4. MATERIAL E MÉTODOS
4.2. Preparação das micropartículas de ciprofloxacina
O preparo das micropartículas foi realizado no laboratório da Universidade Estadual Paulista-Unesp de Araraquara, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, no Departamento de Fármacos e Medicamentos Grupo de Nano e Microsistemas Farmacêuticos. Hidroclorido de ciprofloxacina1 foi dissolvido em etanol2 e água (na
1 Hidroclorido de ciprofloxacina – Sigma-Aldrich Inc. – Estados Unidos da América 2 Etanol – Merck S.A. - Brasil
proporção de 1:1) e adicionados a soluções de polímero de PLGA em acetona para obter misturas entre fármaco/polímero. As micropartículas foram obtidas pelo processo de spray drying que consiste basicamente em dispersar o polímero e o fármaco em um solvente ou sistema solvente, e atomizá-los, via aspersor, para originar microgotas que, ao entrarem em contato com o ar em temperatura próxima ou superior ao ponto de ebulição do solvente, proporcionam a evaporação do mesmo de forma rápida e dinâmica, formando as micropartículas (FU et al., 2002; SILVA-JÚNIOR, 2005).
4.3. Delineamento experimental
4.3.1. Comissão de ética
O estudo foi conduzido de acordo com os princípios éticos na experimentação animal e foi aprovado pela Câmara de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP de Botucatu (protocolo 113/2008 CEEA).
4.3.2. Procedimento anestésico
A anestesia foi realizada com associação de acepromazina3 (0,5mg/kg),
xilazina4 (5mg/kg) e ketamina5 (35mg/kg), administrados por via intramuscular, e morfina6 (3mg/kg) por via subcutânea para os procedimentos de inoculação bacteriana intra-corneana e aplicação da ciprofloxacina de liberação controlada. Colírio tópico de cloridrato de proximetacaína 0,5%7 foi utilizado como
complemento anestésico. A colheita das biópsias corneanas, swabs da superfície ocular e humor aquoso para análise da concentração de ciprofloxacina foram
3 Acepran – Univet - Brasil 4 Anasedan – Vetbrands - Brasil 5 Dopalen – Vetbrands - Brasil 6 Dimorf – Cristalia - Brasil 7 Anestalcon – Alcon - Brasil
realizadas logo após a eutanásia (quinto dia de experimento) com pentobarbital sódico8.
4.3.3. Modelo experimental
Foram utilizados 20 coelhos (2-3kg) da raça branca Neozelandesa, sadios e sem problemas oculares. Os animais foram divididos em quatro grupos de acordo com a metodologia descrita abaixo, dos quais foi observado apenas o olho esquerdo de cada animal.
I. Grupo (G1) contendo cinco animais (indivíduos 1, 2, 3, 4, 5) induzidos à ceratite bacteriana experimental, tratados por cinco dias com uma gota de solução fisiológica (SF), a cada 6 horas.
II. Grupo (G2) contendo cinco animais (indivíduos 6, 7, 8, 9, 10) com córnea sadia, tratados com aplicação subconjuntival única de 0,2ml contendo 2mg de ciprofloxacina de liberação controlada e observados por cinco dias. III. Grupo (G3) contendo cinco animais (indivíduos 11, 12, 13, 14, 15) induzidos
à ceratite bacteriana experimental, tratados por cinco dias com uma gota de ciprofloxacina 0,3%, a cada 6 horas.
IV. Grupo (G4) contendo cinco animais (indivíduos 16, 17, 18, 19, 20) induzidos à ceratite bacteriana experimental, tratados com aplicação subconjuntival única de 0,2ml contendo 2mg de ciprofloxacina de liberação controlada e observados por cinco dias.
Todos os tratamentos tiveram início 5 horas após a inoculação intra- estromal do S. aureus, sendo descrito por Callegan et al. (1994) como o tempo ideal para o tratamento de ceratites bacterianas por ciprofloxacina. A aplicação do sistema de liberação controlada foi realizada na região bulbar dorso-medial no espaço subconjuntival utilizando-se uma agulha 13x0,45mm9 e seringa de 1ml10, como descrito por Amrite et al. (2006).
8 Thiopentax – Cristalia - Brasil
9 Agulhas BD PrecisionGlidetm – BD - Brasil 10 Seringas BD Plastipaktm – BD - Brasil
4.3.4. Inoculação do S. aureus para a indução da ceratite bacteriana experimental
Após o procedimento anestésico anteriormente descrito, anti-sepsia da superfície ocular foi realizada com solução de iodo povidine diluída em solução fisiológica em concentração de 5%. Procedeu-se à imobilização palpebral por meio de um blefaroestato Barraquer11 e à centralização do bulbo ocular com o auxílio de uma pinça de conjuntiva Bonn12. A inoculação do S. aureus foi feita
conforme a técnica descrita por Barequet et al. (2004). Foi utilizada uma seringa Hamilton13 graduada em microlitros, com a introdução do bizel da agulha na periferia corneana até o terço médio da profundidade estromal (Figura 2A); esta foi então avançada até o centro da córnea aonde 2,5µl do inóculo foram injetados (Figura 2B).
A B
FIGURA 2- (A) Introdução da agulha no estroma corneano e (B) inoculação do
Staphylococcus aureus na região central da córnea.
11 Befarostato aramado Barraquer recém-nascido - Odous - Brasil 12 Pinça p/ conjuntiva mod. Bonn – Odous - Brasil
4.3.5. Análise clínica pela lâmpada de fenda
Exames diários feito pelo mesmo observador foram realizados pela biomicroscopia em lâmpada de fenda14 nos períodos de 24 (dia 1), 48 (dia 2), 72 (dia 3), 96 (dia 4) e 120 horas (dia 5) pós inoculação e classificados como descrito por Callegan et al. (1994) e Sloop et al. (1999). Foram analisadas as seguintes alterações clínicas: hiperemia conjuntival, quemose, irite, presença de fibrina na câmara anterior, hipópio, infiltrado e edema estromais. Valores foram atribuídos de zero a quatro para cada alteração, sendo zero equivalente à ausência de alteração, um para leve, dois para moderada, três para moderada/severa e quatro para severa. Os valores dos parâmetros de cada indivíduo foram então somados abrangendo uma variação de zero (olho sem alteração) a vinte e oito (olho com inflamação máxima).
4.3.6. Colheita de secreção ocular e tecido corneano para cultivo microbiológico
A colheita do material foi realizada com swab estéril15 e por punch16 descartável estéril de 4mm da espessura total da córnea (primeira biópsia), de parte da região do inóculo bacteriano, após a eutanásia dos animais (dia 5). O
swab foi mantido em contato com a córnea e conjuntivas palpebrais por 20
segundos e, posteriormente, preservado em um recipiente estéril até o seu processamento. O fragmento corneano foi mantido em um frasco estéril com solução salina para análise.
4.3.7. Processamento microbiológico
A secreção ocular coletada por swab e biopsia corneana foi processada pelo laboratório de microbiologia do Departamento de Moléstias Infecciosas da
14 904 Slit Lamp – Clement Clarke International Ltd. - Inglaterra 15 Sterile Swab – IVD - Italia
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP de Botucatu. As amostras foram semeadas em condições de aerobiose a 37oC, em meio de MacConkey e agar sangue contendo 10% de sangue desfibrinado de ovelha; foram observadas pelo período de 24, 48, 72 e 96 horas. O material que se apresentou com isolamento positivo teve seus agentes caracterizados macroscópica, microscópica (morfotinturial) e bioquimicamente, segundo Quinn et al. (1994).
4.3.8. Colheita de biopsia corneana para exame histopatológico
Foram obtidos fragmentos por punch de 4mm da espessura total da córnea (segunda biópsia), da região restante do inóculo bacteriano e da conjuntiva no local do depósito de PLGA de ciprofloxacina. O grupo G2 que não recebeu a inoculação do S. aureus, foi biopsiado na região central da cornea, supostamente na mesma localização das biópsias dos outros grupos. Não foi realizada a coleta de material conjuntival dos grupos G1 e G3 devido à ausência da medicação de liberação controlada. O material coletado foi mantido em formol 10% até o seu processamento pelo Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP de Botucatu. Os cortes histológicos foram fixados e depois corados por hematoxilina-eosina (HE).
4.3.9. Colheita de humor aquoso para análise farmacológica
A punção da câmara anterior foi realizada com uma agulha de 13x0,45mm17 acoplada a uma seringa de 1ml18 para coleta de humor aquoso para exame de high-performance liquid chromatography (HPLC) logo após a eutanásia (dia 5) e seis horas após a última instilação de colírio no grupo G3. Aproximadamente 0,2ml de cada animal foi coletado (olho esquerdo apenas) e
17 Agulhas BD PrecisionGlidetm – BD - Brasil 18 Seringas BD Plastipaktm – BD - Brasil
acondicionado a -80oC até o momento de processamento das amostras pelo Laboratório de Análises Químicas da Fundação de Estudos e Pesquisas Agrícolas e Florestais (FEPAF).
4.3.10. Preparo e análise das amostras de humor aquoso
As amostras foram diluídas em solução de ácido fosfórico pH 3,0 na proporção de 1:1, com exceção das amostras dos animais 13 e 15 que foram diluídas na proporção de 1:3 (amostra:diluente) devido a pouca quantidade de humor aquoso coletado; foram então analisadas pelo Sistema Shimadzu de HPLC composto por bomba LC-10AD19 e software para aquisição e tratamento de dados LC Solution - versão 1.22 SP120. Os comprimentos de onda utilizados no detector
de fluorescência foram de 278 nm para excitação e 455 nm para emissão.
Para quantificação foi utilizada calibração externa, sendo os padrões (0,25 ng/mL, 0,5 ng/mL, 0,75 ng/mL, 1 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 15 ng/mL) injetados em triplicata. Os valores de coeficiente de variação para área variaram de 1,7 a 4,1% (ponto de calibração 0,25 ng/mL), sendo o coeficiente de correlação obtido para a curva analítica igual a 0,9996.
4.4. Análise Estatística
Foi utilizada a técnica de análise de variância não-paramétrica para o modelo de medidas repetidas em grupos independentes complementada com o procedimento de comparações múltiplas SNK entre todos os pares (ZAR, 1999). Todas as comparações foram realizadas no nível de 5% de significância.
Para as concentrações de ciprofloxacina foi realizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis complementado com o método de Dunn para as comparações múltiplas no nível de 5% de significância (ZAR, 1999).
19 S
HIMADZU LC-10ALIQUID CHROMATOGRAPH -Shimadzu Corporation - Japão