UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
TRATAMENTO DA CERATITE INFECCIOSA EXPERIMENTAL EM
COELHOS COM O SISTEMA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA
SUBCONJUNTIVAL DE CIPROFLOXACINA
TIAGO PALMEIRA PEIXOTO
Tese apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Doutor.
Orientador: Prof.Dr. José Joaquim Titton Ranzani
Dedicatória
Dedicatória
Dedicatória
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Dedico este trabalho a meu pai
Dedico este trabalho a meu pai
Dedico este trabalho a meu pai
Dedico este trabalho a meu pai e minha mãe
e minha mãe
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ppppelo apoio,
elo apoio,
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elo apoio, conselhos
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conselhos,,,, amor, carinho e
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reocupação.
cupação.
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Agradecimentos
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A
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Ao meu
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o meu orientador
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orientador
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orientador José Joaquim
José Joaquim
José Joaquim
José Joaquim Titton Ranzani
Titton Ranzani
Titton Ranzani pelo apoio,
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pelo apoio,
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incentivo, confian
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ça
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ça e amizade
e amizade
e amizade
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Muito obrigado!
Muito obrigado!
Muito obrigado!
Muito obrigado!
A Prof. Claudia Valéria S. Brandão, pelo apoio, amizade e co-orientação não
oficial
A todos da Oftalmologia Veterinária, pelo apoio, auxílio e amizade;
Aos amigos da República Piraporinha, pela ajuda e apoio, sem vocês esse
trabalho não se concluiria;
A minha amiga e futura sócia Fernanda Carpi dos Santos pela ajuda e
compreensão.
Ao Prof. Anselmo Gomes de Oliveira, da UNESP de Araraquara que
gentilmente cedeu a ciprofloxacina de liberação controlada e ao Dr Acácio de
Souza Lima pelo suporte;
Ao amigo Eduardo S. Mori pelo auxílio no desenvolvimento do trabalho;
Ao Professor Carlos R. Padovani, pela orientação estatística e análise dos
resultados;
A Prof Maria de Lourdes R. S. Cunha pelo fornecimento do inóculo
bacteriano.
Ao Fernando G. Tonin pelo processamento das amostras de HPLC
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Capes pela
bolsa concedida.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Representação esquemática da estrutura química do ácido glicólico, ácido lático e do ácido polilático-co-glicólico (PLGA)... 20 FIGURA 2- (A) Introdução da agulha no estroma corneano, (B) e
inoculação do Staphylococcus aureus na região central da córnea... 26 FIGURA 3 – Representação gráfica da mediana do escore total de inflamação de acordo com o grupo e dia de avaliação... 36 FIGURA 4 – Representação gráfica da mediana de hiperemia conjuntival de acordo com o grupo e dia de avaliação... 38 FIGURA 5 – Representação gráfica da mediana de quemose de acordo com o grupo e dia de avaliação... 40 FIGURA 6 – Representação gráfica da mediana de irite de acordo com o grupo e dia de avaliação... 42 FIGURA 7 – Representação gráfica da mediana de fibrina de acordo com o grupo e dia de avaliação... 44 FIGURA 8 – Representação gráfica da mediana de hipópio de acordo com o grupo e dia de avaliação... 46 FIGURA 9 – Representação gráfica da mediana de infiltrado estromal de acordo com o grupo e dia de avaliação... 48 FIGURA 10 – Representação gráfica da mediana de edema estromal de acordo com o grupo e dia de avaliação... 50 FIGURA 11 – Aspecto clínico no primeiro (A), segundo (B), terceiro
(C), quarto (D) e quinto (E) dia de tratamento do grupo G1. Presença de quemose, hiperemia conjuntival, edema corneano, hipópio, infiltrado estromal e fibrina mais evidente no início do experimento (A) com melhora gradual. No último dia (E) ainda persistiram a hiperemia conjuntival, edema corneano, hipópio, infiltrado estromal e fibrina... 51
FIGURA 12 – Aspecto clínico no primeiro (A), segundo (B), terceiro (C), quarto (D) e quinto (E) dia de tratamento do grupo G2. Observou-se a presença do sistema de liberação controlada em todos os dias de tratamento, causando uma inflamação no local de implantação. Os únicos sintomas aparentes foram a quemose nos dois primeiros dias (A,B) e hiperemia conjuntival em todos os momentos... 52 FIGURA 13 – Aspecto clínico no primeiro (A), segundo (B), terceiro
(C), quarto (D) e quinto (E) dia de tratamento do grupo G3. Presença de quemose, edema corneano, infiltrado estromal e discreta fibrina (A). A partir do segundo dia (B) houve uma diminuição significativa da quemose e o aparecimento de hipópio com aumento da quantidade de fibrina na câmara anterior. No final do tratamento (E) houve apenas a presença de infiltrado estromal, classificado como discreto... 53 FIGURA 14 – Aspecto clínico no primeiro (A), segundo (B), terceiro
(C), quarto (D) e quinto (E) dia de tratamento do grupo G4. Ligeiro infiltrado estromal e edema corneano (A) que melhoraram a partir do terceiro (C) e quarto (D) dia, até a sua completa ausência (E). Notou-se também a presença do sistema de liberação controlada na região dorsal/medial do olho, que quase foi absorvido por completo pelo organismo (E), restando apenas pequenas quantidades do PLGA e hiperemia conjuntival localizada... 54 FIGURA 15 – Corte histológico da córnea do grupo G1 no quinto dia
de experimento, visualizado com um aumento de 10x. Presença de piogranuloma com grande quantidade de infiltrado polimorfonuclear e perda de células epiteliais... 56 FIGURA 16 - Corte histológico da conjuntiva do grupo G4 no quinto dia
uma moderada quantidade de infiltrado polimorfonuclear e separação entre as células estromais (edema). Epitélio conjuntival normal com presença de células caliciformes... 56
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Escore total de inflamação observado no olho esquerdo dos animais dos grupos G1, G2, G3 e G4 em relação ao dia... 35 TABELA 2 – Mediana e valores mínimo e máximo do escore total de
inflamação de acordo com o grupo (G) e dia de avaliação... 36 TABELA 3 – Escore de hiperemia conjuntival observado no olho esquerdo
dos animais dos grupos G1, G2, G3 e G4 em relação ao dia... 37 TABELA 4 – Mediana e valores mínimo e máximo de hiperemia conjuntival
segundo grupo(G) e dia de avaliação... 38 TABELA 5 – Escore de quemose observado no olho esquerdo dos animais
dos grupos G1, G2, G3 e G4 em relação ao dia... 39 TABELA 6 – Mediana e valores mínimo e máximo de quemose segundo
grupo(G) e dia de avaliação... 40 TABELA 7 – Escore de irite observado no olho esquerdo dos animais dos
grupos G1, G2, G3 e G4 em relação ao dia... 41 TABELA 8 – Mediana e valores mínimo e máximo de irite segundo grupo(G)
e dia de avaliação... 42 TABELA 9– Escore de fibrina observado no olho esquerdo dos animais dos
grupos G1, G2, G3 e G4 em relação ao dia... 43 TABELA 10 – Mediana e valores mínimo e máximo de fibrina segundo
grupo(G) e dia de avaliação... 44 TABELA 11 – Escore de hipópio observado no olho esquerdo dos animais
dos grupos G1, G2, G3 e G4 em relação ao dia... 45 TABELA 12– Mediana e valores mínimo e máximo de hipópio segundo
grupo(G) e dia de avaliação ... 46 TABELA 13 – Escore de infiltrado estromal observado no olho esquerdo dos
animais dos grupos G1, G2, G3 e G4 em relação ao dia... 47 TABELA 14– Mediana e valores mínimo e máximo de infiltrado estromal
segundo grupo(G) e dia de avaliação... 48 TABELA 15– Mediana e valores mínimo e máximo de infiltrado estromal
TABELA 16– Mediana e valores mínimo e máximo de edema estromal segundo grupo(G) e dia de avaliação... 50 TABELA 17- Microbiológico de swab e biopsia corneano no quinto dia de
tratamento dos grupo G1 e G2; avaliação qualitativa... 58 TABELA 18- Microbiológico de swab e biopsia corneano no quinto dia de
tratamento dos grupos G3 e G4; avaliação qualitativa... 59 TABELA 19 – Valores de concentração de ciprofloxacina (µg/ml) e desvio
padrão (DP) do humor aquoso nos olhos esquerdos dos animais dos grupos G1, G2, G3 e G4... 60 TABELA 20– Mediana (valores mínimo e máximo), desvio padrão (DP) e
LISTA DE ABREVIAÇÕES Kg – quilograma mm – milímetro % - porcentagem oC – graus celsius ml – mililitro mg – miligramas o – grau µm – micrômetro
UFC – unidade formadora de colônia µg/ml – microgramas por mililitro ® - marca registrada
PLGA – poli–lactato-co-glicolato
cel/mm2 – células por milimetro quadrado
SUMÁRIO
RESUMO... 01
ABSTRACT... 03
1. INTRODUÇÃO... 04
2. REVISÃO DE LITERATURA……….……….. 07
2.1. Anatomia, embriologia e fisiologia oculares... 07
2.2. Regeneração e cicatrização corneana... 09
2.3. Mecanismo de defesa ocular... 11
2.4. Ceratite bacteriana... 12
2.4.1. Staphylococcus aureus... 13
2.5. Farmacologia e terapêutica ocular... 14
2.6. Antimicrobianos... 16
2.7. Sistema de liberação controlada de drogas... 17
2.7.1.Microesferas de poli-lactato-co-glicolato (PLGA)... 19
3. OBJETIVO... 22
4. MATERIAL E MÉTODOS………..……….. 23
4.1. Preparo do inóculo... 23
4.1.1. Bactéria... 23
4.1.2. Padronização do inóculo... 23
4.2. Preparação das micropartículas de ciprofloxacina... 23
4.3. Delineamento experimental... 24
4.3.1. Comissão de ética... 24
4.3.2. Procedimento anestésico... 24
4.3.3. Modelo experimental... 25
4.3.4. Inoculação do S. aureus para a indução da ceratite bacteriana experimental... 26
4.3.5. Análise clínica pela lâmpada de fenda... 27
4.3.6. Colheita de secreção ocular e tecido corneano para cultivo microbiológico... 27
4.3.8. Colheita de biopsia corneana para exame histopatológico... 28
4.3.9. Colheita de humor aquoso para análise farmacológica... 28
4.3.10. Preparo e análise das amostras de humor aquoso... 29
4.4. Análise estatística... 29
5. RESULTADOS... 30
5.1 Resultados clínicos avaliados pela biomicroscopia em lâmpada de fenda... 30 5.1.1. Hiperemia conjuntival... 5.1.2. Quemose... 31 31 5.1.3. Irite... 32 5.1.4. Fibrina... 32 5.1.5. Hipópio... 33 5.1.6. Infiltrado estromal... 33 5.1.7. Edema estromal... 34 5.2. Avaliação morfológica... 55 5.2.1. Grupo G1... 55 5.2.2. Grupo G2... 55 5.2.3. Grupo G3... 57 5.2.4. Grupo G4... 57 5.3. Avaliação microbiológica... 57 5.4. Avaliação farmacológica... 59 6. DISCUSSÃO... 62 7. CONCLUSÃO... 75 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 76 9. TRABALHO CIENTÍFICO 1... 89 10. TRABALHO CIENTÍFICO 2... 108
PEIXOTO, T.P. Tratamento da ceratite infecciosa experimental em coelhos
com o sistema de liberação controlada subconjuntival de ciprofloxacina.
Botucatu, 2008. 86p Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
RESUMO
A proposta do presente trabalho foi a de comparar o tratamento convencional a base de colírio com o sistema de liberação controlada no tratamento de ceratites por Staphylococcus aureus por ciprofloxacina. Foram utilizados 20 coelhos, divididos em quatro grupos. Os grupos G1, G3 e G4 foram inoculados com 2,5µl da bactéria (108UFC) no estroma corneano. O grupo G2 não recebeu a aplicação do inóculo. O tratamento foi realizado com solução fisiológica para o grupo G1 (a cada seis horas por cinco dias), micropartículas de poli-lactato-co-glicolato (PLGA) contendo ciprofloxacina nos grupos G2 e G4, e colírio de ciprofloxacina no grupo G3 (a cada seis horas por cinco dias). Humor aquoso foi coletado no quinto dia de tratamento para análise por High-performance liquid
chromatography (HPLC) da quantidade de ciprofloxacina na câmara anterior. As
concentrações médias obtidas foram de 0,013µg/ml, 0,3µg/ml e 0,03µg/ml para os grupos G2, G3 e G4 respectivamente. Swab e biópsia da superfície ocular foram coletados para cultura no quinto dia de experimento. Apenas um animal do grupo G1 teve cultura positiva para S. aureus no material processado. Exame histopatológico revelou a presença bacteriana em todos os animais do grupo G1 e em dois animais do G3. Também foi constatado uma leve reação inflamatória no local da aplicação do sistema de liberação controlada. A análise dos dados mostrou que o tratamento com as micropartículas de PLGA foi eficaz no tratamento de ceratite bacteriana, eliminando completamente a presença de S.
aureus e não sendo completamente biocompatível e biodegradável após cinco
Palavras-chave: Sistema de liberação controlada; Ceratite; Micropartículas de
PEIXOTO, T.P. Treatment of experimental infectious keratitis in rabbits with
subconjunctival controlled delivery system of ciprofloxacin. Botucatu, 2008.
86p Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
ABSTRACT
The proposal of this study was to compare the conventional treatment with eye drops with the controlled delivery system of PLGA, in the treatment of
Staphylococcus aureus keratitis with ciprofloxacin. We used 20 rabbits, divided into
four groups. The groups G1, G3 and G4 were inoculated with the bacterial 2.5µl (108UFC) in the corneal stroma. The G2 group did not receive the application of inoculum. The treatment was performed with basic saline solution in G1 (every six hours for five days), microparticles of poly-lactate co-glycolate (PLGA) containing ciprofloxacin in G2 and G4, and ciprofloxacin eye drops in group G3 (every six hours for five days). Aqueous humor was collected on the last day of treatment for analysis by High-performance liquid chromatography (HPLC) of the amount of ciprofloxacin in the anterior chamber. The average concentrations were obtained from 0013µg/ml, 0.3µg/ml and 0.03µg/ml for G2, G3 and G4 respectively. Swab and biopsy of the ocular surface were collected for culture on the fifth day of experiment. Only one animal in the G1 had positive culture for S. aureus in the processed material. Histological examination showed a bacterial presence in all animals of G1 and two animals of G3. It was also noted some light inflammatory reaction at the site of application of the controlled release. Data analysis showed that treatment with the microparticles of PLGA was effective in treating bacterial keratitis, completely eliminating the presence of S. aureus, not being completely biocompatible and biodegradable after five days.
Key-words: Controlled delivery system, Keratitis, Microparticles of poly-lactate
1. INTRODUÇÃO
A córnea é uma continuação da esclera, sendo uma estrutura transparente desprovida de vascularização sanguínea, exceto em sua periferia. É a superfície óptica com o maior poder refrativo do olho e sua transparência esta relacionada a alguns fatores: a ausência de vasos sangüíneos e pigmento, controle do conteúdo aquoso, uma superfície óptica lisa (produzida pelo filme lacrimal pré-corneano) e um arranjo regular e altamente organizado das fibras de colágeno (SLATTER 2001). Nos animais domésticos, em geral, a córnea possui cinco camadas: o filme lacrimal pré-corneano, o epitélio, o estroma, a membrana de Descemet e o endotélio. (DIESEM, 1986; SLATTER, 2001). Primatas apresentam mais uma camada bem desenvolvida, a membrana de Bowman (SAMUELSON, 1999).
O olho é uma estrutura relativamente impermeável a microorganismos, porém se algum dano estrutural ocorre, infecções oportunistas produzidas por bactérias ou fungos podem facilmente se desenvolver (DOWLING e GRAHN, 1998). A ceratite microbiana é caracterizada por um defeito no epitélio corneano com inflamação estromal causada por microorganismos em replicação. O aparecimento dos sintomas é agudo, causando dor e risco de perda ou diminuição da acuidade visual, necessitando de diagnóstico e tratamento rápidos. Fatores que podem levar à ceratite microbiana incluem trauma ocular, lentes de contato, cirurgias oculares, suturas, uso de corticóides tópicos, doenças de superfície ocular, alteração morfologia palpebral, ceratite herpética e doenças sistêmicas (diabetes) (KEAY et al., 2006; McGHEE e NIEDERER, 2006).
Staphylococcus aureus é uma das principais causas de infecção bacteriana
na córnea de humanos, sendo um habitante normal da superfície ocular externa, narinas, pele e meio ambiente (COX, 1998; DAJCS et al., 2001; MOREAU et al., 2002). Um modelo para quantificar a profilaxia efetiva de formulações antibióticas tem sido descrito na utilização de infecções por Staphylococcus aureus em córneas de coelhos (DAJCS et al., 2001).
Fármacos são produzidos de diversas maneiras para administração ocular, sendo mais empregado o uso de colírios e pomadas. A terapia antimicrobiana
ocular difere do tratamento de infecções em outros tecidos porque as drogas podem ser administradas diretamente no olho, alcançando altas concentrações no sítio de ação. Alguns fatores devem ser levados em consideração quando se escolhe a via de administração: propriedade da droga, sítio de ação desejado, freqüência de administração e concentração necessária. Fármacos aplicadas topicamente são distribuídas pelo olho por três vias: penetração transcorneana, absorção pelos vasos conjuntivais que drenam para o corpo ciliar e absorção e drenagem pelo sistema nasolacrimal. A penetração transcorneana é a mais importante, sendo considerada a terapia para infecções oculares (DOWLING e GRAHN, 1998; SLATTER, 2001).
Soluções oftálmicas possuem uma biodisponibilidade baixa devido à rápida limpeza pré-corneana induzida pela lágrima e, também, pela alteração da córnea como uma barreira para a penetração de muitas substâncias aplicadas topicamente. Ela consiste de um estroma hidrofílico e um epitélio e endotélio hidrofóbico (SMITH et al., 2001; WEYENBERG et al., 2004). Sendo assim, o uso de colírio requer do paciente uma disciplina rígida com um esquema de instilação freqüente do fármaco, para que se possam atingir níveis terapêuticos no olho. Diversos métodos têm sido estudados para se aumentar a biodisponibilidade dos fármacos com relação ao aumento do tempo de contato entre o medicamento e o epitélio corneano e conjuntival. A primeira estratégia foi o aumento da viscosidade, ocasionando pouca melhora. Outro método foi a criação de adesivos mucosos, onde polímeros interagem com a camada mucosa que protege a superfície externa do olho. A utilização de filmes e implantes também foi proposta; a desvantagem é que estes não são absorvidos pelo organismo, tendo que ser retirados manualmente. Já o desenvolvimento de sistemas de liberação controlada baseados em dispositivos poliméricos, permitem a utilização de implantes solúveis absorvíveis, não havendo a necessidade da sua retirada (LIMA e JÚNIOR, 1999; WEYENBERG et al., 2004). A facilidade oferecida pelo sistema de liberação temporizada no aspecto terapêutico levou ao desenvolvimento de um polímero biodegradável à base de poli-lactato-co-glicolato (PLGA) com ciprofloxacina,
testado pelo presente trabalho, visando proporcionar um tratamento mais simples e eficaz das infecções oculares para pacientes, proprietários e clínicos.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Anatomia, embriologia e fisiologia oculares
O olho desenvolve-se a partir da neuroectoderme, a ectoderme superficial e a mesoderme formando uma estrutura globular, composto por três camadas básicas, ou túnicas (MOORE e NASISSE, 1999). A túnica fibrosa composta pela córnea e esclera deriva da ectoderme superficial e mesoderme. A túnica vascular, formada pela mesoderme e neuroectoderme compreende a úvea, sendo esta, dividida em coróide, corpo ciliar e íris. A terceira e a mais interna das camadas denomina-se túnica nervosa, originária da neuroectoderme, consistindo em retina e nervo óptico. As três túnicas envolvem os meios transparentes internos do olho: o humor aquoso, cristalino e o humor vítreo (MOORE e NASISSE, 1999).
A córnea sadia é um tecido transparente, sem vasos sangüíneos, localizada na parte anterior da túnica fibrosa do globo. É a superfície óptica com o maior poder refrativo do olho e sua transparência está relacionada a alguns fatores: a ausência de vasos sanguíneos e pigmento, controle do conteúdo aquoso, uma superfície óptica lisa (produzida pelo filme lacrimal pré-corneano) e um arranjo regular e altamente organizado das fibras de colágeno. Sua espessura varia entre espécies, raças e indivíduos (MOORE e NASISSE, 1999; SLATTER, 2001). A córnea do coelho intacta mede aproximadamente entre 370 a 430µm de espessura total, sendo que esta pode variar de 0,3 a 1,8mm nas diferentes espécies. A sua superfície externa é coberta com um epitélio estratificado escamoso, que possui cerca de 35 a 40 mícrons de espessura. O estroma subjacente inclui a maior parte da espessura remanescente da córnea. A membrana de descemet possui de 8 a 10 mícrons de espessura, e a espessura do endotélio (mesotélio da membrana de descemet) é de cerca de 3,5 a 5 mícrons (KAYE e PAPPAS, 1962; CHAN et al., 1983).
A córnea possui cinco camadas nos animais domésticos: o filme lacrimal pré-corneano, o epitélio, o estroma, a membrana de Descemet e o endotélio. O epitélio é constituído por sete a vinte lâminas de células (dependendo da espécie).
Nos cães, gatos e pássaros o epitélio anterior consiste de uma camada celular única de células basais, que tem um formato colunar e estão apoiadas em uma membrana basal fina, duas a três camadas de células poliédricas, e duas a três camadas de células estratificadas não queratinizadas. Em animais de grande porte, as camadas de células poliédricas e escamosas são mais numerosas. Subjacente ao epitélio está a membrana basal (membrana de Bowman), bem definida em primatas, mas muito pouco nas outras espécies. O epitélio normal descama-se constantemente em sua superfície, com uma vida celular média ao redor de 36 a 48 horas e se renova com quatro a oito dias. Esta renovação é sustentada pela proliferação e migração vertical das células da camada basal e migração centrípeta das células da periferia corneana (SAMUELSON, 1999; SLATTER, 2001; ESTIL et al., 2002; SUDHA, 2007).
O estroma corresponde a 90% da córnea e é composto por fibrócitos, ceratócitos e colágeno. As fibras de colágeno paralelas formam uma lâmina podendo haver a presença de linfócitos, macrófagos e neutrófilos. O espaçamento regular destas fibras mantém a transparência corneana que a distingue do colágeno na cicatriz e esclera (SLATTER, 2001).
A membrana de Descemet é a membrana basal do endotélio. Ela é produzida pelo endotélio durante a vida do animal, ficando mais espessa com o passar da idade. Clinicamente ela mostra uma certa elasticidade, mas é formada apenas por uma fina camada de fibras de colágeno (SAMUELSON, 1999; SLATTER, 2001).
O endotélio consiste de uma lâmina única de células aplainadas, paralela à membrana limitante interna. Localiza-se aderida e posterior à membrana de Descemet, e em contato direto com o humor aquoso (KAYE e PAPPAS, 1962; DIESEM, 1986). Possui uma alta atividade metabólica e uma capacidade limitada de se replicar dependendo da espécie e idade e, quando há perda de algumas células, o defeito é reparado pela migração das células adjacentes. A densidade normal de células endoteliais no cão é de aproximadamente 2800cel/mm2. Descompensação e inabilidade corneana de remover água do estroma ocorrem
quando esta densidade é menor que 500 a 800cel/mm2 (DIESEM, 1986; SLATTER 2001).
A zona de transição entre a córnea e a conjuntiva-esclera é chamada de limbo, caracteriza-se por um reservatório de células germinativas (stem cell). A conjuntiva é uma membrana mucosa móvel que recobre a superfície interna da pálpebra em direção à órbita formando o fórnix. Ela então se reverte em direção à córnea cobrindo interna e externamente a terceira pálpebra e a porção anterior do bulbo até o limbo. Apresenta a margem palpebral e na superfície bulbar o epitélio apresenta células escamosas estratificadas não queratinizadas. A conjuntiva tarsal e fórnix possuem um epitélio cubóide estratificado a colunar, variando em espessura. A camada epitelial recobre a substância própria que é formada por fibras de colágeno frouxas, vasos sanguíneos, nervos, linfócitos residentes, células plasmáticas e mastócitos. A conjuntiva possui um papel importante na dinâmica da lágrima, proteção imunológica do olho, movimento ocular e cicatrização corneana. A esclera, que mantém o formato do bulbo ocular, é composta por um tecido conjuntivo denso rico em fibras elásticas. Ela pode ser dividida em zona episcleral, em lâmina própria da esclera e em lâmina fosca (GELLAT, 2000; SLATTER, 2001; SUDHA, 2007).
2.2. Regeneração e Cicatrização Corneana
Quando a superfície do organismo, seja cutânea, mucosa, endotelial, mesotelial ou da córnea é desnudada, mas a camada basal permanece íntegra (erosão), as células não lesadas das bordas da lesão crescem e reparam completamente o defeito, curso este conhecido como regeneração. A cicatrização é um processo de reparo que se faz às custas da proliferação do tecido conjuntivo fibroso, resultando em cicatriz (ANDRADE, 1995; WATSKY et al., 2000). Este processo pode ser dividido em três fases distintas: inflamação, proliferação e remodelamento (CORDEIRO, et al. 1999; HARDING et al., 2002). Estas etapas são procedidas pela fase “lag”, que começa com o aparecimento da lesão e dura até a migração celular (AGRAWAL e TSAI, 2003).
A resposta imediata do organismo animal a agressões teciduais é representada por inflamação aguda. A infecção da córnea do coelho com
Staphylococcus aureus ou a aplicação de sua α-toxina resulta em uma resposta
inflamatória com severo edema corneano e entrada predominantemente de monócitos e neutrófilos para o estroma corneano, que fagocitam, digerem e removem os agentes causais, por meio de liberação de enzimas e fagocitose (COELHO, 1995; CORDEIRO et al., 1999; SLOOP et al., 1999; HARDING et al., 2002). Conforme a inflamação progride estas células vão diminuindo e sendo substituídas por linfócitos e macrófagos, que coordenam a transição entre a fase inflamatória e a proliferativa, pela liberação de diversos mediadores (CORDEIRO, et al., 1999; HARDING, et al., 2002). Em tecidos vascularizados, mediadores inflamatórios e leucócitos chegam à área inflamada diretamente dos vasos sanguíneos. Já na córnea, devido a ausência de vascularização, isto ocorre por difusão, promovida por processos quimiotáxicos, ou pelo filme lacrimal. As células inflamatórias são originárias principalmente do limbo, conjuntiva bulbar e palpebral (SLOOP et al., 1999).
Seguindo para a fase proliferativa, células dentro e ao redor da margem da lesão secretam uma série de substâncias responsáveis por coordenar a cicatrização da lesão, desde agentes quimiotáxicos e fatores de crescimento, até metaloproteinases (colagenases, estromelisinas e gelatinases) e novas moléculas matriciais. Respectivamente, estes compostos direcionam células para a lesão e as estimulam a proliferar e reparar a matriz lesionada (GIRARD et al, 1991; WATSKY et al., 2000).
A um nível molecular, a cicatrização é controlada por uma variedade de citocinas e fatores de crescimento (WATSKY et al., 2000; HARDING et al., 2002). Os ceratócitos (fibroblastos corneanos), residentes na rede de colágeno do estroma corneano, são uma das células de maior importância envolvidas no processo de proliferação. Eles são responsáveis pela formação do colágeno embrionário e mudança na matriz, ocupando cerca de 10% do volume estromal (WATSKY, 1995; WATSKY et al., 2000; HARDING et al., 2002). Geralmente eles se apresentam num estado quiescente, mas quando ativados, migram para a
região lesionada e proliferam iniciando a resposta cicatricial (LILIOM et al., 1998). Ceratócitos ativados geram proteases, fagocitam corpos estranhos e tecidos lesionados, produzem uma variedade de mediadores (interferon, prostaglandinas e fatores de complemento I) e secretam componentes da matriz extracelular como fibronectinas, colágeno e proteoglicanos (TERVO et al., 1991; LILIOM et al., 1998). A produção da matriz extracelular é vista clinicamente como a formação do tecido de granulação. Enquanto a nova matriz é sintetizada, a matriz existente na margem da lesão é degradada por uma série de enzimas como metaloproteinases e ativadores do plasminogênio tecidual (HARDING et al., 2002). Assim que a cicatrização progride, células dentro da lesão contraem, fechando a sua margem (WATSKY et al., 2000).
Uma vez que o fechamento da lesão foi completado, começa o remodelamento da cicatriz existente. Esta fase pode levar de meses a anos, com redução tanto do conteúdo celular como da irrigação sanguínea (HARDING, et al. 2002). Após realizarem sua tarefa, as células de reparação irão entrar em apoptose, permitindo que a região volte ao máximo para o seu estado normal (WATSKY et al., 2000).
2.3. Mecanismo de Defesa Ocular
O sistema de defesa pode ser classificado como não específico (composto pelas barreiras anatômicas do organismo, secreções e enzimas) e específico (imunidade humoral e celular). O olho é um orgão virtualmente impermeável à maioria dos agentes ambientais. Vários mecanismos fisiológicos e anatômicos contribuem como um escudo contra agressões a esfera e circulação ocular (MOORE e NASISSE, 1999; GHELARDI et al., 2004).
Estes mecanismos incluem um tecido epitelial corneano pouco permeável, uma barreira criada pelo tecido que envolve o olho, limitada ou quase inexistente perfusão sanguínea nos tecidos oculares, secreção ativa de fluídos intra-oculares associado a uma difusão limitada de componentes plasmáticos para dentro do olho, mecanismo de transporte ativo dentro da retina para remoção de substâncias
nocivas, diferenças anatômicas e fisiológicas distintas entre os compartimentos oculares e a proteção do olho pela órbita (MOORE e NASISSE, 1999; LU et al., 2001; GHELARDI et al., 2004).
Outra forma de defesa ocular é a produção contínua de lágrima que apreende debrís, microorganismos, partículas e drogas, e as elimina mecanicamente pelo sistema de drenagem lacrimal, auxiliado pelo reflexo de piscar. A lágrima também possui lactoferrinas, lisoenzimas, imunoglobulinas e defensinas em altas concentrações que podem especificamente reduzir a colonização bacteriana na superfície ocular (MOORE e NASISSE, 1999; GHELARDI et al., 2004; SALAMANCA et al., 2006).
2.4. Ceratite Bacteriana
Bactérias são organismos procariontes, unicelulares, consistindo de uma membrana celular (parede celular e cápsula também estão presentes dependendo do organismo), molécula única de DNA e estruturas especializadas (pili, flagelo). São seres que podem ser encontrados em praticamente todos os meios, vivendo livremente ou associado a outros organismos como parasitas, simbiontes e saprófitos. As espécies parasitas são responsáveis por um grande número de doenças (MARCONDES e LAMMOGLIA, 1996; MOORE e NASISSE, 1999).
São classificados quanto ao método de coloração Gram e por sua forma. O método Gram consiste em corá-las com violeta genciana e depois iodo, formando um composto que é retido. As bactérias que se comportam desta forma são denominadas Gram positivas. Já as Gram negativas não assimilam fortemente a coloração, podendo ser descoradas com álcool. As formas básicas variam entre esférica (coco), bastonete (bacilo), espiralada (espirilos) e em vírgula (vibriões). Cocos dispostos desordenadamente recebem o nome de estafilococos (MARCONDES e LAMMOGLIA, 1996).
Sua reprodução ocorre por cisão binária assexuada e seu crescimento é dividido em quatro fases: “lag”, exponencial, estacionária e declínio. A primeira corresponde a adaptação metabólica ao novo ambiente, aonde o organismo
sintetiza enzimas necessárias para o seu crescimento. A segunda é a proliferativa, e corresponde ao aumento da população. Na terceira há uma diminuição do crescimento limitado pelas condições do meio em que a bactéria encontra-se e, na última fase, as células perdem a capacidade de se dividir e a taxa de morte celular ultrapassa a de divisão (MARCONDES e LAMMOGLIA, 1996; MOORE e NASISSE, 1999).
As ceratites bacterianas são consideradas uma das afecções oculares mais graves que existem, pois podem resultar em perda parcial ou total da acuidade visual. Como a maioria dos patógenos não consegue penetrar na córnea intacta, infecções corneanas derivam essencialmente da falha nos mecanismos de defesa que mantém a superfície ocular íntrega. Fatores que podem levar à ceratite microbiana incluem defeitos no filme lacrimal, trauma por corpos estranhos ou substâncias químicas, reações alérgicas de hipersensibilidade, o uso exagerado de lentes de contato, uso de corticóides tópicos, doenças de superfície ocular, alteração da morfologia palpebral, ceratite herpética, doenças sistêmicas (diabetes), assim como complicações pós-cirúrgicas (DOWLING eGRAHN, 1998; GHELARDI, 2004; KEAY et al., 2006; MCGHEE e NIEDERER, 2006).
2.4.1. Staphylococcus aureus
Stafilococos são cocos gram-positivos, anaeróbicos facultativos e halofílicos, que sobrevivem bem no meio ambiente, apresentando uma alta resistência a ressecamento e desinfecção. Não são inerentemente invasivos e colonizam o epitélio de animais sadios sem causar doenças, sendo patógenos oportunistas (COX, 1998).
Staphylococcus aureus tem sido descrito como uma das causas principais
de infecção bacteriana na córnea de humanos (DAJCS et al., 2001; MOREAU et al., 2002). As principais cepas que causam infecção em pacientes são originárias da flora normal da superfície ocular externa e infectam o tecido corneano quando este se encontra lesionado (CALLEGAN et al., 1994; DAJCS et al., 2001; MARANGON et al., 2004).
S. aureus produz e secreta uma série de proteínas, incluindo colagenase,
proteína A, alpha-, beta-, gamma-, e delta-toxina, e leucocidina, que contribuem para a virulência do microorganismo; elas podem ter um papel importante no mecanismo causador de danos no epitélio e estroma corneanos; induzem inflamação e ajudam a evitar resposta do sistema imune do hospedeiro (CALLEGAN et al., 1994).
2.5. Farmacologia e Terapêutica Ocular
O principal objetivo da terapêutica ocular é atingir concentrações farmacológicas suficientemente altas no tecido alvo sem causar danos tóxicos ao tecido e estruturas do corpo (MOORE e NASISSE, 1999). Em termos de administração de droga podem-se considerar quatro alvos no olho: as pré-estruturas oculares da anteriores ao olho, como a conjuntiva e pálpebras; a córnea; as câmaras anterior e posterior e a cavidade vítrea (DAVIES, 2000).
Alguns fatores devem ser levados em consideração quando se escolhe a via de administração: propriedade do fármaco, sítio de ação desejado, freqüência de administração e concentração necessária (DOWLING e GRAHN, 1998; SLATTER, 2001). Fármacos oftálmicos podem ser formulados para administração tópica como soluções aquosas, suspensões, emulsões, pomadas, sistemas especiais de liberação e administração como implantes oculares e lentes de contato impregnadas (MOORE e NASISSE, 1999).
Quando a área de destino de um fármaco é intra-ocular, este deve ser absorvido da região pré-ocular para o interior do olho. Drogas aplicadas topicamente são distribuídas por três vias: penetração transcorneana, absorção pelos vasos conjuntivais que drenam para o corpo ciliar, e absorção e drenagem pelo sistema nasolacrimal. A penetração transcorneana é a mais importante; considerando-se a terapia para infecções oculares, a administração tópica de medicações no olho é claramente a via terapêutica mais utilizada; devido a este fato, a maioria dos medicamentos oftalmológicos é formulada como colírios (GELATT, 1999; DAVIES, 2000). A administração ocular tópica oferece quatro
grandes vantagens sobre outras vias de administração: efeitos dos fármacos são localizados e uma menor quantidade entra na circulação sistêmica; facilita a absorção do fármaco para dentro do olho que é difícil de ser alcançada com a administração sistêmica; evita o metabolismo hepático; e é um método de administração relativamente cômodo, simples e indolor. No entanto, apesar de seus muitos benefícios, a administração tópica sofre a desvantagem de baixa biodisponibilidade devido a muitos fatores biológicos que existem para proteger o olho e, em conseqüência, limitar a entrada de drogas no aparelho ocular (DAVIES, 2000).
Sendo a principal via de absorção, a córnea atua como uma barreira para a penetração de muitas substâncias aplicadas topicamente. Ela consiste de um estroma hidrofílico entre um epitélio e endotélio hidrofóbicos. A permeabilidade corneana favorece moderadamente compostos lipofílicos. Estes compostos têm freqüentemente uma baixa solubilidade aquosa. Fatores relacionados ao formato e tamanho molecular também influenciam a penetração medicamentosa na córnea. Assim, a biodisponibilidade intra-ocular de medicações administradas topicamente, geralmente, é inferior a 10% (DOWLING e GRAHN, 1998; DAVIES, 2000; SLATTER, 2001; SMITH et al., 2001; THIEL et al., 2002; CHO et al., 2003).
Um dos principais fatores que influenciam na baixa biodisponibilidade de soluções oftálmicas é relacionado à rápida limpeza pré-corneana induzida pela lágrima. Este eficiente sistema de “clearance” torna difícil manter uma concentração pré-ocular efetiva da droga em um período de tempo desejado. Devido às características anatômicas, o volume que pode ser administrado topicamente é limitado a aproximadamente 30µL. Várias formulações têm sido utilizadas para aumentar a retenção de colírio na região pré-ocular, aumentando a sua especificidade lipofílica, ou aumentando a permeabilidade da barreira epitelial (DAVIES, 2000; THIEL et al., 2002). O que obteve maior sucesso foi a inclusão de polímeros que reforçam a viscosidade, particularmente aqueles capazes de interagir com as camadas mucosas sobre a superfície do olho, ou aqueles que podem sofrer uma transição de uma solução para um gel nas condições da área pré-ocular (DAVIES, 2000). Um outro método foi a criação de adesivos mucosos,
onde polímeros interagem com a camada mucosa que protege a superfície externa do olho. A utilização de filmes e implantes medicamentosos também foi proposto, sendo muito eficientes devido à diminuição do período de administração da droga e por não conter aditivos, que causam efeitos colaterais na cicatrização corneana e ocasionam defeitos puntiformes persistentes. A desvantagem é que estes implantes não são absorvidos pelo organismo, tendo que ser retirados manualmente. Já os implantes solúveis oferecem as vantagens dos não solúveis, sem a necessidade de sua retirada (WEYENBERG et al., 2004).
A capacidade de um fármaco em não causar danos tóxicos ou lesões a um sistema biológico é conhecido como biocampatibilidade. A avaliação da biocompatibilidade de implantes requer o conhecimento das características inflamatórias e cicatriciais provocadas por estes materiais. Inflamação, cicatrização e reação a corpos estranhos são consideradas respostas tecidual ou celular as lesões (ANDERSON e SHIVE, 1997)
Assim sendo, a eficiência dos sistemas de liberação controlada de drogas administrados depende da biocompatibilidade e interação com a mucosa ocular, proteção contra degradação, e facilitação da absorção para os tecidos oculares e biodisponibilidade (ANDERSON e SHIVE, 1997; SALAMANCA et al., 2006).
2.6. Antimicrobianos
Drogas antimicrobianas são comumente descritas como bacteriostáticos ou bactericidas. Bacteriostáticos caracterizam fármacos que temporariamente inibem o crescimento de um microorganismo. Drogas tipicamente bacteriostáticas são as tetraciclinas e sulfonamidas. Bactericidas são os grupos de fármacos que causam a morte de microorganismos. Os bactericidas típicos são os ß-lactâmicos, aminoglicosídeos e fluorquinolonas. A escolha do antimicrobiano adequado é baseada em três fatores: susceptibilidade da bactéria ao antimicrobiano de escolha, o sítio de infecção e a capacidade do fármaco de atingir um nível terapêutico no tecido infectado (MAH, 2003).
Fluoroquinolonas são análogos fluorados do ácido nalidíxico. As quinolonas mais antigas não atingiam níveis terapêuticos sistêmicos e eram usadas apenas como anti-sépticos urinários. Após a adição de flúor às quinolonas, em 1967, seus novos derivados adquiriram uma atividade antibacteriana maior (até 1000 vezes mais potentes), com bons níveis nos tecidos e sangue (MAH, 2003). São antimicrobianos com boa penetração ocular e solubilidade intrínseca, e reduzido potencial alergênico e toxicidade, sendo fármacos de primeira escolha no tratamento de ceratites bacterianas (DONNENFELD et al., 1997; MALLARI et al., 2001; POLLOCK et al., 2003; BAREQUET et al., 2004). Elas agem inibindo a topoisomerase tipo II, DNA girase, uma enzima bacteriana que altera a topologia do DNA celular. Células humanas não possuem estas enzimas, por isso a ação das quinolonas é seletivamente em células bacterianas (SMITH et al., 2001; BAREQUET et al., 2004). Atualmente pode-se encontrar fluoroquinolonas de primeira, segunda, terceira e quarta gerações. A Ciprofloxacina é uma fluoroquinolona de segunda geração, com uma potente ação antimicrobiana e amplo espectro de ação. Possui uma eficiente ação contra Staphylococcus, incluindo algumas cepas de S. aureus in vitro, em modelos animais e em ceratites humanas resistentes a metacilina (PRAJNA et al., 2001; MOREAU et al., 2002; KOWALSKI et al., 2003).
2.7. Sistema de liberação controlada de drogas
A necessidade de novos adjuvantes tem levado ao desenvolvimento de sistemas de liberação controlada baseados em dispositivos poliméricos, o que pode permitir uma liberação pulsátil ou sustentada de substâncias encapsuladas ou aprisionadas (LIMA e JÚNIOR, 1999). Polímero é uma molécula grande, composta de unidades menores interligadas conhecidas como monômeros. Os benefícios do sistema de liberação controlada são: a liberação do fármaco à um sítio específico diminuindo a absorção sistêmica, proteção do fármaco contra degradação, taxa de liberação da substância menos dependente das características farmacodinâmicas da mesma, liberação uniforme do fármaco,
homegenidade da taxa de liberação em relação ao tempo com uma única aplicação e melhor aceitação do paciente (LIMA e JÚNIOR, 1999; LALWANI e SANTANI, 2007; KOTWAL et al., 2007).
Sistemas de liberação poliméricos consistem de polímeros que dispersam o seu conteúdo por difusão ou degradação, prolongando o efeito do fármaco de uma maneira constante através do tempo (LIMA e JÚNIOR, 1999). Os implantes são preparados a partir de diferentes polímeros, podendo ser biodegradáveis ou não, e divididos em dois tipos: matriciais (ou monolíticos) e reservatórios (FIALHO et al., 2003).
No sistema matricial, a substância encontra- se homogeneamente dispersa na matriz polimérica ou adsorvida na superfície e a sua liberação ocorre por difusão pelos poros da matriz, por degradação do polímero ou por uma combinação dos dois mecanismos. Caso a velocidade de degradação do polímero seja inferior à difusão do fármaco pela matriz, a liberação inicial dessa é dependente de sua difusão pelo sistema, podendo diferir se ela estiver dissolvida molecularmente ou dispersa no polímero. Quando se utilizam polímeros não-biodegradáveis, a liberação ocorre apenas por um processo de difusão lenta pela matriz (FIALHO et al., 2003; KOTWAL et al., 2007).
No sistema do tipo reservatório, a substância encontra-se em uma cavidade central envolta por uma membrana polimérica, sendo fisicamente aprisionada, a qual controla sua taxa de liberação. Mudanças na natureza e espessura dessa membrana promovem alterações na velocidade de liberação do fármaco. Da mesma maneira que no sistema matricial, no sistema reservatório composto por polímeros não-biodegradáveis a liberação do fármaco ocorre apenas por difusão através da membrana (LIMA e JÚNIOR, 1999; FIALHO et al., 2003; KOTWAL et al., 2007).
Vários fatores são importantes para a formulação destes sistemas: habilidade de liberar a substância aprisionada de uma maneira controlada, que é influenciada pelo peso molecular do polímero, morfologia e a razão do monômero; o tamanho da partícula, importante em termos de interação com células fagocitárias; segurança, relacionado à degradação do polímero in vivo;
estabilidade, tanto na armazenagem quanto nos fluídos biológicos (LIMA e JÚNIOR, 1999).
Uma maneira de se conseguir uma liberação controlada contínua é pelo uso de fármacos encapsulados em polímeros de micropartículas ou microesferas (1 a 1000µm) e nanopartículas ou nanoesferas (1 a 1000nm). Em contraste a outros carreadores, microesferas poliméricas são estáveis o suficiente para permitir a administração por vias tópicas, orais e parenterais. O principal objetivo do microencapsulamento polimérico é o de recobrir o material com um polímero artificial ou natural, biocompatível e biodegradável, que irá proteger prevenir a rápida degradação e liberar o fármaco (LIMA e JÚNIOR, 1999; BOURGES et al., 2003; KOMPELLA et al., 2003). Estes polímeros incluem os naturais a base de proteína (albuminas bovina e humana, o colágeno e a gelatina) e os sintéticos como as poliamidas, poliaminoácidos, polialquilcianacrilatos, poliésteres, poliortoésteres, poliuretanos, poliacrilamidas e copolímeros. Entre os polímeros disponíveis, o poliéstere poli(D,L-lático) (PLA) e o copolímero derivado dos ácidos lático e glicólico, poli-lactato-co-glicolato (PLGA), são os mais utilizados, podendo ser sintetizados em vários tamanhos moleculares e conformações, permitindo o encapsulamento de fórmulas específicas (BOURGES et al., 2003; FIALHO et al., 2003; KOMPELLA et al., 2003).
2.7.1. Microesferas de poli-lactato-co-glicolato (PLGA)
Entre os sistemas poliméricos desenvolvidos para propósitos farmacêuticos, as microesferas de poli-lactato-co-glicolato (Figura 1) têm sido amplamente exploradas em diversos estudos de sistemas de liberação controlada. Microesferas de PLGA são compostas de uma matriz polimérica de formato esférico abrangendo o diâmetro de 1 a 250µm (LIMA e JÚNIOR, 1999). Durante o final da década de 60 e início da década de 70, foram realizados diversos estudos relacionados com a utilização dos polímeros derivados dos ácidos lático e glicólico para a fabricação de fios de sutura. Os resultados mostraram que eles proporcionaram boas propriedades mecânicas, baixa capacidade alergênica, baixa
toxicidade, excelente biocompatibilidade e uma cinética previsível de biodegradação (FIALHO et al., 2003).
FIGURA 1 - Representação esquemática da estrutura química do ácido glicólico, ácido lático e do ácido polilático-co-glicólico (PLGA).
A razão de biodegradação do polímero depende do peso molecular. O PLGA é um polímero com volume erosivo (a degradação produz-se em todo o volume do material simultaneamente), no qual o ingresso de água é mais rápido que a taxa de degradação. Neste caso, a degradação desenvolve até que o peso molecular crítico seja alcançado; neste ponto os produtos da degradação se tornam pequenos o suficiente para serem solubilizados. A estrutura então começa a ficar mais porosa e hidratada o que permite com que a droga dissolvida na matriz polimeral seja liberada, correspondendo ao tempo necessário para se alcançar o peso molecular crítico (LIMA e JÚNIOR, 1999; LALWANI e SANTANI, 2007) .
Após a hidrólise das cadeias terminais, os produtos resultantes são o lactato e o glicolato, que são inócuos ao organismo e eliminados do corpo pelo ciclo de Krebs. Durante a biodegradação, o material encapsulado é liberado, o que
pode levar de horas até meses dependendo da combinação de polímeros (LIMA e JÚNIOR, 1999; FIALHO et al., 2003; KOMPELLA et al., 2003).
O diâmetro das microesferas desempenha um papel importante na interação com células fagocitárias. Partículas menores que 10µm podem ser fagocitadas mais rapidamente por macrófagos, que são recrutados para a área de administração após a injeção. Já partículas maiores permanecem como reservatórios provendo uma liberação constante. A fagocitose de partículas biodegradáveis depende do seu tamanho, carga superficial e hidrofobicidade (LIMA e JÚNIOR, 1999). Com relação ao PLGA, quanto maior a proporção de ácido lático, maior a hidrofobicidade do copolímero, absorvendo menos água e, conseqüentemente, diminuindo a sua velocidade de degradação (FIALHO et al., 2003).
3. OBJETIVO
O presente trabalho visa analisar um sistema de liberação controlada de drogas composto por micropartículas do polímero de poli-lactato-co-glicolato (PLGA) e ciprofloxacina no tratamento de ceratites corneanas infectadas por
Staphylococcus aureus. Testando a sua capacidade de atingir concentrações
terapêuticas no humor aquoso e eliminar a contaminação bacteriana experimental na cornea.
Tem como finalidade também verificar se o sistema de liberação controlada é capaz de aumentar a biodisponibilidade do fármaco carreado e ao mesmo tempo manter-se biodegradável e biocompatível com o organismo receptor.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Preparo do inóculo bacteriano
4.1.1. Bactéria
Para produzir ceratite nos animais estudados foi utilizada uma linhagem com padrão internacional, Staphylococcus aureus ATCC 25923, previamente descrita como causadora de ceratite em coelhos e analisada em estudos de tratamento experimental de ceratite bacteriana. O cultivo bacteriano foi elaborado pelo laboratório do Departamento de Microbiologia do Instituto de Biociências da UNESP – Campus de Botucatu.
4.1.2. Padronização do inóculo
Para verificação da pureza da amostra, Staphylococcus aureus ATCC 25923 foi semeado em placa de ágar sangue por 24 horas a 37º C. Para o preparo do inoculo, colônias de S. aureus foram semeadas em caldo Infusão de Cérebro e Coração (BHI) e, após incubação por 24 horas a 37º C, a turvação foi ajustada de acordo com a escala 0,5 de McFarland, utilizando solução salina (0,85 %) como diluente; a turbidez corresponde aproximadamente a uma contagem de 108 UFC/ml.
4.2. Preparação das micropartículas de ciprofloxacina
O preparo das micropartículas foi realizado no laboratório da Universidade Estadual Paulista-Unesp de Araraquara, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, no Departamento de Fármacos e Medicamentos Grupo de Nano e Microsistemas Farmacêuticos. Hidroclorido de ciprofloxacina1 foi dissolvido em etanol2 e água (na
1 Hidroclorido de ciprofloxacina – Sigma-Aldrich Inc. – Estados Unidos da América 2 Etanol – Merck S.A. - Brasil
proporção de 1:1) e adicionados a soluções de polímero de PLGA em acetona para obter misturas entre fármaco/polímero. As micropartículas foram obtidas pelo processo de spray drying que consiste basicamente em dispersar o polímero e o fármaco em um solvente ou sistema solvente, e atomizá-los, via aspersor, para originar microgotas que, ao entrarem em contato com o ar em temperatura próxima ou superior ao ponto de ebulição do solvente, proporcionam a evaporação do mesmo de forma rápida e dinâmica, formando as micropartículas (FU et al., 2002; SILVA-JÚNIOR, 2005).
4.3. Delineamento experimental
4.3.1. Comissão de ética
O estudo foi conduzido de acordo com os princípios éticos na experimentação animal e foi aprovado pela Câmara de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP de Botucatu (protocolo 113/2008 CEEA).
4.3.2. Procedimento anestésico
A anestesia foi realizada com associação de acepromazina3 (0,5mg/kg),
xilazina4 (5mg/kg) e ketamina5 (35mg/kg), administrados por via intramuscular, e morfina6 (3mg/kg) por via subcutânea para os procedimentos de inoculação bacteriana intra-corneana e aplicação da ciprofloxacina de liberação controlada. Colírio tópico de cloridrato de proximetacaína 0,5%7 foi utilizado como
complemento anestésico. A colheita das biópsias corneanas, swabs da superfície ocular e humor aquoso para análise da concentração de ciprofloxacina foram
3 Acepran – Univet - Brasil 4 Anasedan – Vetbrands - Brasil 5 Dopalen – Vetbrands - Brasil 6 Dimorf – Cristalia - Brasil 7 Anestalcon – Alcon - Brasil
realizadas logo após a eutanásia (quinto dia de experimento) com pentobarbital sódico8.
4.3.3. Modelo experimental
Foram utilizados 20 coelhos (2-3kg) da raça branca Neozelandesa, sadios e sem problemas oculares. Os animais foram divididos em quatro grupos de acordo com a metodologia descrita abaixo, dos quais foi observado apenas o olho esquerdo de cada animal.
I. Grupo (G1) contendo cinco animais (indivíduos 1, 2, 3, 4, 5) induzidos à ceratite bacteriana experimental, tratados por cinco dias com uma gota de solução fisiológica (SF), a cada 6 horas.
II. Grupo (G2) contendo cinco animais (indivíduos 6, 7, 8, 9, 10) com córnea sadia, tratados com aplicação subconjuntival única de 0,2ml contendo 2mg de ciprofloxacina de liberação controlada e observados por cinco dias. III. Grupo (G3) contendo cinco animais (indivíduos 11, 12, 13, 14, 15) induzidos
à ceratite bacteriana experimental, tratados por cinco dias com uma gota de ciprofloxacina 0,3%, a cada 6 horas.
IV. Grupo (G4) contendo cinco animais (indivíduos 16, 17, 18, 19, 20) induzidos à ceratite bacteriana experimental, tratados com aplicação subconjuntival única de 0,2ml contendo 2mg de ciprofloxacina de liberação controlada e observados por cinco dias.
Todos os tratamentos tiveram início 5 horas após a inoculação intra-estromal do S. aureus, sendo descrito por Callegan et al. (1994) como o tempo ideal para o tratamento de ceratites bacterianas por ciprofloxacina. A aplicação do sistema de liberação controlada foi realizada na região bulbar dorso-medial no espaço subconjuntival utilizando-se uma agulha 13x0,45mm9 e seringa de 1ml10, como descrito por Amrite et al. (2006).
8 Thiopentax – Cristalia - Brasil
9 Agulhas BD PrecisionGlidetm – BD - Brasil 10 Seringas BD Plastipaktm – BD - Brasil
4.3.4. Inoculação do S. aureus para a indução da ceratite bacteriana experimental
Após o procedimento anestésico anteriormente descrito, anti-sepsia da superfície ocular foi realizada com solução de iodo povidine diluída em solução fisiológica em concentração de 5%. Procedeu-se à imobilização palpebral por meio de um blefaroestato Barraquer11 e à centralização do bulbo ocular com o auxílio de uma pinça de conjuntiva Bonn12. A inoculação do S. aureus foi feita
conforme a técnica descrita por Barequet et al. (2004). Foi utilizada uma seringa Hamilton13 graduada em microlitros, com a introdução do bizel da agulha na periferia corneana até o terço médio da profundidade estromal (Figura 2A); esta foi então avançada até o centro da córnea aonde 2,5µl do inóculo foram injetados (Figura 2B).
A B
FIGURA 2- (A) Introdução da agulha no estroma corneano e (B) inoculação do
Staphylococcus aureus na região central da córnea.
11 Befarostato aramado Barraquer recém-nascido - Odous - Brasil 12 Pinça p/ conjuntiva mod. Bonn – Odous - Brasil
4.3.5. Análise clínica pela lâmpada de fenda
Exames diários feito pelo mesmo observador foram realizados pela biomicroscopia em lâmpada de fenda14 nos períodos de 24 (dia 1), 48 (dia 2), 72 (dia 3), 96 (dia 4) e 120 horas (dia 5) pós inoculação e classificados como descrito por Callegan et al. (1994) e Sloop et al. (1999). Foram analisadas as seguintes alterações clínicas: hiperemia conjuntival, quemose, irite, presença de fibrina na câmara anterior, hipópio, infiltrado e edema estromais. Valores foram atribuídos de zero a quatro para cada alteração, sendo zero equivalente à ausência de alteração, um para leve, dois para moderada, três para moderada/severa e quatro para severa. Os valores dos parâmetros de cada indivíduo foram então somados abrangendo uma variação de zero (olho sem alteração) a vinte e oito (olho com inflamação máxima).
4.3.6. Colheita de secreção ocular e tecido corneano para cultivo microbiológico
A colheita do material foi realizada com swab estéril15 e por punch16 descartável estéril de 4mm da espessura total da córnea (primeira biópsia), de parte da região do inóculo bacteriano, após a eutanásia dos animais (dia 5). O
swab foi mantido em contato com a córnea e conjuntivas palpebrais por 20
segundos e, posteriormente, preservado em um recipiente estéril até o seu processamento. O fragmento corneano foi mantido em um frasco estéril com solução salina para análise.
4.3.7. Processamento microbiológico
A secreção ocular coletada por swab e biopsia corneana foi processada pelo laboratório de microbiologia do Departamento de Moléstias Infecciosas da
14 904 Slit Lamp – Clement Clarke International Ltd. - Inglaterra 15 Sterile Swab – IVD - Italia
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP de Botucatu. As amostras foram semeadas em condições de aerobiose a 37oC, em meio de MacConkey e agar sangue contendo 10% de sangue desfibrinado de ovelha; foram observadas pelo período de 24, 48, 72 e 96 horas. O material que se apresentou com isolamento positivo teve seus agentes caracterizados macroscópica, microscópica (morfotinturial) e bioquimicamente, segundo Quinn et al. (1994).
4.3.8. Colheita de biopsia corneana para exame histopatológico
Foram obtidos fragmentos por punch de 4mm da espessura total da córnea (segunda biópsia), da região restante do inóculo bacteriano e da conjuntiva no local do depósito de PLGA de ciprofloxacina. O grupo G2 que não recebeu a inoculação do S. aureus, foi biopsiado na região central da cornea, supostamente na mesma localização das biópsias dos outros grupos. Não foi realizada a coleta de material conjuntival dos grupos G1 e G3 devido à ausência da medicação de liberação controlada. O material coletado foi mantido em formol 10% até o seu processamento pelo Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP de Botucatu. Os cortes histológicos foram fixados e depois corados por hematoxilina-eosina (HE).
4.3.9. Colheita de humor aquoso para análise farmacológica
A punção da câmara anterior foi realizada com uma agulha de 13x0,45mm17 acoplada a uma seringa de 1ml18 para coleta de humor aquoso para exame de high-performance liquid chromatography (HPLC) logo após a eutanásia (dia 5) e seis horas após a última instilação de colírio no grupo G3. Aproximadamente 0,2ml de cada animal foi coletado (olho esquerdo apenas) e
17 Agulhas BD PrecisionGlidetm – BD - Brasil 18 Seringas BD Plastipaktm – BD - Brasil
acondicionado a -80oC até o momento de processamento das amostras pelo Laboratório de Análises Químicas da Fundação de Estudos e Pesquisas Agrícolas e Florestais (FEPAF).
4.3.10. Preparo e análise das amostras de humor aquoso
As amostras foram diluídas em solução de ácido fosfórico pH 3,0 na proporção de 1:1, com exceção das amostras dos animais 13 e 15 que foram diluídas na proporção de 1:3 (amostra:diluente) devido a pouca quantidade de humor aquoso coletado; foram então analisadas pelo Sistema Shimadzu de HPLC composto por bomba LC-10AD19 e software para aquisição e tratamento de dados LC Solution - versão 1.22 SP120. Os comprimentos de onda utilizados no detector
de fluorescência foram de 278 nm para excitação e 455 nm para emissão.
Para quantificação foi utilizada calibração externa, sendo os padrões (0,25 ng/mL, 0,5 ng/mL, 0,75 ng/mL, 1 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 15 ng/mL) injetados em triplicata. Os valores de coeficiente de variação para área variaram de 1,7 a 4,1% (ponto de calibração 0,25 ng/mL), sendo o coeficiente de correlação obtido para a curva analítica igual a 0,9996.
4.4. Análise Estatística
Foi utilizada a técnica de análise de variância não-paramétrica para o modelo de medidas repetidas em grupos independentes complementada com o procedimento de comparações múltiplas SNK entre todos os pares (ZAR, 1999). Todas as comparações foram realizadas no nível de 5% de significância.
Para as concentrações de ciprofloxacina foi realizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis complementado com o método de Dunn para as comparações múltiplas no nível de 5% de significância (ZAR, 1999).
19 S
HIMADZU LC-10ALIQUID CHROMATOGRAPH -Shimadzu Corporation - Japão
5. RESULTADOS
5.1. Resultados clínicos avaliados pela biomicroscopia em lâmpada de fenda
Todos os animais de todos os grupos apresentaram uma melhora gradativa das lesões, sendo que os grupos G3 e G4 apresentaram, ao final do quinto dia valores semelhantes ao grupo G2 que teve inoculação bacteriana. O Grupo G1 obteve os piores resultados clínicos (Tabela 2). Sinais clínicos observados pela biomicroscopia em lâmpada de fenda mostraram uma regressão significativa dos sinais clínicos (hiperemia conjuntival, quemose, irite, presença de fibrina na câmara anterior, hipópio, infiltrado estromal e edema estromal) nos primeiros três dias de tratamento do grupo G4, indicando uma eficácia maior no controle bacteriano no início da infecção (Tabela 2, Figura 11, Figura 12, Figura 13 e Figura 14). O animal 18 teve um índice pior em relação ao seu grupo devido ao extravasamento da cultura bacteriana para a câmara anterior logo após a sua inoculação no estroma corneano. O grupo G2 demonstrou o menor valor em todo o período de tratamento devido à ausência do S. aureus inoculado no estroma corneano.
Estatisticamente o grupo G1 apresentou sempre os piores valores, em todos os momentos, quando comparado com os outros grupos. O grupo G3 não apresentou diferença ao grupo G4 no primeiro dia, mas piorou no segundo dia, e se igualou novamente com o G4 no último dia. O grupo G2 obteve os melhores resultados em todos os momentos; apenas no quinto dia de tratamento não houve diferença estatística entre ele e os grupos G3 e G4. Comparando os momentos dentro dos grupos, o G1, G2 e G3 mostraram uma melhora clínica do terceiro dia em diante, enquanto que o G4 a apresentou a partir do segundo dia de tratamento (Tabela 1 e Figura 3).
5.1.1. Hiperemia conjuntival
Sete horas após a inoculação do S. aureus, houve o aparecimento de hiperemia conjuntival nos grupos G1 e G3. Nos grupos G2 e G4, o início do sinal ocorreu logo após a administração do antibiótico subconjuntival, ou seja, cerca de cinco a seis horas após o início do experimento. A hiperemia persistiu até o fim do tratamento nos grupos G1, G2 e G4, sendo mais severa no grupo G1. Já o grupo G2 apresentou melhora no quarto dia de tratamento (Tabela 3).
O melhor resultado apresentado pelos grupos foi o do G2, que estatisticamente superou os outros grupos na maioria dos momentos, porém a hiperemia conjuntival ainda esteve presente no quinto dia. O grupo G3 denotou melhor resultado no último dia de tratamento, eliminando o sintoma e diferindo de G1, G2 e G4. Os grupos G3 e G4 tiveram valores semelhantes durante quase todo o tratamento, diferindo apenas nos segundo e quinto dias. O grupo G1 teve os piores resultados em todo o experimento. Comparando os momentos dentro de cada grupo, todos obtiveram um resultado estatístico melhor nos terceiro e quarto dias, a não ser o G3 que teve uma diferença entre quase todos os dias (Tabela 4 e Figura 4).
5.1.2. Quemose
A quemose surgiu 10 minutos após a administração da ciprofloxacina de liberação controlada (grupos G2 e G4). Nos grupos G1 e G3, o edema conjuntival iniciou-se uma hora após a inoculação da bactéria no estroma corneano. Quase todos os animais apresentaram melhora completa, a partir do terceiro dia de tratamento. O grupo G2 foi o que apresentou os menores índices, de leve a ausente. Dois animais do grupo G4 (18, 20) tiveram uma quemose severa, com progressiva melhora até completa ausência (Tabela 5).
A única diferença entre os grupos com relação à quemose foi a do grupo G1 no primeiro momento; a partir daí não houve diferença entre os grupos. Comparando dentro dos grupos, o G2 estatisticamente igual durante todos os
