a. Em balão volumétrico de 100ml; adicionar 10ml de solução tisab IV e completar o volume com água destilada e deionizada.
b. Transferir para bequer de 100ml e mergulhar os eletrodos de ion específico e de referência. Manter velocidade de agitação constante (utilizar a mesma velocidade para leitura da amostra),
c. Utilizando micro-pipeta de 100 microlitros, acrescentar sucessivamente os volumes indicados na tabela abaixo, anotando os potenciais desenvolvidos para cada volume adicionado.
Vol. sol. padrão (1000 ppm) Concentração após adição
100 microlitros 1 ppm 100 microlitros 2 ppm 100 microlltros 3 ppm 100 microlitros 4 ppm 100 microlitros 5 ppm 100 microlitros 6 ppm 100 microlitros 7 ppm 100 microlitros 8 ppm 100 microlitros 9 ppm 100 mlcrolitros 10 ppm
d. Traçar a curva, anotando os potenciais obtidos em ordenada e a concentação em abcissa (papel semi-logarítmico), ou então, uma equação de regressão, na qual o coeficiente de correlação deverá ser próximo a 1,0000.
3. Proceder prova de recuperação de fluoretos de cálcio ou sódio, utilizando água destilada é deionizada.
SOLUCOES REAGENTES E VOLUMÉTRICAS: a. Solução reagente de hidróxido de sódio.6N
Pesar exatamente 24,6g de NaOH P.A. em bequer. Dissolver com água destilada e deionizada e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 100ml. Esfriar, completar o volume e homogeneizar.
b. Solução resgente de ácIdo clorídrico 1:1
Diluir uma parte de HCl em uma parte de água destilada. c. Solução reagente de ácido clorídrico 10% .
Transferir 8,4ml de HCl P.A. (d = 1,19 g/ml) para balão volumétrico de 100ml contendo aproximadamente 70 ml de água destilada. Esfriar e completar o volume. d. Solução indicadora de verde de bromocresol 0,1%
Dissolver 0,1g de verde de bromocresol P.A. em álcool etílico P.A.
Transferir quantitativamente para balão volumétrico de 100ml e completar o volume (pH = 3,8 - cor amarela; pH = 5,4; - cor azul).
e. Solução tampão TISAB IV pH 5,3 - 5,4
Em bequer de 500ml dissolver em água destilada e deionizada 145g de NaCl P.A., 142,5ml de ácido acético P.A., 10g de CDTA. Ajustar o pH em 5,3 - 5,4 com NaOH 6N, transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1000ml e completar o volume com água destilada e deionizada. O pH final deverá ser 5,3 a.5,4.
OBSERVAÇÃO: No preparo da solução tampão, a temperatura deve ser conrolada, pois o CDTA decompõe-se em temperaturas superiores a 55ºC.
f. Solução padrão de Flúor 1.000 ppm.
Dissolver em água destilada deionizada exatamente 2,2105g de NaF P.A. previamente seco em estufa 105ºC, durante 2 horas e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1000ml. Completar o volume e homogeneizar.
MÉTODO Nº 29 - FLÚOR (POTENCIOMÉTRICO II)
APLICAÇÃO: Fosfatos naturais, industrializados e misturas que os contenham.
PRINCÍPIO: A atividade iônica do fluoreto em solução é medida através de eletrodo ion especifico cuja resposta corresponde a variação do potencial elétrico proporcional a concentração.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Potenciômetro com escala em milivolts - Eletrodo ion especifico para flúor - Eletrodo de referência
- Agitador magnético.
- Balança analítica precisão +/- 0,0001g - Bequer de 50 e 30ml. - Balões de .1000, 500 e 250ml - Funis analiticos - Pipetas volumétricas de 20, 25 e 50ml - PIaca aquecedora REAGENTES:
- Fluoreto de sódio P.A. - Hidróxido de amônio P.A. - Ácido cítrico P.A.
- Tampão citrato neutro de amônio pH 7,0 - Azul de bromotimol P.A.
- Ácido clorídrico P.A. PROCEDIMENTO:
1. Pesar 0,5000g de amostra, transferir para bequer de 300ml.
2. Adicionar 5ml de HCI concentrado, aquecer brandamente e adicionar água destilada até 100ml.
3. Adicionar solução de hidróxido de amônio 1:1 para precipitação dos metais (até a turvação da solução).
4. Adicionar algumas gotas de azul de bromotimol e ácido cítrico 7% para complexação dos metais, até a viragem de azul para amarelo.
5. Transferir quantitativamente para balão 250ml sem filtrar. Avolumar e agitar.
6. Pipetar volumétricamente uma alíquota de 20ml para bequer de 50ml e adicionar 20ml de citrato neutro de amônio pH 7,0.
7. Proceder a determinação potenciométrica em milivolts com agitação constante, e após estabilização (mínimo 3 minutos), fazer a leitura.
CÁLCULO:
As leituras são realizadas em milivolts e transformadas em ppm. Através de um gráfico ou de uma equação de regressão.
P ONDE:
P = Peso amostra em grama S = Volume da solução estoque
L = Leitura de flúor obtida na curva em ppm PREPARO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO:
1. A partir de uma solução de 1000ppm de flúor, preparar padrões de 1; 10 e 100ppm. 2. Em bequeres de 50ml identificados como: 1ppm, 10ppm e 100ppm, adicionar 20ml de citrato neutro de amônio e 20ml dos respectivos padrões.
3. Leituras - Acertar o padrão de 10ppm em zero relação milivolts. Deixar estabilizar, em seguida ler os padrões de 1 e 100ppm, com agitação constante.
4. Plotar as leituras em gráfico (papel monolog) ou construir uma equação de regressão (logarítmo da concentração x milivolts), na qual o coeficiente de correlação deverá ser próximo de 1,0000.
OBSERVAÇOES:
1. As condições de leitura potenciométrica da amostra (tempo de estabilização, temperatura da solução, agitação) deverão ser as mesmas aplicadas na preparação da curva padrão.
2. No cálculo da concentração de fluoreto contido na amostra, o volume da alíquota utilizada não é considerado, como também não é considerado na realização da curva. O gráfico fornece diretamente, o teor de flúor no balão de diluição.
SOLUÇOES REAGENTES E VOLUMÉTRICAS: a. Solução padrão de flúor 1000ppm
Secar o NaF a 105ºC por duas horas. Pesar exatamente 2,2105g e transferir para balão volumétrico de 1000ml. Completar o volume com água destilada deionizada. b. Solução padrão de flúor 100 ppm
Pipetar 50ml da solução padrão 1000ppm, transferir para o balão volumétrico 500ml. Completar o volume com água destilada deionizada.
c. Solução padrão de flúor 10 ppm
Pipetar 50ml da solução de 100ppm, transferir para o balão 500ml. Completar o volume com água destilada deionizada.
d. Solução padrão de flúor 1ppm
Pipetar 50ml da solução, de 10ppm, transferir para balão volumétrico de 500ml. Completar o volume com água destilada deionizada.
e. Acldo cítrico 7%
Pesar 7,0g de ácido cítrico P.A., solubilizar em água destilada.
Transferir para o balão 100ml. Completar o volume com água destilada deionizada. f. Hidróxido de amônia 1:1
Adicionar 50ml de NH4OH em 50ml de água destilada e homogeneizar. g. Citrato neutro de amônia - pH 7,0
Dissolver 370g de ácido cítrico em 1,5 I de água destilada. Neutralizar com 345ml de hidróxido de amônio. Esfriar e acertar o pH em 7,0 com hidróxido de amônio e/ou ácido cítrico. Guardar em frasco fechado.
h. Indicador azul de bromotimol 0,1%
Dissolver 0,1g de azul bromotimol em 20ml de álcool, transferir para balão de 100ml e completar o volume com água destilada.
MÉTODO Nº 30-AFLATOXINAS I - CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
APLICAÇÃO: Produtos ou sub-produtos de origem vegetal, rações e concentrados. PRINCÍPIO: O método baseia-se na separação cromatográfica e a detecção é feita pela fluorescência das aflatoxinas quando expostas à luz ultravioleta (366nm). Obtém-se o resultado pela comparação com padrões de concentração conhecida igualmente aplicados na placa cromatográfica;
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Cromatoplacas silicagel 60 para TLC-0,2mm espessura, tamanho 20 x 20cm sem indicador de flúorescência
- Microseringa graduada de 25 microlitros - Balões volumétricos de 25, 50 e 100ml - Agitador magnético
- Funil de Buchner de 12cm de diâmetro - Funil de separação de 125ml
- Pipetas volumétricas - Erlenmeyer
- Papel de filtro
- Cromato visor munido de lâmpada com emissão a 3650 A e 15 watts - Cadinho de vidro com placa filtrante
- Tubo cromatográfico (22 x 300mm).
- Silicagel,60 (0,063 - 0,2mm) ativada para cromatografia em coluna - LS de vidro
- Câmara cromatográfica com tampa (22 x 23 x 10cm) REAGENTES:
- Éter etílico anidro P.A. - Clorofórmio P.A. - Acetona P.A. - Alcool metílico P.A. - Hexano P.A.
- Sulfato de sódio anidro P.A. - Carbonato básico de cobre II P.A.
- Padrões de aflatoxinas B1 - B2 - G1 - G2 PROCEDIMENTO:
a. PREPARAÇÃO DAS SOLUÇOES PADRÕES:
Diluir os padrões de aflatoxinas B1 - B2 - G1 - G2 na forma cristalina, com solução de benzeno + acetonitrila (98 + 2) de modo a se obter concentrações de 8 a 10ug/ml.Manter sob refrigeração constante a 0ºC e em frasco ambar herméticamente fechado.
Diluir novamente obtendo-se soluções padrões de trabalho com concentração 0,1 a 0,5ug/ml e manter sob as mesmas condições de estocagem. Observar se não está havendo perda de solvente por evaporação, pois neste caso ocorrerá alteração na concentração da solução padrão.
Pesar 50g de amostra moída em erlenmeyer de 500ml. Umedecer completamente a amostra e adicionar 250ml de cloroformio. Tampar a boca do frasco com papel alumínio e deixar sob agitação magnética por 30 minutos.
Filtrar em papel de filtro. Se a filtração for muito lenta, usar vácuo fraco. c. PURIFICAÇÃO DO EXTRATO:
Preparar tubo cromatográfico (22 x 300mm) colocando bolas de lã de vidro no fundo, seguindo-se 5g de Na2SO4 anidro (base para a silica gel). A seguir juntar 10g de silicagel 60 (0,063 - 0,2mm) ativada por secagem durante uma hora em estufa.
Adicionar 5g de sulfato de sódio anidro, e lavar a coluna com 30ml de clorofórmio. Transferir 50ml de extrato da amostra para a coluna e diluir em fluxo máximo com 100ml de hexano seguido por 100ml de éter etílico P.A. e descartar.
Diluir aflatoxinas com 150ml de metanol + clorofórmio (5 + 145) coletando totalmente esta fração desde o seu início até o final.
Adicionar pérolas de vidro e evaporar até próximo de 5ml em banho-maria.
Acrescentar 4g de sulfato de sódio anidro e 2g de carbonato básico de cobre II. Agitar vigorosamente e filtrar através de cadinho de vidro com placa filtrante para bequer de 50ml e evaporar até a secura.
Diluir o extrato purificado com cloroformio a volume: apropriado e aplicar em CCD. d. CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA:
Aplicar a 2cm da base da cromatoplaca com auxílio de uma microseringa, alíquotas de extrato purificado e do padrão de aflatoxinas. A aplicação deve ser feita de modo que o diâmetro do spot não seja superior a 5mm.
Desenvolver em câmara cromatográfica contendo 200ml da mistura cloroformio + acetona + água (72 + 25 + 3) recem preparada, até 10cm acima do local das alíquotas.
Para auxiliar a saturação da câmara, colocar papel de filtro no seu interior encostado nas paredes.
Remover a placa da câmara, evaporar o solvente a temperatura ambiente e examinar sob luz ultravioleta de comprimento de onda longo em cabine Cromato visor.
Observar a fluorescência no mesmo patamar em relação aos padrões das aflatoxinas. Em ordem decrescente de Rf teremos B1 - B2 - G1 - G2.
e. INTERPRETAÇÃO DO CROMATOGRAMA:
Comparar as alturas de Rf entre a amostra e o padrão spots fluorescentes na amostra atribuidos a aflatoxinas deverão ter valor idêntico de Rf e ser similar na coloração. NOTA: Desde que spots da amostra e padrão são comparados diretamente na mesma placa, o valor do Rf não é importante, pois este pode variar de placa para placa.
Para quantificar a toxina deverão ser considerados os spots do padrão daamostra contendo a mesma intensidade de fluorescência.
CÁLCULO:
S. Y. V ug/kg = X. W ONDE:
S = ul aplicado do padrão
Y = Concentração do padrão em ug/ml V = ul final do extrato da amostra X = Volume aplicado da amostra em ul W = Peso da amostra no extrato em gramas
CONFIRMAÇAO QUÍMICA DA IDENTIDADE DAS AFLATOXINAS:
Desde que a detecção de aflatoxinas por CCD não é evidência conclusiva da sua identidade, uma confirmação mais eficiente deve ser feita. Desta forma, testes confirmativos envolvendo a formação de derivados químicos tem sido desenvolvidos. Estes métodos confirmativos envolvem o isolamento da aflatoxina por coluna e CCD, são morosos e difíceis para alguns analistas. Um método simples e rápido para confirmação da aflatoxina B1 foi desenvolvido por Przbylski no qual a aflatoxina B1 extraída da amostra é convertida em aflatoxina B2a diretamente na placa de CCD. O teste é baseado na ação catalítica do ácido trifluoracético com a adição de água através da dupla ligação do anel terminal de furano da aflatoxina B1. Aflatoxina G1 é convertida da mesma maneira em G2a; B2 e G2 não são afetadas. Essa reação tem sido utilizada como base em vários artigos publicados como método de confirmação de aflatoxina B1 e G1.
Um microlitro de ácido trifluoracético é aplicado diretamente sobre o spot contendo o extrato de aflatoxina assim como no spot padrão na linha de origem da placa CCD. Após reação, o ácido trifluoracético catalítico é evaporado por corrente de vapor; a placa é desenvolvida com acetona-clorofórmio (15 + 85). O derivado B2a aparece como uma fluorescencia azul a um Rf cerca 1/4 do valor normal ao da aflatoxina B1. Em adição com a condição de evidenciar a confirmação, o teste poderia revelar a presença de spots estranhos no Rf da aflatoxina B1 e G1, os quais contribuiriam na fluorescência total dos spots, resultando em superestimação do conteúdo de aflatoxina na amostra.
A técnica de Przybylki também inclui um teste no qual a aflatoxina, após desenvolvimento CCD, e feito spray com H2S04 25%, e por esse meio mudança na fluorescencia de azul para amarelo. Este teste oferece confirmação adicional das aflatoxinas, e é especialmente muito usado quando presentes a pequenos níveis em extratos de amostras com altos background, e particularmente útil na detecção de uma análise falsamente positiva para aflatoxina.
DETERMINAÇÃO:
Dividir a placa de silica gel em duas metades idênticas. Cobrir uma delas com um vidro limpo. Na outra colocar duas alíquotas (spots) de 1-10ul da amostra contendo 0,5 - 5,0ng de aflatoxina. Colocar também dois spots de padrão com a mesma concentração das amostras.
Colocar 1ul de ácido trifluoracético em cada um dos três spots, e deixar a reação ocorrer por 5 minutos. Manter corrente de vapor sobre a placa por 10 minutos.
Na outra metade coberta da placa aplicar alíquotas idênticas eliminando o tratamento com ácido trifluoracético.
Desenvolver a placa em clorofórmio + acetona (85 + a15) ou acetado de etila saturado com água. Colocar 200 ml do solvente diretamente na cuba de eluição.
Após desenvolvimento examinar a placa de CCD sob luz UV de comprimento de onda longo. Aflatoxinas sem tratamento com ácido trifluoracético devem aparecer próximas ao topo da placa. Derivados fluorescentes azuis (B2a e G2a) deverão aparecer a Rf aproximadamente 1/4 aos da Bl e G1.
Borrifar a placa com solução de H2SO4 (1 + 3) para mudar a fluorescência da aflatoxina de azul ou azul-esverdeado para amarelo como uma confirmação adicional de aflatoxinas. Usar este teste somente para confirmar a ausência de aflatoxinas, isto é, spots os quais não se tornaram amarelos são positivamente ausentes de aflatoxinas, visto que muitos outros materiais, além da aflatoxina, podem dar reação com H2S04 desenvolvendo coloraçó amarela.
A seguir são notificadas algumas precauções que servem como advertência, envolvendo o uso de compostos tóxicos e inflamáveis.
a. Destilações, extrações e evaporações com líquidos inflamáveis. Executar estas operações atraves de equipamentos apropriados como banno-maria, vapor ou manta aquecedora. Utilizar sistema eficaz de eliminação de gases para remover vapores inflamáveis que possam ser produzidos. Deixar abertura ampla no frasco e adicionar pérolas de ebulição antes de iniciar o aquecimento.
b. Acetonitrila. Tóxico. Evitar contato com a pele e os olhos. Usar sistema eficaz para eliminação de vapores. HCN é liberado quando em contato com ácido.
c. Benzeno.Tóxico. Altamente inflamável. Evitar contato com a pele e inalação. Utilizar sistema eficiente para eliminação de vapores. Considerado carcinogênico.
d. Acetona. Inflamável. Forma peróxidos explosivos com agentes oxidantes. Utilizar sistema eficaz para eliminação de vapores.
e. Hexano. Inflamável. Utilizar sistema eficaz para eliminação de vapores.
f. Éter Etílico. Armazenar sob proteção da luz. Inflamável. Utilizar sistema eficaz para eliminação de vapores. Evitar eletricidade estática. Peróxidos instáveis podem se formar após armazenamento prolongado ou exposição dos frascos a luz solar.
g. Alcool Metílico. Inflamável. Tóxico. Evitar contatos com a pele, olhos e inalação. Utilizar sistema eficaz para eliminação dos vapores.
h. Clorofórmio. Evitar inalação. Utilizar sistema eficaz para elimina os vapores. Considerado carcinogênico.
i. Micotoxinas são substâncias de toxicidade elevada e tidas como carcinogênicas. Devem ser manipuladas com muito cuidado e a máxima proteção possível.
j. Usar luvas quando manipular toxinas em sua forma cristalizada. k. Descontaminar a vidraria com hipoclorito de sódio 1%.
MÉTODO Nº 31-AFLATOXINAS II-CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
APLICAÇÃO: Produtos e sub-produtos de origem vegetal, raçoes e concentrados . PRINCÍPIO: O método baseia-se na separação cromatográfica e a detecção é feita pela fluorescência das aflatoxinas quando expostas a luz ultravioleta (366nm). Obtém-se o resultado pela comparação com padrões de concentração conhecida, igualmente aplicados na placa cromatográfica.
MATERIAL E EQUIPAMENTO: - Balança semi-analítica - Banho-maria
- Agitador magnético ou liquidificador - Câmara escura com lâmpada ultra-vloleta - Secador
- Pipetas
- Provetas de 50ml, 100ml - Funil de vidro 100mm
- Bequer de 100ml, 250ml - Balões volumétricos 5ml, 10ml
- Funil de separação de 500ml tipo pera - Cápsulas de porcelana capacidade de 200ml - Micro seringas 10ul, 50ul
- Cuba de vidro com tampa esmerilhada - 20 x 20 x 10 - Erlenmeyer com tampa esmerilhada de 250ml, 500ml - Cromatoplacas silicagel 60/0,2mm de espessura 20 x 20cm - Micropipetas REAGENTES: - Clorofórmio P.A. - Metanol P.A. - Cloreto de sódioP.A: - Hexano P.A. - Benzeno P.A.
- Acetato de etila P.A. - Etanol P.A.
- Ácido fórmico P.A. - Acetona P.A.
- Padrões de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 - Ácido sulfúrico P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar 25g de amostra previamente moída e homogeneizada (desengordurar se necessário) em um erlenmeyer de 500ml.
2. Adicionar água destilada quente (40 a 60ml), suficiente para formar uma pasta; esfriar.
3. Adicionar 100ml de clorofórmio, tampar e agitar vigorosamente por 30 segundos. Retirar a tampa cuidadosamente.
4. Tampar e deixar em agitação branda e constante por 30 minutos.
5. Filtrar o extrato em papel de filtro 24cm (80g), recebendo em erlenmeyer ou balão de fundo chato com junta 24/40, ou compatível ao condensador.
6. Evaporar no soxhlet, em banho-maria.
7. Dissolver o resíduo em 50ml de metanol e transferir para o funil de separação de 500ml.
8. Adicionar 50ml de solução de NaCl 4% e agitar cautelosamente, eliminando a pressão pela torneira.
9. Adicionar mais 50ml de hexano, agitar vigorosamente eliminando a pressão. 10. Deixar em repouso até a separação das fases.
OBSERVAÇÃO: Se a fase hexano não estiver límpida, fazer uma nova lavagem com hexano.
11. Recolher a parte inferior em um funil de separação contendo 50ml de hexano, agitar.
12. Receber a camada inferior em outro funil de separação, contendo 50ml de clorofórmio, agitar, deixar em repouso até a separação das fases.
13. Recolher a parte inferior em um frasco evaporado e reservar.
14. Fazer mais uma extração com 50ml de clorofórmio, recolhendo o extrato no mesmo frasco evaporador.
15. Evaporar em banho-maria até quase secura. Completar a evaporação usando corrente de nitrogênio.
16. Dissolver o extrato com clorofórmio de acordo com os teores esperados (1ml a 10ml).
17. Na cromatofolha, marca linha de origem 1,5cm da margem. Marcar linha de chegada 8,5cm da linha de origem.
Dividir a linha de origem de 2 em 2cm.
Fazer as aplicações com auxílio de micro seringas na linha de origem. 18. Saturar a cuba com uma das misturas abaixo:
Benzeno + acetato dé etila + etanol(60 + 38 + 2) ou, Cloroformio + acetona (90 + 10) ou,
Tolueno + acetato de etila + acido fórmico (60 +30 + 10) ou, Tolueno + acetato de etila + ácido fórmico (60 + 40 + 0,5). 19. Aplicar 2 ou 3 pontos de padrões para 3 pontos de amostra.
20. Colocar a placa cuidadosamente na cuba já saturada e aguardar até que a fase móvel atinja a marca de 8,5cm.
21: Retirar a placa da cuba e secar ao ambiente ou com auxílio de secador.
22. Fazer a leitura da placa, em câmara escura, sob luz ultravioleta, comparando a intensidade da fluorescência da amostra com os padrões.
Se a intensidade de fluorescência da mancha de amostra for maior que a intensidade de fluorescência da mancha de maior concentração do padrão, a amostra deverá ser diluída e recromatografada.
OBSERVAÇAO: Para confirmação, adicionar uma gota de H2S04 50%, sobre a mancha que se supõe ser Aflatoxina B1 e/ou B2. Se a mancha permanecer com fluorescência azul, indica que não se trata de aflatoxina. Se a mancha mudar para amarelo; pode indicar aflatoxina; mas o teste não é conclusivo. Neste caso, proceder ao teste com ácido trifluoracético.
CÁLCULO:
5 x V x V = ug Aflatoxina/kg = ppb W x Z
ONDE:
S = ul de aflatoxina do padrão com igual intensidade de fluorescência da amostra. Y = Concentração aflatoxina do padrão em ug/ml.
V = ul do solvente requerido para diluir o extrato final. W = Peso da amostra em grama.
Z = ul de aflatoxina da amostra com igual intensidade de fluorescência do padrão. SOLUÇÕES REAGENTES:
1. Soluções de saturação:
a. Homogeneizar 60 partes de benzeno; 38 partes de acetato de etila e 2 partes de etanol.
b. Homogeneizar 90 partes de clorofórmio e 10 partes de acetona.
c. Homogeneizar 60 partes de tolueno, 30 partes de acetato de etila e 10 partes de ácido fórmico.
d. Homogeneizar 60 partes de tolueno, 40 partes de acetato de etila e 0,5 parte de ácido fórmico.
2. Solução de Cloreto de Sódio a 4%
Diluir 4 gramas de NaCl em água destilada e completar o volume para 100ml. MÉTOOO Nº 32 - AFLATOXINAS - MINI-COLUNAS
APLICAÇÃO: Produtos ou sub-produtos de origem vegetal, rações e concentrados. PRINCÍPIO: O método baseia-se na separação através de colunas e a detecção é feita pelo aparecimento de uma banda azul fluorescente na camada de florisil.
MATERIAL E EQUIPAMENTO: - Balança semi-analítica - Liquidificador
- Bastão de vidro - Banho-maria
- Suporte para minicoluna
- Cromatoplacas silicagel 60, sem indicador de fluorescência, 20 x 20cm espessura 0,2mm
- Minicoluna
- Papel filtro qualitativo, filtragem rápida, 24cm de diâmetro. - Microseringa de 5 a 10 microlitros
- Funil +/- 15cm de diâmetro