que não
era esperado tendo em vista que dados não publicados de nosso grupo demonstram que esse mutantes apresentam um aumento global dos níveis de miRNAs.
Clk-1
Em relação aos nematoides mutantes para clk-1, de maneira semelhante ao observado na linhagem com mutação em isp-1, observamos alterações na via de biossíntese de alguns aminoácidos, a arginina e a prolina, podendo indicar que essa via é importante para os fenótipos induzidos por estresses mitocondriais.
Interessantemente, esses nematoides apresentam alteração em proteínas associadas a balsas lipídicas, estruturas especializadas da membrana plasmática das células envolvidas na transdução de
sinais. A manipulação da formação dessas estruturas de uma maneira geral ou de um tipo específico leva a mudanças na longevidade de C. elegans 102,103.
Outra via interessante que se encontra alterada nos mutantes para clk-1 é o metabolismo de purinas. Essas moléculas e seus metabólitos diminuem com o envelhecimento, o que é prevenido em mutantes longevos e por um aumento de glicina na dieta 93,104. A suplementação de purinas aumenta o tempo de vida nos nematoides104, indicando que é uma via com potencial terapêutico.
Interessantemente, 4 das 5 proteínas dessa via identificadas como alteradas nos mutantes clk-1 se encontram aumentadas (Tabela suplementar 1). Portanto a manutenção dos níveis de purina com a idade nesses mutantes pode explicar parte de seus fenótipos.
Superexpressão de dcr-1
Os nematoides com superexpressão de dcr-1 apresentam alterações na via de tradução e em componentes do ribossomo. Interessantemente, todos as proteínas identificadas nessas duas categorias (7 da tradução e 6 componentes do ribossomo) se encontram diminuídas, indicando uma inibição geral da tradução (Tabela suplementar 1) que pode ser explicada por um aumento da expressão de miRNAs que tenham genes desse processo como alvo devido à maior biogênese de miRNAs pela enzima Dicer.
Uma diminuição na produção de proteínas leva ao aumento do tempo de vida em diversas espécies 98–101,105 sendo que o rpl-30, um componente do ribossomo identificado em nossa lista, quando diminuído leva a um aumento na longevidade de C. elegans 105. As alterações nessas vias podem explicar parcialmente o aumento da resistência ao estresse dessa linhagem.
Superexpressão de alg-1
Nos nematoides com superexpressão de alg-1 está alterada a via de regulação negativa da atividade da proteína kinase C, a qual controla diversos fenótipos no C. elegans, como aprendizado 106 e estabelecimento da polaridade do zigoto 107.
Outra via alterada é a de reparo de DNA por ‘mismatch’. Defeitos no reparo de DNA levam a um envelhecimento precoce e a alguns tipos de câncer 108, portanto alterações nessa via podem ser relevantes para o processo de envelhecimento.
Efeitos comuns a mais de um mutante:
Vias metabólicas
Diversos termos relacionados a vias metabólicas se encontram alterados de maneira comum nos mutantes para isp-1 e clk-1. São esses: proteínas relacionadas à mitocôndria, glicólise, vias metabólicas e metabolismo de carbono.
Tendo em vista que há um defeito na cadeia de transporte de elétrons nesses mutantes, uma adaptação no metabolismo é esperada, o que pode explicar o enriquecimento desses termos.
Biossíntese de aminoácidos
A biossíntese de aminoácidos se encontra alterada em nematoides com mutação em isp-1 e
clk-1. Alterações nos níveis de diversos aminoácidos já foram descritas como tendo um efeito no tempo de
vida de organismos 93–95,109. Sendo assim, uma alteração nessa via pode se tratar de um dos mecanismos pelos quais mutações que afetam a cadeia respiratória levam à longevidade.
Splicing Alternativo
Outra via alterada de maneira comum nos nematoides mutantes para isp-1 e clk-1 é a de splicing alternativo, cujo aumento medeia parte dos efeitos benéficos da restrição calórica e da diminuição da sinalização de TOR sobre o envelhecimento 110. Sendo assim, um aumento nessa via pode explicar parte dos fenótipos do isp-1 e clk-1 sendo que dos genes da via alterados, 75% (15 de 20) ou 60% (6 de 10) estão aumentados nos nematoides isp-1 e clk-1, respectivamente (Tabela suplementar 1).
Desenvolvimento embrionário e reprodução
Em C. elegans, o ritmo de desenvolvimento e o tempo de vida são inversamente correlacionados em diversas situações 111. Além disso, a remoção da linhagem germinativa dos nematoides utilizando
laser 112 ou por um modelo genético 113, o que resulta em morte das células precursoras dos gametas, estende o tempo de vida.
Diversos mutantes longevos, como os com defeito na cadeira respiratória estudados aqui e os com diminuição na sinalização da insulina 114, se desenvolvem lentamente e reproduzem menos em relação a vermes selvagens 35,38.
A teoria do ‘disposable soma’ postula que, havendo recursos limitados na natureza para se investir em reprodução, crescimento e manutenção das células do organismo, um investimento muito grande em uma das partes resultaria em perdas para as outras 115. Esse fato explicaria por que há uma correlação negativa entre desenvolvimento e reprodução com a longevidade em diversos modelos como os mutantes isp-1 e clk-1 estudados aqui.
Outra relação entre desenvolvimento e mutantes com estresse mitocondrial se encontra no fato do silenciamento da ATP sintase, uma proteína mitocondrial responsável pela síntese de ATP, induzir um aumento na longevidade somente quando realizado no desenvolvimento, não gerando o fenótipo quando feito apenas durante a vida adulta do nematoide 44.
Além disso, a via de miRNAs também se relaciona ao desenvolvimento, sendo que nosso grupo observou que o silenciamento de dcr-1 só leva a seus efeitos deletérios quando realizado durante o desenvolvimento, não ocorrendo quando feito na vida adulta76.
Interessantemente, as vias de desenvolvimento embrionário e reprodução estão alteradas em 3 dos modelos utilizados nesse trabalho com a primeira estando alterada nas linhagens clk-1, isp-1 e
dcr-1 o/e enquanto a outra nas linhagens clk-dcr-1, alg-dcr-1 o/e e dcr-dcr-1 o/e. Sendo assim, alterações nas vias de
sinalização envolvidas no desenvolvimento e reprodução podem ser o elo que liga a via de miRNAs aos efeitos na longevidade de mutações que afetam a cadeia transportadora de elétrons. Essas vias também podem explicar os fenótipos de desenvolvimento e reprodução lentos dos nematoides mutantes para isp-1 e clk-1.
Portanto, tendo em vista que observamos anteriormente um aumento global dos níveis de miRNAs em todos os mutantes estudados nesse projeto 76, é possível que nos mesmos haja uma síntese mais eficiente de miRNAs que tenham como alvo genes que regulem o desenvolvimento e a
