SECRETARIA NACIONAL DE DEFESA AGROPECUÁRIA DEPARTAMENTO NACIONAL DE DEFESA ANIMAL. DIVISÃO DE LABORATÓRIO ANIMAL

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SECRETARIA NACIONAL DE DEFESA AGROPECUÁRIA DEPARTAMENTO NACIONAL DE DEFESA ANIMAL.

DIVISÃO DE LABORATÓRIO ANIMAL

MÉTODOS ANALÍTICOS PARA CONTROLE DE ALIMENTOSPARA USO ANIMAL NORMAS GERAIS DE AMOSTRAGEM PARA ANÁLISES DE ROTINA

A principal meta de um laboratório deve ser a produção de dados analíticos de alta qualidade, através de medidas que sejam exatas, confiáveis e reprodutíveis. Estes resultados somente refletirão a real composição de um produto se a colheita do material for convenientemente efetuada. Para uma boa amostragem, as seguintes normas técnicas gerais devem ser observadas:

1. A quantidade de material deve ser suficiente para realização de toda a parte analítica bem como armazenamento em arquivo, destinada a revisão ou perícia. Adotar no mínimo 1 kg para esta operação. Produtos cuja homogeneidade pode comprometer o resultado analítico (rações e concentrados que contenham uréia, farelo de algodão, etc), a colheita deve ser superior a 2 kg ou, em casos especiais, conforme especificação do laboratório.

2. Fazer o quarteamento, dividindo em 4 sub-amostras e acondicionando-as de maneira a conservar "in natural! os caracteres físicos, químicos e organolépticos. Para produtos sólidos adotar sacos plásticos resistentes e para líquidos frascos de polietileno ou vidro com tampa (melaço, gordura, etc).

3. Identificar e rotular da forma mais completa possível. Exemplo: farelo de soja, local da colheita, fabricante, data de fabricação, data da validade, data da colheita, código da amostra, representatividade da amostra, órgão e responsável pela colheita. Anexar, se necessário, um breve relatório contendo informações sobre anormalidades apresentadas, tais como: condição da embalagem, transporte, contaminação do piso por outros materiais, estado de conservação, etc.

4. O responsável pelas colheitas de amostras deve ter conhecimentos tecnológicos e analiticos. Isto assegurará informações úteis relativas as matérias primas e mais ainda a industrialização de produtos acabados, levando a correção de possíveis erros.

5. Efetuar as colheitas em vários pontos do carregamento, lote, partida, etc., principalmente para produtos que não apresentam uma homogeneidade perfeita ou tenham tendência a separação.

6. Para produtos ensacados utilizar um calador de metal (F1G. 3), retirando a amostra das partes superior, média e inferior do saco (FIG. 4), misturando-as posteriormente.

Proceder a colheita segundo a tabela abaixo:

a) Até dez unidades: cinco amostras de unidades diferentes.

b) De dez até cem unidades: quinze por cento da partida, com um número mínimo de dez unidades. .

c) Acima de cem unidades: cinco por cento da partida, com um número minimo de quinze unidades.

IMPORTANTE

Nunca retirar a amostra de um único ponto, pois a mesma é casual e não permite conclusões quanto a qualidade do produto.

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7. Para acondicionamentos a granel utilizar uma sonda de profundidade com cruzeta móvel (fig. 3), nas medidas aproximadas de 1,60m de comprimento e 0,05 m de diâmetro, introduzindo-a por impulsão forçada. Adotar um mínimo de oito pontos localizados, aplicados a cargas menores e 16 pontos para quantidades maiores (carretas e vagões), sempre intercalando as posições vertical e inclinada da sonda (FIG. 5).

IMPORTANTE

O instrumento de colheita deverá necessariamente abranger as partes superior, média e inferior do material em todos os pontos escolhidos.

8. No caso de cargas ensacadas e cobertas com lona, descobri-las para possibilitar melhor retirada das amostras. Em todos os casos, proceder uma amostragem complementar no ato da descrição abrangendo os sacos centrais.

9. Para produtos no estado líquido e pastoso, amostrá-los com sonda específica, abrangendo as partos superior, média e inferior do recipiente.

10. Na chegada da amostra ao laboratório, o responsável pelo preparo deverá processá-la, adotando novamente o sistema de quarteamento (fIg. 1 ou 2).

11. Após esse procedimento, moer a amostra em moinho adequado, passando-a integrpassando-almente em peneirpassando-a com mpassando-alhpassando-a pe 1 mm (16 mesh), homogeneizpassando-ar e acondicionar em frasco de vidro ou plástico com tampa.

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PROCEDIMENTO PARA PREPARAÇÃO DA AMOSTRA DESTINA A ANALISE LABORATORIAL

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ESQUEMA

1. Utilizar uma folha de cartolina com 0,70 m de lado. 2. Colocar a amostra no centro.

3. Misturar conforme demonstrado, no minimo 5 vezes em cada extremidade. 4. Dividir em 4 partes

5. Eliminar uma diagonal por vez, intercalando esse processo a cada mistura completada.

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FIG.2 - SISTEMA DE QUARTEAMENTO UTILIZANDO O QUARTEADOR "JOHNES"

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ESQUEMA

1. Derramar a amostra no interior do quarteador, passando pelas canaletas. 2. Colher as duas porções divididas igualmente em duas bandejas

3. Eliminar uma porção e a outra restante passar novamente pelo mesmo, colhendo as divisões semelhantemente a forma descrita em 2.

4. Proceder a ssim alternadamente até a obtenção da porção de amostra desejada.

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FIG.3 - INSTRUMENTOS UTILIZADOS PARA AMOSTRAGEM

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(Granel)

Sonda de profundidade: comprimento1,60m x 0,05m de diâmetro, utilizada na amostragem de produtos a granel.

FIG 4 – Pontos de colheita da amostra para produtos ensacados

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MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS MÉTODO N.º 01- GRANULOMETRIA

APLICACÃO: Produtos ou sub-produtos de origem animal, vegetal ou mineral.

PRINCÍPIO: Baseia-se na determinação das proporções com que as partículas de diferentes dimensões entram na composição da amostra.

MATERIAL E EQUIPAMENTO: - Aparelho vibrador para peneiras - Balança técnica (Precisão +/- 0,1 g)

- Conjunto padrão de peneiràs metálicas - diâmetro de 203 mm - Bolas de borracha maciça com 2 a 3 cm de diâmetro.

PROCEDIMENTO:

1. Colocar 2 Bolas de borracha em cada peneira e montar o conjunto.

2. Pesar 100g de amostra e transferir para a peneira superior do conjunto. Tampar e fixar no vibrador.

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4. Pesar as frações retidas em cada peneira. CÁLCULO:

RETIDO = Peso retido x 100

Peso total amostra OBSERVAÇAO:

O número de peneiras e o tamanho das malhas deverão ser estabelecidos conforme o tipo de produto.

MÉTODO N.º 02 - UMIDADE (INDIRETO)

APLICAÇÃO: Produtos ou sub-ptodutos de origem vegetal, animal, mineral, rações e concentrados.

PRINCÍPIO: Fundamenta-se na perda de umidade e substâncias voláteis a temperatura de 105º C.

MATERIAL E EQUIPAMENTO:

- Balança analítica (Precisão +/- 0,0001 g) - Estufa de secagem

- Pesa filtro ou cápsula de alumínio, com tampa

- Dessecador com cloreto de cálcio ou silica-gel anidros PROCEDIMENTO:

1. Pesar a cápsula ou pesa filtro, limpo e previamente seco em estufa a 105ºC. por uma hora, resfriado em dessecador até temperatura ambiente.

2. Pesar de 3 a 5g da amostra, dependendo da capacidade do recipiente.

3. Colocar em estufa pré-aquecida a 105ºC (.+,/- 1ºC) até peso constante (4 a 6 horas).

4. Retirar da estufa e deixar em dessecador até temperatura ambiente. 5. Pesar

CÁLCULO:

Umidade % (A - B) = x 100 C

ONDE:

A = Peso do recipiente + amostra

B = Peso do recipiente + amostra após secagem C = Peso da amostra

OBSERVAÇAO:

Ao utilizar estufa sem renovação de ar recomenda-se não processar grande número de amostras simultaneamente.

MÉTODO N.º 03 - UMIDADE (DIRETO)

APLICAÇÃO: Amostras líquidas, forragens, silagens ou outras passíveis de alterações quando analisadas pelo método indireto.

PRINCÍPIO: Baseia-se na determinação da umidade por destilação da amostra, utilizando-se um líquido não miscível com água e de ponto de ebulição superior a esta.

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A água e o líquido volatilizam-se, e após condensação são depositados em um coletar graduado.

- Balança semi analítica. (precisão +/- 0,01 g).

- Manta ou chapa elétrica com controle de temperatura. - Condensador Liebig com junta esmerilhada.

- Balo de fundo redondo ou chato, capacidade 500 ml com junta esmerilhada.

- Sistema receptor graduado de "Dean and Stark" ou "Bidwell Stirling" com capacidade 10 ou 20 ml, divisão 1/10 com juntas superior e inferior esmerilhadas.

REAGENTE: - Toluol P.A. PROCEDIMENTOS:

1. Pesar 20 a 30 g da amostra "in natura" (ou conforme a quantidade de água estimada), diretamente no balão.

2. Adicionar +/- 200 ml de toluol P.A., conectar ao sistema e este ao condensador. 3. Aquecer a mistura lentamente, controlando a temperatura para manter o líquido em constante ebulição.

4. Destilar até volume constante da fase aquosa no tubo graduado. 5. Desligar e proceder a leitura do volume final à temperatura ambiente. CÁLCULO:

V x.100 Umidade % = P

ONDE:

V = Volume da fase aquosa no tubo graduado P = Peso da amostra em grama

MÉTODO N.º 04 - PROTEÍNA BRUTA (MACRO)

APLICAÇÃO: Amostras nitrogenadas de origem orgânica e inorgânica, com exceção de nitratos e nitritos.

PRINCÍPIO: Baseia-se na transformação do nitrogênio da amostra em sulfato de amônio por digestão ácida, e em nitrogênio amoniacal por destilação em meio alcalino. MATERIAL E EQUIPAMENTO:

- Balança analítica (precisão +/-0,0001 g).

- Conjunto Kjeldahl para digestão e destilação macro. - Bureta de 50 ml. div. 1/10.

- Frasco Kjeldahl 500 ou 800 Mi ou tubo de digestão macro. - Erlenmeyer de 300 ou 500 ml.

- Pérolas de vidro 4 a 6 mm. - Provetas de 100 ml.

REAGENTES:

- ÁcIdo sulfúrico P.A. (d = 1.84 g/l). - Hidróxido de sódio P.A.

- Sul fato de cobre pentahidratado P. A.

- Sulfato de sódio anidro P.A. ou sulfato de potássio anidro P.A. - Vermelho de metiIa P. A.

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- Zinco metálico granulado P.A. - Biftalato de potássio P.A. - Ácldo bórico P.A.

- Verde de bromocresol P.A. - Ácido clorídrico P.A.

- Carbonato de sódio P.A. PROCEDIMENTOS:

1. Pesar 1,0 g da amostra e transferir para frasco Kjeldhal ou tubo de digestão.

2. Adicionar aproximadamente 15 g de mistura catalítica, 5 a 7 pérolas de vidro e 20 ml de ácido sulfúrico P.A. pela parede do frasco.

3. Iniciar a digestão.com temperatura baixa. Prosseguir, elevando até o máximo de 38º C, evitando deixar pontos aderidos a parede do frasco.

Continuar por mais 30 minutos após clareamento completo da mistura.

4. Esfriar, juntar de 250 a 350 ml de água destilada- (dependendo da capacidade do frasco). Agitar até dissolução e esfriar.

5. Levar ao destilador, adicionar cinco grânulos de zinco para controlar a ebulição e cuidadosamente, 50 ml de hidróxido de sódio 50%. Arrolhar rapidamente, agitar e proceder a destilação.

6. Recolher cerca de 200 ml de destilado em erlenmeyer de 300 ou 500 ml contendo 50 ou 100 ml de água destilada mais um volume de ácido sulfúrico 0,2 N a ser determinado de acordo com o percentual de proteína bruta estimada e 2 gotas de indicador vermelho de metila 0,1%.

OBSERVAÇÃO: Alternativamente poderá ser empregado 50 ml de ácido do bórico 4% com 8 a 10 gotas do Indicador misto para receber a destilado.

7. Retirar e titular o excesso de ácido com solução de hidróxido de sódio até a viragem do vermelho para amarelo.

OBSERVAÇAO: Ao utilizar o ácido bórico 4% empregar como titulante ácido clorídrico até viragem do ind'1cador (verde para rosa).

8. Proceder uma prova em branco, testando a qualidade dos reagentes. CÁLCULOS:

Proteína = (Va - Vb) x F1 - (Vs x F2) x N x 6,25 x 0.014 x 100

Bruta % P

ONDE:

Va = Volume de H2S04 0.2 N utilizado

Vb = Volume de H2S04 0.2 N consumido pela prova em branco F1 = Fator de correção do H2S04 0.2 N

Vs = Volume de NaOH 0.2 N gasto na titulação F2 = Fator de correção do NaOH 0.2 N

N = Normalidade

6,25 = Fator de transformação do nitrogênio em proteína, considerando' 16% nitrogênio (100/16=6,25)

0,014 = Miliequivalente grama do nitrogênio P = 'Peso da amostra em g

ou no caso de utilização do ácido bórico 4%

Proteína (Va - Vb) x F x N x 6,25 x 0,014 x 100

Bruta % = P

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Va = Volume de HCl 0,1 N gasto na titulação

Vb = Volume de HCl 0,1 N gasto na prova em branco F = Fator de correção do HCl 0,1 N

N = Normalidade

6,25 = Fator de transformação do nitrogênio em proteína, considerando 16% nitrogênio (100/16=6,25).

0,014 = Miliequivalente grama do nitrogênio P = Peso da amostra em g

OBSERVAÇÕES:

1. Destilar de modo que o condensado seja obtido a temperatura ambiente.

2. O terminal do condensador deve ficar mergulhado na solução durante a fase de destilação.

3. Quando houver viragem da cor vermelha para amarela durante a fase de destilação, desconsidera a análise em processo.

4. Orientação para volumes de H2S04 0.2 N a ser utilizado, de acordo com o percentual de proteína bruta esperado.

%. PB ml H2S04 até 10 % 10 20 % 15 30 % 25 40 % 30 60 % 50 80 % 60

5. Proceder sempre, uma prova de recuperação utilizando caseína P.A., sulfato de amônio anidro P.A. ou cloreto de amônio P.A.

6. Em amostras com alto teor de gordura ou que apresentem formação de espuma durante a fase de digestão ou destilação, utilizar algumas gotas de solução antiespumante.

SOLUÇOES REAGENTES E VOLUMÉTRICAS:

a. Solução volumétrica padronizada de ácido sulfúrico

Medir 5,5 ml de H2S04 P.A. e transferir para balão volumétrico de 1000 ml contendo aproximadamente 500 ml de água destilada.

Esfriar e completar o volume. PADRONIZAÇÃO:

Pesar exatamente 0,4 g de carbonato de sódio (Na2C03) P.A. previamente seco em mufla a 270ºC por uma hora. Dissolver em erlenmeyer, adicionando aproximadamente 30 ml de H2S04 0,2 N medidos e bureta de 4 gotas de vermelho de metila. Prosseguir a titulação gotejando a solução de H2S04 0.2 N até leve coloração rósea. Aquecer até ebulição e resfriar. Havendo permanência da coloração rósea, considerar terminada a titulação. Caso contrário, prosseguir, repetindo a operação até coloração permanente. CÁLCULO DO FATOR:

P NR

NR = V x E F= NE

ONDE:

P = Peso do Na2C03 em miligrama NR ~ Normalidade real da solução V = Volume gasto na titulação em ml

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E = Equivalente grama de Na2C03 NE = Normalidade esperada

b. Solução volumétrica padronizada de hidróxido de sódio 0,2N Pesar cerca de 8,2 g de NaOH P.A. e dissolver em água destilada.

Transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1000 ml e completar o volume. PADRONIZAÇÃO:

Pesar, com exatidão, cerca de 1,5 9 de biftalato de potássio P.A., previamente seco em estufa a 120ºC por duas horas. Dissolver em erlenmeyer com aproximadamente 75 ml de água destilada. Adicionar 4 gotas de solução alcóolica de fenolftaleína e titular gotejando a solução de NaOH 0.2 N até coloração levemente rósea.

CÁLCULO DO FATOR:

P NR

NR = V x E F= NE

ONDE:

E = Equivalente grama do biftalato de potássio P = Peso do Biftalato em miligrama

V = Volume de NaOH 0.2 N consumido. NR = Normalidade real .

NE = Normalidade esperada

c. Solução indicadora de vermelho de metila 0,1%

Dissolver 0,1 9 de vermelho de metila P.A. em aproximadamente 60 ml de álcool etílico. Transferir para balão volumétrico de 100 ml e completar o volume.

d. Solução indicadora de fenolftaleína 1%

Dissolver 1,0 g de .fenolftaleína P.A. em aproximadamente 60 ml de álcool etílico P.A. Transferir para balão volumétrico de 100 ml e completar o volume.

e. Solução reagente de hidróxido de sódio 50%

Dissolver 500 9 de NaOH P.A. ou grau técnico de boa qualidade em água destilada. Adicionar 30 9 de tiossulfato de sódio, quando o período de armazenamento for longo, para evitar a carbonatação e completar para 1000 ml.

f. Mistura catalítica

Peneirar separadamente o sulfato de sódio ou potássio anidros e o sulfato de cobre pentahidratado em peneira com malha de 1 mm. Juntar 10 partes de Na2S04 ou K2S04 e uma parte de CuS04. 5H20. Homogeneizar e guardar em frasco com tampa. g. Solução volumétrica padronizada de ácido clorídrico 0,1 N

Medir 8,5 ml de HC.l P.A. e transferir para balão volumétrico de 1000ml, contendo aproximadamente 500 ml de água destilada. Esfriar e completar o volume.

PADRONIZAÇÃO:

Pesar exatamente 5,299g de carbonato de sódio (Na2CO3) P.A., previamente seco a 270ºC; por uma hora. Dissolver em água destilada, transferir para balão volumétrico de 1000 ml e completar o volume. Pipetar 20 ml da solução de Na2C03 e transferir para erlenmeyer de 250ml. Adicionar 3 gotas de solução de vermelho de metila 0,1%. Titular até viragem para coloração rósea. Aquecer a ebulição, para eliminar o gás carbônico. Esfriar e prosseguir a titulação. Repetir esta operação até coloração ;rósea permanente.

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CÁLCULO DO FATOR: P NR NR = V x E F= NE ONDE: P = Peso em mg do Na2C03 na alíquota V = Volume gasto de HCl 0,1N E = Equivalente grama do Na2C03 NR = Normalidade real NE = Normalidade esperada

h. Solução reagente de ácido bórico 4%

Pesar 40g de H3BO3 P.A. e transferir para bequer de 1.000 ml. Dissolver em

aproximadamente 500 ml de água destilada, utilizando agitação. Transferir quantitativamente, através de papel filtro qualitativo, para balão volumétrico de 1.000 ml e completar o volume.

i. Solução indicadora mista

Dissolver 0,132 g de vermelho de metila P.A. em 70ml de álcool etílico P.A. Transferir quantitativamente para balão volumétrico de 200ml.

Dissolver 0,066g de verde de bromocresol P.A. em 70ml de álcool etílico P.A. Juntar ao balão contendo vermelho de metila e completar o volume com álcool etilico P.A.

OBSERVAÇÃO: O indicador misto poderá ser incorporado à solução de ácido bórico 4% (8ml por litro).

MÉTODO N.º 05 - PROTEÍNA BRUTA (SEMI-MICRO)

APLICAÇÃO: Amostras nitrogenadas de origem orgânica e inorgânica, com exceção de nitratos e nitritos.

PRINCÍPIO: Baseia-se na transformação do nitrogênio da amostra em sulfato de amônio, por digestão ácida, e em nitrogênio amoniacal por destilação em meio alcalino.

- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g).

- Bloco digestor e destilador por arraste de vapor. - Bureta de 25 ml (1/20).

- Frasco Kjeldahl de 300 mI ou tubo de digestão (semi micro). - Erlenmeyer de 125 ml

- Proveta de 25 ml REAGENTES:

- Ácido sulfúrico P.A. (d = 1,84 g/l) - Hidróxido de sódio P.A.

- Sulfato de cobre pentahidratado P.A.

- Sulfato de sódio anidro P.A. ou sulfato de potássio anidro P.A. - Vermelho de metila P.A.

- Zinco metálico granulado. - Biftalato de potássio P.A. - Ácido bórico P.A.

- Verde bromocresol P.A. - Ácido clorídrico P.A.

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- Carborloto dé sódio P.A. PROCEDIMENTOS:

1. Pesar de 300 a 500 mg da amostra e 'transferir para frasco Kjeldahl ou tubo.

2. Adicionar aproximadamente, 2g de mistura catalítica e 5 a 10ml de ácido sulfúrico P.A. pela parede do frasco.

3. Proceder a digestão até que a solução fique límpida, cuidando para não deixar pontos pretos aderidos a parede do frasco. Continuar por mais 30 minutos após o clareamento. Esfriar e dissolver com aproximadamente 10 a 20ml de água destilada. 4. Colocar em um erlenmeyer aproximadamente 50ml de água destilada, volume de H2S04; 0,2 N de acordo com a porcentagem de proteína estImada e 2 gotas de

vermelho de metila 0,1%.

OBSERVAÇÃO: Alternativamente poderá ser empregado de 20 a 50ml de ácido bórico 4% para receber o destilado, com 8 a 10 gotas de indicador misto.

5. Transferir quantitativamente a amostra digerida para o destilador, lavando o frasco três vezes com aproximadamente 10ml de água destilada.

OBSERVAÇÃO: No caso de destiladores automáticos, conectar o tubo no Suporte e bocal apropriados.

6. Adicionar aproximadamente 20ml de NaOH 50%. Destilar por arraste mantendo o terminal do condensador mergulhado na solução receptora até que toda amônia seja liberada.

7. Retirar o erlenmeyer, lavar o terminal do condensador e titular o excesso de ácido, com solução de NaOH 0,2 até viragem do indicador (vermelho para amarelo).

OBSERVAÇAO: Ao utilizar ácido bórico 4% empregar como titulante HCl 0,1N até viragem do indicador misto (verde para rosa).

8. Proceder paralelamente prova em banco dos reagentes utilizados. CÁLCULOS:

Proteína = (Va - Vb) x F1 - (Vs x F2) x N x 6,25 x 0.014 x 100

Bruta % P

ONDE:

VA = Volume de H2S04 0,2 N utilizado

V8 = Volume de H2S04 0,2 N consumido na prova em branco

F1 = Fator de correção do H2S04 0,2 N

VS = Volume de NaOH 0,2 N Gasto na titulação F2 = Fator de correção do NaOH 0,2 N

N = Normalidade

6,25 = Fator de transformação do nitrogênio em proteína, considerando 16% de nitroganio (100/16=, 6,25)

0;014 = Miliequivalente grama do nitrogênio P = Peso da amostra em grama

- No caso de utilização do Ácido Bórico 4%

Proteína (Va - Vb) x F x N x 6,25 x 0,014 x 100

Bruta % = P

ONDE:

Va = Volume de HCl 0,1 N gasto na titulação

Vb = Volume de HCl 0,1 N gasto na prova em branco F = Fator do HCI 0,1 N

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6,25 = Fator de transformação do nitrogênio em proteína, considerando 16% de Nitrogênio (100/16 = 6,25)

0,014=, Miliequivalente grama do nitrogênio P = Peso da amostra em grama

OBSERVAÇOES:

3. Quando houver viragem da cor vermelha para amarela durante a fase de destilação, desconsiderar a análise em processo.

4. Orientação para volumes de H2S04 0,2N a ser utilizado, de acordo com o percentual

de proteína bruta esperado. % PB ml H2S04 até 10% 10 20% 15 30% 25 40% 30 60% 50 80% 60

5. Proceder sempre uma prova de recuperação utilizando caserna P.A., sulfato de amônio anidro P.A. ou cloreto de amônio P.A.

6. Em amostras com alto teor de gordura ou que apresentem formação de espuma durante a fase de digestão ou destilação, utilizar algumas gotas de solução antiespumante.

a. Solução volumétrica padronizada de ácido sulfúrico 0,2 N.

Medir 5,5 ml de H2S04 P.A. e transferir para balão volumétrico de 1.000ml contendo

aproximadamente 500 ml de água destilada. Esfriar e completar o volume.

PADRONIZAÇÃO: Pesar exatamente 0,4 g de carbonato de sódio (Na2C03) P.A.

previamente seco em mufla a 270ºC por uma hora. Dissolver em erlenmeyer, adicionando aproximadamente 30 ml de H2S04 0,2N medidos em bureta e 4 gotas de

vermelho de metila 0.1%. Prosseguir a titulação gotejando a solução de H2S04 0.2 N

até leve coloração rósea. Aquecer até ebulição e resfriar. Havendo permanência da coloração rósea, considerar terminada a titulação. Caso contrário, prosseguir, repetindo a operação até coloração permanente.

CÁLCULO DO FATOR:

P NR

NR = V x E F= NE

ONDE:

P = Peso do Na2C03 em miligrama NR = Normalidade real da solução V = Volume gasto na titulação em ml. E = Equivalente grama do Na2C03

NE = Normalidade esperada

(15)

Pesar 8,2g de NaOH P.A., dissolver em água destilada. Transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1.000ml e completar o volume.

PADRONIZAÇÃO:

Pesar, com exatidão, cerca de 1,a g de biftalato de potássio P.A., previamente seco em estufa a 120ºC por duas horas. Dissolver em erlenmeyer com aproximadamente 75ml de água destilada. Adicionar 4 gotas de solução alcoólica de fenolftaleína 1% e titular gotejando a solução de NaOH 0,2N até coloração levemente rósea.

CÁLCULO DO FATOR:

P NR

NR = V x E F= NE

ONDE:

E = Equivalente grama do biftalato de potássio P = Peso do biftalato em miligrama

V = Volume de NaOH 0, N consumido NR = Normalidade real

INE = Normalidade esperada

c. Solução indicadora de vermelho de metila 0,1%

Dissolver 0,1g de vermelho de metila P.A. em aproximadamente 60 ml de álcool etílico. Transferir para balão volumétrico de 100 ml e completar o volume.

d. Solução indicadora de fenolftaleína 1%

Dissolver 1,0g de fenolftaleína PA.. em aproximadamente 60 ml de álcool etílico P.A.. Transferir para balão volumétrico de 100ml e completar o volume.

e. Solução reagente de hidróxido de sódio 50%

Dissolver 500g de NaOH P.A. ou grau técnico de boa qualidade em água destilada. Adicionar 30 g de tiossulfato de sódio para evitar a carbonatação e completar para 1.000ml em béquer.

f. Mistura catalítica

Peneirar separadamente o sulfato de sódio ou potássio anidros e o sulfato de cobre pentahidratado em peneira com malha de 1mm. Juntar 10 partes de Na2S04 ou K2S04 e

uma parte de CuS04. 5H20. Homogeneizar e guardar em frasco com tampa.

g. Solução volumétrica padronizada de ácido clorídrico 0,1 N.

Medir 8,5ml de HCl P.A., transferir para balão volumétrico de 1.000ml, contendo aproximadamente 500 ml de água destilada. Esfriar e completar o volume.

PADRONIZAÇÃO:

Pesar exatamente 5,299g de carbonato de sódio (Na2C03) P.A. previamente seco a

270ºC por uma hora. Dissolver em água destilada, transferir para balão volumétrico de 1.000ml e completar o volume.

Pipetar 20 ml da solução de Na2C03 e transferir para erlenmeyer de 250ml. Adicionar 3

gotas de solução de vermelho de metila 0,1%. Titular até viragem para coloração rósea. Aquecer a ebulição, para eliminar o gás carbônico. Esfriar e prosseguir a titulação. Repetir esta operação até coloração rósea permanente.

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P NR NR = V x E F= NE ONDE: P = Peso em mg do Na2C03 na alíquota V = Volume gasto de HCl E = Equivalente grama do Na2C03 NR = Normalidade real NE = Normalidade esperada.

h. Solução reagente de ácido bórico 4% .

Pesar 40g de H3B03 P.A. e transferir para bequer de 1.000ml. Dissolver em aproximadamente 500ml de água destilada, utIlizando agitação.

Transferir quantitativamente, através de papel filtro qualitativo, para balão volumétrico de 1.000ml e completar o volume.

1. Solução IndIcadora mIsta

Dissolver 0,132 g de vermelho de metiIa P.A. em 70mI. de álcool etílico P.A. Transferir quantitativamente para balão volumétrico de 200ml.

Dissolver 0,066g de verde de bromocresol P.A. em 70 ml de álcool etílico P.A. Acrescentar ao balão contendo vermelho de metila e completar o volume com álcool etílico P.A.

OBSERVAÇAD: O indicador misto poderá ser incorporado a solução de ácido bórico 4% (8ml por litro)

MÉTODO N.º 06 - DIGESTIBILIDADE EM PEPSINA 0,2%

APLICAÇÃO: Produtos ou sub-produtos protéicos de origem animal. PRINCÍPIO: Fundamenta-se na digestão da amostra por ação da pepsina. MATERIAL E EQUIPAMENTO:

- Balança analítica (Precisão +1- 0,0001g) - Estufa bacteriológica

- Estufa de secagem

- Agitador tipo Wagner (Modelo AOAC para 15 RPM) ou similar - Cadinho de vidro sinterizado NQ 01 ou funil de Buchner - Papel de filtro quantitativo filtração média.

- Proveta de 250 ml.

- Frascos com tampa ou erlenmeyer capacidade 500 ml REAGENTES:

1. Ácido clorídrico P.A. (d = 1,19g/ml) 2. Pepsina c/ atividade 1:10.000 3. Acetona P.A.

PROCEDIMENTOS:

1. Pesar 1g da amostra, desengordurar e transferir quantitativamente para frasco com tampa ou erlenmeyer com rolha esmerilhada.

2. Adicionar 150ml de solução de pepsina 0.2% em HCl 0,075 N, previamente aquecida a 45ºC. Fixar no agitador e incubar por 16h a 45ºC com agitação constante. 3. Filtrar sob sucção em cadinho de vidro sinterizado ou papel filtro previamente tarados. Usando-se a segunda opção, ajustar o papel ao funil Buchner. Lavar o resíduo com 2 a 3 porções de água a 45 – 50ºC e após, com 2 porções de acetona P.A.

(17)

4. Colocar o cadinho ou papel de filtro com o resíduo em estufa a 105ºC por 1 hora. Retirar e esfriar em dessecador até temperatura ambiente. Pesar.

CÁLCULOS:

A - B

Digestibilidade % = 100 - (______) x 100 P

ONDE:

A = Peso do cadinho ou papel de filtro + resíduo B = Peso do cadinho ou papel de filtro

C = Peso da amostra em grama OBSERVAÇOES:

1. A solução de pepsina 0,2% em HCl 0,075N deverá ser preparada momentos antes de sua utilização.

2. Em substituição ao agitador tipo Wagner, poderá ser utilizado banho maria com agitação (tipo Kline) ou similar. A velocidade de agitação deverá ser ajustada de maneira que o resultado obtido seja semelhante aquele do método indicado.

SOLUÇOES REAGENTES E VOLUMÉTRICAS

a. Solução volumétrica padronizada de ácido clorídrico 0,075N

Transferir 12,8ml de HCI P.A. para balão volumétrico de 2.000ml, contendo aproximadamente 500ml de água destilada. Esfriar e completar o volume.

PADRONIZAÇÃO:

Pesar exatamente 0,12g de Na2C03 P.A. previamente seco em mufla e 270ºC por 1 hora. Dissolver em erlenemeyer,. adicionando aproximadamente 20ml de HCl 0,75N, medidos em bureta e adicionar 4 gotas de vermelho de metila 0,1%. Prosseguir a titulação, gotejando a solução de HCl 0,075N até leve coloração rósea. Aquecer até ebulição e esperar. Havendo permanência de coloração rósea, considerar terminada a titulação.

Caso contrário, prosseguir até coloração rósea constante. CÁLCULO DA NORMALIDADE: P NR = ______ V X E ONDE: P = Peso de Na2C03 em miligrama

V = Volume gasto de HCI 0,075N na titulação E = Equivalente grama do Na2C03

NR = Normalidade real

b. Solução indicadora de vermelho de metila 0,1%

Dissolver 0,1g de vermelho de metila P.A. em aproximadamente 60 ml de álcool etílico. Transferir para balão volumétrico de 100 ml e completar o volume.

c. Solução reagente de pepsina 0,2% em ácido clorídrico 0.075N

Pesar em bequer exatamente 2,0 g de pepsina - 1:10.000. Adicionar aproximadamente 100 ml de solução HCI 0,075N, dissolver, transferir

(18)

quantitativamente para balão volumétrico de 1000 ml e completar o volume com HCI 0,075N.

OBSERVAÇAO: Manter a pepsina 1:10.000 estocada em refrigerador. MÉTODO N.º 07 - PROTEíNA DIGESTÍVEL EM PEPSINA 0,2%

APLICAÇÃO: Produtos e sub produtos protéicos de origem animal.

PRINCÍPIO: Fundamenta-se na determinação indireta da fração nitrogenada da amostra digerida por ação da pepsina.

- Balança analítica (Precisão +/- 0,0001g) - Estufa bacteriológica

- Estufa de secagem

- Agitador tipo Wagner (Modelo AOAC para 15 RPM) ou similar - Funil de Buchner

- Papel de filtro quantitativo, filtração média - Proveta de 250ml

- Frascos ou erlenmeyer capacidade 500 ml com tampa

- Material e equipamento usados para determinação de proteína bruta (macro ou semi-micro)

REAGENTES:

- Ácido clorídrico P.A. (d = 1,19g/ml) - Pepsina com atividade 1:10.000 - Acetona P.A.

- Reagentes utilizados na determinação de proteína bruta (macro ou semi-micro) PROCEDIMENTO:

1. Pesar 19 da amostra, desengordurar e transferir quantitativamente para frasco ou erlenmeyer com tampa.

2. Adicionar 150ml de solução de pepsina 0,2% em HCI 0,075 N, previamente aqueclda a 45ºC. Flxar no agitador e incubar por 16 horas a 45ºC com agitação constante.

3. Filtrar com sucção sobre papel de filtro ajustado a um funil de Buchner lavar o resíduo com 2 a 3 porções de água a 45 – 50ºC e após, com 2 porções de acetona. 4. Transferir o papel com o resíduo para balão Kjeldahl ou tubo de digestão. Proceder conforme descrito nos métodos para determinação de Proteína Bruta (macro ou semi-micro).

CALCULO:

Prot. Bruta - Prot. do resíduo

Proteína digestível % = x 100

Prot. Bruta OBSERVAÇOES:

1. A solução de pepsina 0,2 em HCI 0,075 N deverá ser preparada momentos antes de sua utilização.

2. Em substituição ao agitador tipo Wagner. poderá ser utilizado banho-maria com agitação (tipo Kline) ou similar. A velocidade de agitação deverá ser ajustada de maneira que o resultado obtido seja semelhante aquele do método indicado.

(19)

SOLUÇOES REAGENTES:

a. Solução voIumétrica padronizada de HCI 0.075N.

Medir 12,8 ml de HCI P.A. e transferir para balão volumétrico de 2.000 ml contendo aproximadamente 500 ml de água destilada. Esfriar e completar o volume.

PADRONIZAÇÃO:

Pesar 0,12 gramas de Na2C03 P.A. previamente seco em mufla a 270ºC por 1 hora. Dissolver em erlenmeyer, adicionando aproximadamente 20ml de HCI 0,075N, medidos em bureta, e adicionar 4 gotas de vermelho de metila 0,1%. Prosseguir a titulação, gotejando a solução de HCl 0,075N até leve coloração rósea. Aquecer até ebulição e esperar. Havendo permanência de coloração rósea, considerar terminada a titulação. Caso contrário, prosseguir até coloração rósea constante.

CALCULO DA NORMALIDADE: P NR = ______ V X E ONDE: P = Peso de Na2C03 em mg

V = Volume gasto de HCl 0,075N na titulação E = Equivalente grama do Na2C03

b. Solução reagente de pepsina 0,2% em ácido clorídrico 0,075N Pesar em bequer exatamente 2,0 q de pepsina - 1:10.000.

Adicionar aproximadamente 100ml de solução HCl 0,075N, dissolver, transferir quantitatIvamente para balão volumétrico de 1000ml e completar o volume com HCl 0,075 N.

OBSERVAÇÃO: Manter a pepsina 1:10.000 estocada em refrigerador. c. Soluções reagentes usadas na determinação de proteína bruta (macro ou semi-mIcro).

MÉTODO N.º 08 - PROTEÍNA SOLÚVEL EM KOH APLICAÇÃO: Grãos de oleogInosas e seus derivados.

PRINCÍPIO: Baseia-se na extração e determinação da fração nitrogenada da amostra, solúvel em solução de KOH de concentração conhecida.

- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g)

- Agitador magnético ou tIpo Kline, com controle de rotação. - Centrífuga

- Erlenmeyer de 250ml ou 300ml

- Material e equipamento usados para determinação da proteína bruta (macro ou semi-micro).

REAGENTES:

(20)

- Soluções reagentes usadas na determinação de proteína bruta (macro ou semi-micro).

PROCEOIMENTO:

1. Pesar 2,0g da amostra. Transferir para erlenmeyer de 250 ou 300ml e adicionar volumétricamente 100 ml de solução de KOH 0,2% (0,036N).

2. Agitar brandamente por 20 minutos, usando agitador magnético ou tipo Kline. 3. Centrifugar o sobrenadante por 5 a 10 minutos a 1.500 rpm.

4. Pipetar volumétricamente 25ml do centrifugado e transferir para frasco Kjeldahl ou 10ml para tubo de digestão.

5. Proceder conforme descrito nos métodos para determinação de proteína bruta (macro ou semi-micro).

6. Proceder paralelamente prova em branco .dos reagentes utilizados. CÁLCULO:

Proteína do sobrenadante x 100 Proteína solúvel % =

Proteína Bruta i

Utilizar peso da amostra para cálculo, de acordo com alíquota empregada. OBSERVAÇOES:

1. A agitação da mistura deve ser branda mas suficiente para provocar revolução completa do material.

2. Devido a alta sensibilidade do método, trabalhar com solução de KOH exatamente 0,036N.

1. Solução volumétrica padronizada de hidróxido de potássio 0,2% (0,036N).

Pesar 2,376 g de KOH P.A., solubilizar em água destilada. Transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1000ml, completar o volume e homogeneizar.

PADRONIZAÇAO

Pesar com exatidão 0,2g de Biftalato de Potássio P.A., previamente seco em estufa a 120ºC por 2 horas. Dissolver em erlenmeyer com aproximadamente 7.5ml de água destilada. Adicionar 4 gotas de solução alcóolica de fenolftaleína a 1% e titular gotejando a solução de KOH 0,036N até coloração levemente rósea.

CALCULO DA NORMALIDADE:

P N = Y x E ONDE:

E = Equivalente grama do biftalato de potássio P = Peso do biftalato de potássio em miligrama Y = volume KOH 0,036N consumido.

b. Soluções reagentes usadas na determinação de proteína bruta (macro ou semi-micro).

(21)

MÉTODO Nº 09 - URÉIA

APLICAÇÃO: Uréia ou produtos que a contenham.

PRINCÍPIO: Consiste na determinação do nitrogênio da uréia, liberado pela ação enzimática da urease

- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g) - Conjunto Kjeldahl para destilação macro - Frasco Kjeldahl capac. 500 ou 800ml - Erlenmeyer 300 ou 500ml

- Bureta capacidade 50ml div. 1/10 - Provetas 10 e 100ml

- Pérolas ,de vidro 4 a 6mm diâmetro REAGENTES:

- Uréia P.A. - Urease P.A.

- Cloreto de cálcio P.A. . - Óxido de magnésio P.A. - Solução antiespumante

- Reagentes utilizados na determinação de proteína bruta - fase de destilação {macro ou semi-micro).

PROCEDIMENTO:

1. Pesar de 0,2 a 2g da amostra, conforme o teor esperado e transferir para frasco Kjeldahl de 500 ou 800 ml.

2. Adicionar aproximadamente 300ml de água destilada e 10ml de solução neutra de urease 1%. tampar hermeticamente e deixar a temperatura ambiente por 1 hora ou 20 minutos a 40ºC.

3. Adicionar 2g de óxido de magnésio, 5ml de solução de cloreto de cálcio 25%, 3ml de solução antiespumante e 7-8 pérolas de vidro.

4. Levar ao destilador, arrolhando rapidamente o frasco. Agitar e proceder a destilação.

5. Recolher cerca de 150-200ml do destilado em erlenmeyer de 300 ou 500ml, contendo 20 e 50ml de solução de ácido bórico 4% ou volume de ácido sulfúrico 0,2N a ser determinado, de acordo com o percentual de uréia esperado (Neste caso, utilizar indicador vermelho de metila 0,1%).

6. Retirar e titular utilizando ácido clorídrico 0,1N ou hidróxido de sódio 0,2N, procedendo a titulação conforme descrito na metodologia ,para determinação de proteína bruta.

7. Proceder paralelamente prova em branco dos reagentes utilizados. CÁLCULOS:

(VA - VB) x F1 - (Vs x F2) x N x 2,143 x.0,014 x 100

Uréia % = P

ONDE:

VA = Volume H2S04 0,2N utilizado

VB = Volume H2S04 0,2N consumido pela prove branco

F1= Fator de correção do H2S04 0,2N

Vs = Volume de NaOH 0,2N gasto na titulação F2 = Fator de correção do NaOH 0,2N

(22)

2,143 = Fator de transformação do nitrogênio em uréia 0,014 = Miliequivalente grama do nitrogênio

P = Peso da amostra em grama ou no caso de utilização de Ácido Bórico 4% (VA - VB) x F x N x 2,143 x 0,014 X 100

Uréia % = P

ONDE:

VA = Volume HCl 0,1N gasto na titulação

VB = Volume HCl 0,1N consumido na prova branco. F1 = Fator de correção do HCl 0,1N

N = Normalidade

2,143 = Fator de transformação do nitrogênio em uréia 0,014 = Miliequivalente grama do nitrogênio

P = Peso da amostra em grama OBSERVAÇÕES:

1. Volume de H2S04 0,2N a ser utilizado, de acordo com o percentual de uréia

esperado.

% Volume

1 5

2 10

5 25

2. Proceder prova de recuperação utilizando uréia P.A. (100 a 200 mg).

4. Quando houver viragem da coloração vermelha para amarela durante a fase de destilação, desconsiderar a análise em processo (no caso de usar H2S04 0,2 N)

6. Em substituição a solução neutra de urease 1%, pode-se utilizar (Jackbean Meal) em excesso (500 a 600mg). Conservar em geladeira.

SOLUÇÕES REAGENTES E YOLUMÉTRICAS: a. Solução reagente neutra de urease 1%

- Determinação da alcalinidade - dissolver exatamente 0,1g de urease P.A. em 50ml de água destilada e titular com HCI 0,1N, utilizando vermelho de metila 0,1% como indicador, até viragem para rosa. Anotar a quantidade de HCI 0,1N necessário para neutralizar 0,1g de urease.

- Preparação da solução neutra de urease 1%; pesar exatamente, 1g de urease P.A. em béquer de 100ml e dissolver com aproximadamente 50ml de água destilada. Neutralizar esta solução utilizando a relaçao gramas de urease P.P.:.ml de HCI 0,1N obtida na terminação da alcalinidade. Transferir para balão volumétrico de 100ml e completar o volume com água destilada.

- Determinação da atividade enzimática - adicionar quantidades crescentes de solução neutra de urease 1% a várias amostras de 0,1g de uréia P.A. e prosseguir a partir do item 2. "procedimento". De acordo com os resultados obtidos, determina-se a quantidade mínima de solução necessária para hidrolizar 0,1g de uréia.

b. Solução reagente de cloreto de cálcio 25%

Pesar exatamente 25g de CaCl2.P.A. em béquer e dissolver com água destilada.

(23)

c. Soluções reagentes utilizadas a partir da fase de destilação na determinação de Proteína Bruta (macro ou semi-micro).

MÉTODO Nº 10:- EXTRATO EtÉREO

APLICAÇÃO: Produtos ou sub-produtos de origem animal e vegetal, rações e concentrados.

PRINCÍPIO: Baseia-se na extração da fração gordurosa e demais substâncias solúveis através de arraste por solvente.

- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g). - Estufa de secagem.

- Dessecador com cIoreto de cálcio ou silica gel anidros. - Balão de fundo chato ou copo Goldfisch

- Apatelho extrator tipó Soxhlet ou Goldfisch

- Papel de filtro qualitativo ou cartucho extrator de cerâmica ou celulose - Algodão hidrófilo desengordurado.

REAGENTES:

- Éter de petróleo P.A. PROCEDIMENTO:

1. Pesar de 2 a 5g da amostra, transferir para cartucho extrator ou cartucho preparado com papel filtro.

2. Secar a 105ºC + / - 1ºC durante 2 horas.

3. Secar o balão ou copo em estufa a 105ºC por uma hora, esfriar em dessecador até a temperatura ambiente e pesar.

4. Introduzir o cartucho no extrator.

5. Adicionar quantidade suficiente de solvente ao balão ou copo, conectando-o ao extrator, Ajustar o conjunto ao condensador.

6. Extrair por um período de, no mínimo, 6 horas a velocidade de condensação de 2 a 4 gotas por segundo.

7. Recuperar o solvente e completar a secagem do balão ou copo em estufa a 105ºC por 30 minutos.

8. Esfriar em dessecador até temperatura ambiente e pesar.

9. Repetir a operação de secagem até que a diferença entre duas pesagens sucessivas não seja superior a 0,1% do peso da amostra.

CÁLCULO:

(A – B)

Extrato Etéreo % = C x 100

ONDE:

A = peso do balão ou copo + resíduo B = peso do balão ou copo

C = peso da amostra em grama OBSERVAÇÃO:

Conduzir sempre uma prova em branco, testando a qualidade do solvente utilizado.

MÉTODO Nº 11 - FIBRA BRUTA

(24)

PRINCÍPIO: Baseia-se na determinação do resíduo orgânico insolúvel da amostra, após uma digestão ácida e outra alcalina.

- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g) - Estufa de secagem.

- Forno mufla.

- Conjunto para determinação de fibra bruta. - Sistema de vácuo.

- Dessecador com cloreto de cálcio ou silica gel anidros.

- Copo Berzelius de 600mI ou erlenmeyer de 500ml com junta esmerilhada. - Frasco kitassato

- Funil de Buchner +/- 10cm de diâmetro.

- Cadinho de Gooch capacidade de 40/50mI ou cadinho de vidro sinterizado porosidade 1 (90 a 150 micras).

- Fibras de óxido de alumínio ou amianto purificado.

- Tela de nailon ou poliester ou aço inox (200 mesh) ou papel de filtro qualitativo. REAGENTES:

- Ácido sulfúrico P.A. (d = 1,84 g/ml) - Hidróxido de sódio P.A.

- Álcool etílico ou acetona P.A. - Solução anti-espumante PROCEDIMENTO:

1. Pesar de 1 a 3g da amostra, conforme o teor de fibra bruta estimado. Desengordurar.e secar em estufa a 105ºC por uma hora.

2. Transferir o resíduo para bequer, erlenmeyer ou cadinho de vidro sinterizado (sistema automático). Adicionar 200ml de H2S04 1,25% (0,225N) em ebulição (sistema

automático - injetar 150ml), e algumas gotas de solução anti-espumante. Digerir com refluxo por exatamente 30 minutos.

3. Filtrar quantitativamente a quente, sob vácuo em funil de Buchner provido de tela de nailon, aço inox ou cadinho de vidro sinterizado (sistema automático). Proceder lavagens sucessivas do resíduo com água fervente até completa neutralização.

4. Retornar o resíduo ao bequer ou erlenmeyer, lavando a tela com 200ml de NaOH 1,25% (0,313N) em ebulição (sistema automático -, injetar 150ml de NaOH 1,25% - 0,313N). Adicionar algumas gotas de solução anti-espumante. Digerir com refluxo por exatamente 30 minutos.

5. Filtrar quantitativamente a quente sob vácuo em funil Buchner provido de tela de nailon ou poliester, aço inox ou diretamente em cadinho de vidro sinterizado.

6.. Transferir quantitativamente o resíduo com auxílio de água quente para cadinho de vidro sinterizado ou cadinho de Gooch contendo camada densa de fibras de óxido de alumínio ou amianto purificado. Lavar com aproximadamente 20ml de álcool etílico P.A. ou acetona P.A. e 20ml de acetona P.A. ou éter etílico ou petróleo P..A.o

7. Colocar em estufa a 105 C até peso constante (4 a 6 horas). Retirar, deixar em dessecador até temperatura ambiente e pesar.

8. Incinerar em mufla a 550ºC por 2 horas ou a 600°C por 1 hora. Retirar a temperatura de 250ºC / 300ºC. Resfriar em dessecador até temperatura ambiente e pesar.

(25)

(A – B)

Extrato Etéreo % = C x 100

ONDE:

A = Peso do cadinho + resíduo B = Peso do cadinho + cinzas C = Peso da amostra

OBSERVAÇÕES:

1. Em substituição a tela de nailon ou aço inox, poderá ser utilizado um tecido de linho com textura equivalente.

2. Poderão ser eregados como anti-espumantes: a. álcool n-amílico

b. solução de silicone (1g de silicone + 50ml de éter etílico + 50ml de éter de petróleo) estocar em refrigerador.

3. A camada de fibras de óxido de alumínio ou amianto no cadinho de Gooch deverá ter, após boa compactação, espessura suficiente para não permitir a passagem de partículas de resíduo.

4. Ao Utilizar cadinho de vidro sinterizado, adotar temperatura máxima de 500ºC e tempo mínimo de 3 horas.

5. O amianto deverá ser previamente calcinado, tratado com solução ácida e alcalina, conforme o ensaio e lavado cuidadosamente de maneira a eliminar todo o resíduo. Calcinar novamente.

SOLUÇÕES REAGENTES E VOLUMÉTR1CAS:

a. Solução reagente de ácido sulfúrico 1,25º (0;255N)

Medir 7.0 ml de H2S04 P.A. (d=1.84g/ml) e transferir para balão volumétrico de

1000ml, contenDo aproximadamente 500ml de água destilada. Esfriar e completar o volume. Padronizar esta solução com NaOH 0,2N e considerar adequada se estiver entre 0,252N e 0,258N.

b. Solução reagente de hidróxido de sódio 1,25% (0,313N)

Pesar exatamente 12,5g de NaOH P.A. em bequer, solubilizar e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1000ml, esfriar e completar o volume. Padronizar esta solução com H2S04 0,2N e considerar adequada se a normalidade

estiver entre 0,310N e 0,316N.

MÉTODO Nº 12 - CINZAS OU MATÉRIA MINERAL

APLICAÇÃO: Produtos ou sub-produtos de origem animal, vegetal, mineral, rações e concentrados.

PRINCÍPIO: Fundamenta-se na eliminação da matéria orgânica e inorgânica volátil a temperatura de 550ºC a 600ºC. O resíduo obtido é denominado cinzas.

- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g) - Forno mufla

- Dessecador com cloreto de cálcio ou silica gel anidros - Cadinho ou cápsula de porcelana

PROCEDIMENTO:

1. Pesar o cadinho ou cápsula de porcelana, limpo e previamente calcinado em mufla a 550ºC/600ºC por 30 minutos, e resfriado em dessecador até temperatura ambiente. 2. Pesar de 2 a 3g da amostra no cadinho ou cápsula.

(26)

3. Levar à mufla e gradualmente aumenta temperatura (550/600ºC) até obtenção de cinzas claras (3 horas no mínimo).

4. Retirar a 250/300ºC, resfriar em dessecador até temperatura ambiente e pesar. CÁLCULO:

A - B

Cinzas ou Matéria Mineral % = (___________) x 100 C

ONDE:

A = Peso do cadinho ou cápsula + resíduo B = Peso dó cadinho ou cápsula

C = Peso da amostra em grama OBSERVAÇOES:

1. Nem sempre o resíduo obtido representa toda a substância inorgânica presente na amostra, pois alguns sais podem sofrer redução ou volatilização nessa faixa de temperatura.

2. Não se obtendo cinzas claras após decorrido o período mínimo de calcinação, recomenda-se a adição de 2 a 3 gotas de HN03 concentrado ou água oxigenada 30 volumes, e retorno a mufla entre 550/600ºC por mais uma hora. Essa adição facilitará a oxidação do carbono.

3. Opcionalmente ao item 3 (procedimento), poderá ser efetuada uma pré-queima em placa aquecedora e/ou bico de Buzen, transferindo em seguida para mufla (55Q/600ºC).

MÉTODO Nº 13 - RESÍDUO INSOLÚVEL EM HCL

APLICAÇÃO: Produtos ou sub-produtos de origem animal, vegetal e mineral.

PRINCÍPIO: Baseia-se na determinação da fração mineral insolúvel em ácido clorídrico. MATERIAL E EQUIPAMENTO:

- Balança analítica (precisão +/:. 0,0001g) - Forno mufla

- Dessecador com cloreto de cálcio ou silica gel anidros - Cadinho ou cápsula de porcelana

- Papel filtro quantitativo, filtração média - Bequer de 250ml

REAGENTES:

- Ácido clorídrico P.A. PROCEDIMENTO:

1. Pesar o cadinho ou cápsula de porcelana, limpo e previamente calcinado em mufla a 550/600ºC por 30 minutos, e resfriado em dessecador até temperatura ambiente. 2. Pesar de 2 a 3g da amostra no cadinho ou cápsula.

3. levar à mufla e gradualmente aumentar a temperatura até (550/600ºC) até obtenção de cinzas claras (3 horas no mínimo).

4. Retirar a 250/300ºC, resfriar até a temperatura ambiente.

5. Transferir quantitativamente as cinzas contidas no cadinho para bequer de 250ml, lavando com três porções de aproximadamente 20ml de solução de ácido clorídrico 1:1. Ferver por 5 minutos.

(27)

6. Filtrar quantitativamente sobre papel de filtro, lavando o resíduo com H20 destilada

quente até eliminação de todo o ácido.

7. Transferir o papel de filtro com resíduo para cápsula ou cadinho de porcelana, previamente tarado. levar à mufla e gradualmente aumentar a temperatura. Manter por duas horas. (no mínimo) à temperatura de 550/600ºC.

8. Retirar a 250/300ºC. Resfriar em dessecador até temperatura ambiente e pesar. CÁLCULO:

A - B Resíduo insolúvel % = (__________) x 100

C ONDE:

A = Peso da cápsula ou cadinho + resíduo B = Peso de cápsula ou cadinho

C = Peso original da amostra em grama OBSERVAÇÃO:

Opcionalmente aos itens 3 e 7, poderá ser efetuada uma pré-queima em placa aquecedora, transferindo em seguida para a mufla (500/600ºC).

SOLUCÕES REAGENTES E VOLUMÉTRICAS: a. Solução reagente de ácido clorídrico 1:1

Diluir uma parte de HCI em uma parte de água destilada. MÉTODO Nº 14 - CÁLCIO (OXIDIMÉTRICO)

PRINCÍPIO: Consiste em precipitar o cálcio de uma solução obtida das cinzas da amostra, por adição de oxalato de amônio. O precipitado formado (oxalato de cálcio) é dissolvido em meio ácido formando ácido oxálico, que é determinado por oxidimetria (permanganatometria).

- Placa aquecedora. ou banho maria - Bequer de 250 ou 300ºC

- Funil analítico - Cadinho de Gooch

- Fibras de Óxido de Alumínio ou Amianto - Vidro de relógio

- Pipetas volumétricas

- Pipetas graduadas (ou repipetador automático) - Proveta de 50ml

- Balões volumétricos - Papel de filtro qualitativo - Bastão de vidro

- Bureta ambar de 50ml (1/20) REAGENTES:

- Ácido clorídrico P.A. . - Ácido sulfúrico P.A.

(28)

- Oxalato de amônio P.A. '" - Hidróxido de amônio P.A.. . - Permanganato de potássio P.A. - Vermelho de metila P.A.

PROCEDIMENTO:

1. Com o auxílio de bastão de vidro, transferir quantitativamente para béquer as cinzas obtidas na determinação de matéria mineral. Lavar o cadinho com pequenas porções de solução de HCl 1/1 totalizando 40 ml, e em seguida com água destilada. Cobrir com vidro de relógio e levar a placa aquecedora até que haja redução de 1/3 do volume. Esfriar.

2. Filtrar sobre papel de filtro qualitativo para balão volumétrico adequado. Completar o volume com água destilada e homogeneizar (solução estoque). Reservar esta solução também para a determinação de fósforo.

3. Pipetar volumétricamente uma alíquota adequada para bequer de 250 ou 300ml. Adicionar 2 a 3 gotas de vermelho de metila 0,1% e diluir com água destilada até aproximadamente 50 ml.

4. Aquecer brandamente em placa aquecedora ou banho maria, (70/80ºC) e acrescentar sob agitação constante 25ml de oxalato de amônio 4,2% quente. Adicionar NH40 1/1, gota a gota sob agitação constante, até que a coloração mude do vermelho para rosa. Se houver mudança da coloração para amarelo, gotejar HCI 1:3 até retorno para rosa. Deixar em repouso no mínimo 1 hora e máximo de 3 horas.

5. Filtrar sob vácuo em cadinho de Gooch com camada de fibra de óxido de alumínio ou amianto. Lavar o bequer e o precipitado 3 vezes com NH40H 1/50 ou até que algumas gotas do filtrado não reajam com solução de nitrato de prata acidulada com ácido nítrico.

6. Transferir o cadinho de Gooch com o precipitado para o bequer original. Adicionar água destilada até cobrir o cadinho e 5ml de H2S04 P.A.

7. Aquecer até completa dissolução do precipitado (próximo a ebulição), e titular com KMn04 0,05 N sob constante agitação- até coloração rósea clara persistente por 30 segundos. Cuidar para que durante a titulação a temperatura não fique abaixo de 60ºC.

CÁLCULO:

V x N x F x 0,02004 x S x 100

Cálcio % = P x A

ONDE:

V = Volume de KMn04 0,05 N gasto na titulação. N = Normalidade.

F = Fator de correção da solução de KMn04 0,05 N. S = Volume da solução estoque.

P = Peso da amostra em grama. A = Volume da alíquota utilizado

0,02034 = miliequivalente grama do cálcio. OBSERVAÇOES:

1. Não é necessário calcinar amostras isentas de matéria orgânica.

2. O Manganês é reduzido pelo oxalato em meio ácido, de + 7.para + 2, tornando a solução de permanganato incolor. A primeira gota que não for reduzida, dará a mesma, uma tonalidade rosa.

3. Orientação para volumes estoques e alíquotas de acordo com o percentual de cálcio esperado.

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cálcio esperado % volume estoque alíquota 0 - 1 % 200ml 100 ml 1 - 4 % 200ml 50ml 4 - 10 % 250ml 20ml 10 - 20 % 250ml 10ml 20 - 40 % 500ml 10ml

SOLUÇÕES REAGENTES E VOLUMÉTRICAS: a. Solução reagente de ácido clorídrico 1:3 ,

Diluir uma parte de HCl P.A. em três partes de água destilada. b. SoluçAo reagente de ácido clorídrico 1:1

Diluir uma parte de HCl em uma parte ::1e á~ya destilada. c. SoluçAo de vermelho de metiIa 0,1%

Dissolver 0,1g de vermelho de metila P.A. em aproximadamente 60ml de álcool etilico. Transferir para balão volumétrico de 100 ml e completar o volume.

d. Solução reagente de hidróxido de amônio 1:1

Diluir uma parte de NH40HP.A. em uma parte de água destilada. e. Solução reagente de oxalató de amônio 4,2%

Pesar 42g de oxalato de amônia P.A. em bequer, solubilizar e transferir para balão volumétrico de 1000 ml. Adicionar aproximadamente 700ml de água destilada, agitar manualmente ou mecanicamente até completa dissolução e completar o volume. f. Solução reagente de hidróxido de amônio 1:50

Diluir uma parte de NH40H P.A. em 50 partes de água destilada.

g. Solução volumétrica padronizada de permanganato de potássio 0,05 N

Dissolver 1,6g de KMn04 P..A. em bequer contendo aproximadamente 300/400ml de água destilada e aquecer a 60/70ºC por duas horas. Esfriar, transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1000ml e completar o volume. Deixar em repouso por 72 horas ao abrigo da luz.

Filtrar sobre cadinho de vidro sinterizado, amianto ou lã de vidro e estocar em frasco ambar.

PADRONIZACÃO:

Pesar exatamente 3,35g de oxalato de sódio Na2C204 P.A. previamente seco em estufa a 105ºC por duas horas. Dissolver em bequer com aproximadamente 100ml de água destilada, transferir para balão volumétrico de 1000ml e completar o volume. Pipetar 20ml da solução de Na2C204 para erlenmeyer de 250ml, adicionar 10ml de H2S04 1:1. Aquecer a 70/80ºC e titular nessa temperatura gotejando a solução de KMn04 0,05N numa velocidade de 2 a 3 gotas/segundo, até coloração levemente rósea persistente por 30 segundos.

CALCULO DO FATOR

P NR

N = V x E NE

ONDE:

(30)

P = Peso do oxalato de sódio em miligrama na alíquota V = Volume de KMn04 gasto na titulação

NR = Normalidade real NE = Normalidade esperada

MÉTODO Nº 15 - CALCIO (COMPLEXOMÉTRICO)

PRINCÍPIO: Fundamenta-se na titulação çomplexométrica de sais de cálcio por uma solução de sal sódico do EDTA em presença de indicador.

MATERIAL E EQUIPAMENTo - Balão vólumétrico de 100 ou 250ml - Pipeta volumétrica de 10 ml e 25ml - Erlenmeyer de 250 e 500ml - Placa aquecedora - Papel de filtro - Pipeta graduada - Buretas de 25ml - Pérolas de vidro REAGENTES:

- Ácido ClorIdrico P.A. - Molibdato de amônia P.Á. - Hidróxido de sódio P. A. - Trietanolamina P.A. - Cianeto de potássio P.A. - Calcelna P.A.

- Timolftaleína P.A. - Nitrato de potássio P.A. - EDTA P.A.

PROCEOIMENTO:

1. Com o auxílio de bastão de vidro, transferir quantitativamente as cinzas obtidas na determinação de matéria mineral para bequer, lavar o cadinho, com pequenas porções de solução de HCI 1:1, totalizando 40ml e em seguida, com água destilada, cobrir com vidro de relógio e levar à placa aquecedora ate que haja redução de 1/3 do volume. Esfriar.

2. Filtrar sobre papel de filtro qualitativo para balão volumétrico adequado. Completar o volume com água destilada (solução estoque).

3. Pipetar volumetricamente uma alíquota adequada da solução estoque e transferir para bequer de 250 m,i.

4, Adicionar 25ml de solução de molibdato de amônio 5%, 2,5ml de ácido clorídrico e levar à placa aquecedora a 70ºC durante uma hora.

5. Deixar esfriar.

6. Filtrar em papel de filtro, recolhendo o filtrado em erlenmeyer de 500ml. Fazer lavagens sucessivas com água destilada até extração completa.

7: Adicionar 20mI de hidróxido de sódio 4N, água destilada, 5ml de cianeto de potássio 0,1N e 5ml de trietanolamina 20% (realizar esta operação em capela de exaustão).

(31)

8. Elevar o volume a 300ml com água destilada e adicionar pequena quantidade de calceina mista, sob agitação.

9. Titular com EDTA 0,02M. O ponto final da titulação a coloração passa de uma fluorescência verde amarelada para uma não fluorescência violácea.

CÁLCULO;

V x M x F x 40,08 x 100

Cálcio % = P x 1000

ONDE:

V = Volume gasto de EDTA

M = Molaridade da solução de EDTA F = Fator de correção dá solução de EDTA 40,08= Peso molecular do cálcio

SOLUÇÕES REAGENTES VOLUMÉTRICAS: a. Calceina mista

Misturar 0,2g de calceína., 0,12g de timolftaleina e 20g de nitrato de potássio. Manter em frasco ambar.

b.Solução reagente de molibdato de amônia 5%.

Dissolver 50g de molibdato de amônio em água destilada, completando a seguir para 1000ml em balão volumétrico.

c. Solução reagente de hidróxido de sódio 4N

Pesar 160g de NaOH P.A., dissolver e completar o volume com água destilada para 1.000ml.

d. Solução reagente de cianeto de potás$io 0,1N

Dissolver 6,512g de KCN P.A. e completar o volume com água destilada para 1000ml. e. Solução reagente de trietanolamina 20%

Medir 200ml de trietanolamina P.A. e completar o volume com água destilada para 1000ml.

f. Solução reagente de ácido clorídrico 10%

Medir 100ml de ácido clorídrico e transferir para balão volumétrico de 1.000ml, contendo aproximadamente 500ml de água destilada. Esfriar e completar o volume. g. Solução volumétrica padrozinada de EDTA 0,02 M

Pesar 7,4449g de EDTA dissódico, dissolver, transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1000ml e completar o volume.

PADRONIZAÇÃO:

Pesar, em erlenmeyer de 250ml 0,5055g de carbonato de cálcio P.A. previamente seco em estufa a 105ºC por três horas. Adicionar quantidade de HCI 10% suficiente para dissolver o sal e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 250ml com água destilada, completando o volume. Depois de bem homogeneizado, pipetar alíquota de 25ml e proceder de maneira idêntica a determinação de cálcio.

25 ml FC = V

(32)

ONDE:

V = volume gasto de EDTA

MÉTODO Nº 16 - FÓSFORO (COLORIMÉTRICO I)

APLICAÇÃO: Produtos ou sub-produtos de origem animal,' vegetal, mineral, rações e concentrados.

PRINCÍPIO: Fundamenta-se na reação de Misson. A partir de uma reação em meio ácido do ortofosfato presente com solüção de vanadato mais molibdato de amônio, forma-se um complexo de coloração amarela, que é medido colorimetricamente. MATERIAL E EQUIPAMENTO: - Colorímetro fotoelétrlco - Pipetas volumétricas - Balões volumétricos de 100ml - Pipeta graduada REAGENTES:

- Metavanadato de amônio P.A. - Ácido nítrico P.A.

- Molibdato de amônio P.A.

- Fosfato de potássio monobásico P.A. - Ácido sulfúrico P.A.

PROCEDIMENTO:

1. Pipetar volumetricamente para balão de 100ml, alIquota da solução estoque de maneira que a leitura esteja em uma faixa de 15% a 50% transmitância ou 0,824 a 0,222 de absorbância.

2. Adicionar 4ml de H2S04 10N e 20ml do reagente misto. Completar o volume com água destilada, homogeneizar e aguardar no mínimo por 10 minutos antes de fazer a leitura.

3. Paralelamente, preparar um branco contendo os mesmos volumes de H2S04 10N, reagente misto e água destilada.

4. Determinar a absorbâncla ou transmitância em fotocolorImetro a 420nm, zerando anteriormente com o branco.

5. Comparar a absorbância ou transmitância com a curva padrão previamente elaborada, ou usar equação de regressão.

CÁLCULO: L x S x D x 100 Fósforo % = P X A ONDE: L = Leitura do gráfico em mg D = Fator de diluição

S = Volume da solução estoque P = Peso da,amostra em ,miligrama A = Volume da alíquota utilizado OBSERVAÇOES:

A coloração amarela do complexo formado possui estabilidade limitada, devendo ser determinada de acordo com a qualidade dos reagentes empregados na solução mista.

(33)

SOLUÇOES REAGENTES E VOLUMÉTRICAS: a. Solução padrão de fósforo

Pesar exatemente O,4394g de KH2P04 (mono) P.A. previamente seco em estufa a 105ºC por duas horas. Solubilizar e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1000ml. Adicionar aproximadamente 500ml de água destilada e 10ml de H2S04 10N. Completar o volume. Cada ml desta solução contém 100 microgramas de fósforo. Fazer diluições de maneira a obter concentrações adequadas a confecção da curva.

b. Solução reagente de ácido sulfúrico 10N ,

Transferir cuidadosamente 266ml de H2S04 P.A. para balão volumétrico de 1000ml, contendo aproximadamente 700ml de água destilada. Esfriar e completar o volume. c. Solução reagente de metavanadato de amônio O,25%

Pesar 2,5g de metavanadato de amônio P..A. e solubilizar em 500ml de água destilada fervente. Esfriar e adicionar lentamente com agitação, 350ml de HN03 P.A. Transferir para balão volumétrico de 1000ml, esfriar e completar o volume. Estocar em frasco ambar.

d Solução reagente de molibdato de amônio 5%

Pesar 50g de molibdato de amônio e solubilizar em 500ml de água destilada quente (60/70ºC). Esfriar e transferir para balão volumétrico de 1000ml, completar o volume. Estocar em frasco ambar.

e. Reagente misto

Juntar 1 parte da solução de metavanadato com 1 parte da solução de molibdato de amônio e homogeneizar. Preparar momentos antes da utilização.

MÉTODO Nº 17 - FÓSFORO (COLORIMÉTRICO II)

PRINCÍPIO: A ação do molibdenio sobre o ion fósforo, resulta em ácido fosfomólibdico, que a seguir é reduzido pelo ácido 1,2,4-aminonaftolsulfônico a óxido de molibdenio, produzindo uma coloração azul que é medida colorimetricamente.

MATERIAL E EQUIPAMENTO: - Colorímetro fotoelétrico - Pipetas volumétricas - Pipetas graduadas,

- Balões voiumétricos capacidade 200, 100 e 50ml REAGENTES:

- Molibdato de amônio P.A. - Ácido sulfúrico P.A.

- Fosfato de potássio monobásico P.A. - Bissulfito de sódio P.A.

- Sulfito de s6dio P.A.

- Ácido - 1 amino- 2 naftol-4 sulfônico ou sulfato de p-aminofenol P.A. PROCEDIMENTO:

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1. Pipetar volumetricamente para balão de 50ml, alíquota da "solução estoque" de maneira que a leitura a ser obtida esteja em uma faixa de 15 a 60% de transmitância ou 0,824 a 0,222 de absorbância.

2. Adicionar cerca de 25ml de água destilada e 5ml de molibdato de amônio. Misturar girando o balão.

3. Adicionar 2ml de ácido 1-2-4 aminonaftolsulfônico ou sulfato de p-aminofenol e marcar o tempo. Completar o volume, tampar e agitar.

4. Paralelamente preparar um branco contendo os mesmos volume de molibdato de amônio, ácido 1,2,4 aminonaftolsulfônico ou sulfato de p.aminofenol e água destilada. 5. Após 20 minutos exatamente, fazer a leitura a 720 nm, zerando anteriormente com o branco.

6. Comparar a absorbância ,ou transmitância com a curva padrão previamente preparada, ou usar a equação de regressão:

CALCULO:

L x :S x D x 100 Fósforo % =

P x A ONDE:

L= Leitura do gráfico em miligrama D= Fator de diluição

S= Volume da solução estoque P= Peso da amostra em miligrama A= Volume da alíquota utilizado

SOLUCÕES REAGENTES E VOLUMÉTRICAS: a. Solução padrão de fósforo

Pesar exatemente 0,4394 9 de KH2P04 (nono) P.A. previamente seco em estufa a 105ºC por duas horas. Solubilizar e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1000ml. Adicionar aproximadamente 500ml de água destilada e 10ml de H2S04 10 N. Completar o volume. Cada ml desta solução contém 100 microgramas de fósforo. Fazer diluições de maneira a obter concentrações adequadas a confecção da curva.

b. Solução reagente de ácido sulfúrico 10N

Transferir cuidadosamente 266ml de H2S04 P.A. para balão volumétrico de 1000ml, contendo aproximadamente 700ml de água destilada. Esfriar e completar o volume. c. Solução reagente de molibdato de amônio 2,5%

Pesar 12,5g de molibdato de amônio P.A. e solubilizar em 100ml de água destilada. Colocar 150ml de H2S04 10N em balão volumétrico de 500ml. Adicionar a solução de molibdato de amônio sobre a de ácido sulfúrico. Completar o volume com água destilada e agitar vigorosamente. Estocar em frasco ambar sob refrigeração.

d. Solução reagente de bissulfito de sódio 15%

Pesar 15g de bissulfito de sódio P.A., solubilizar em água destilada, transferir para balão volumétrico de 100ml, e completar o volume.

e. Solução reagente sulfito de sódio 20%

Pesar 10 g de sulfito de sódio P.A., solubilizar em água destilada, transferir para balão volumétrico de 50ml e completar o volume.