5. RESULTADOS
5.5 Análise Funcional da ECR1
5.5.2 Preparo dos vetores de expressão contendo a ECR1
Após as análises de Bioinformática foram feitos experimentos para obtenção da construção de expressão a ser testada durante o processo de adipogênese em cultura de células 3T3-L1. Para tanto, foi feita a extração de DNA genômico a partir de uma amostra coletada do fígado de camundongo da linhagem C57Bl/6 e, após a obtenção deste material procedeu-se à amplificação da ECR1 por PCR. Para testar as melhores condições de amplificação foi empregado um gradiente de temperatura de anelamento do conjunto de primers (Figura 16).
O produto foi então purificado e foi submetido à reação de fill-in, onde é adicionada uma timina nas extremidades 5´ dos fragmentos de DNA para que haja uma restauração destes, já que, em consequência à ação da enzima Taq polimerase, os produtos de DNA gerados apresentam uma adenina excedente nas extremidades 3’. Após este processo, os fragmentos de DNA foram novamente purificados. O vetor de expressão pTKeGFP utilizado para inserção do fragmento de interesse possui um promotor TK upstream ao gene repórter eGFP. O promotor mínimo TK dirige apenas níveis baixos de expressão do gene-repórter, sendo, portanto, um promotor apropriado para análises de elementos cis-reguladores. O vetor pTKeGFP foi digerido e linearizado com a enzima SmaI (Figura 17).
L Ctrl- 50 ⁰C 55 ⁰C 60 ⁰C 65 ⁰C
Figura 16 – Eletroforese em gel da reação de PCR para amplificação da ECR1. Gradiente de temperaturas de anelamento dos primers. L = Ladder 1 kb (marcador de peso molecular). A seta em vermelho indica a melhor condição. Gel de agarose 1%.
O fragmento correspondente à ECR1 que flanqueia o gene Dact1 foi clonado no vetor previamente aberto com a enzima SmaI. Para cada 100 ng do vetor pTKeGFP aberto, foi acrescentado o produto de PCR purificado em quantidade equivalente a três vezes a quantidade equimolar. A transformação foi feita em bactérias competentes DH5α para se obter um alto número de cópias desta construção de expressão e 12 diferentes colônias foram isoladas para extração de DNA plasmidial (Figura 18).
VF VL L
L V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12
11 10
Figura 18 - Extração de DNA plasmidial após transformação em células competentes. As amostras de 1 a 12 mostram as 12 colônias que tiveram o DNA plasmidial extraído. Todas apresentaram o padrão dos fragmentos esperado quando comparado com o vetor sem o inserto (V). A amostra 6 foi a que mostrou menor degradação após as reações. L = Ladder 1kb (marcador de peso molecular); V = vetor sem inserto de interesse. Gel de agarose 1%.
Figura 17 – Eletroforese em gel da reação de digestão dos fragmentos de DNA amplificados com a enzima SmaI. Nota-se que o vetor se linearizou, passando a apresentar um padrão de uma única banda, como esperado. L= Ladder 1 kb (marcador de peso molecular); VF = vetor fechado; VL = vetor linearizado. Gel de agarose 1%.
Em seguida, para verificar se a reação de ligação do vetor aberto com o fragmento de DNA de interesse ocorreu de maneira bem-sucedida, foi realizado o screening desses clones pela reação de digestão com a enzima PstI. Isto porque, fazendo o uso da ferramenta de Bioinformática NEBcutter (New England BioLabs) pôde-se verificar que a sequência de DNA clonada possui sítios de clivagem para diversas enzimas de restrição, sendo uma delas, a PstI. Sabendo que o vetor pTKeGFP também possui sítio para enzima PstI, se a ligação da ECR1 no vetor tiver sido realizada, deve-se esperar que a construção possua, então, dois sítios da enzima de restrição em questão e que, portanto, ao sofrer a ação da enzima PstI deve ser gerado um fragmento adicional. Assim, o esperado é verificar na corrida eletroforética um padrão de múltiplas bandas, uma vez que parte desse fragmento é clivado (Figura 19).
Após estes procedimentos, a construção de expressão que apresentou o melhor padrão foi então sequenciada (Apêndice G) para que se pudesse garantir a identidade da sequência inserida da ECR1 e então dar sequência aos experimentos de eletroporação em cultura de células 3T3-L1.
O vetor de expressão contendo a ECR1 dirigindo a expressão da Luciferase foi preparado por subclonagem do inserto da construção obtida do vetor pTKeGFP. Para tanto, a ECR1, previamente inserida neste vetor, foi excisada utilizando as enzimas de restrição SacI e XhoI, sítios de enzima de restrição provenientes e exclusivas do próprio vetor pTKeGFP que flanqueiam a região correspondente à ECR1 no vetor, upstream e downstream, respectivamente. Desta forma, foi possível garantir que a ECR1 fosse excisada na sua totalidade, garantindo a integridade da sequência.
L 1 L
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Figura 19 – Gel de agarose com as reações de digestão com a enzima PstI após extração de DNA plasmidial. As amostras de 2 a 13 mostram as 12 colônias que tiveram o DNA plasmidial extraído e então testadas com a enzima PstI. Todas apresentaram o fragmento excisado conforme o esperado. A amostra 7 foi a que mostrou menor degradação após as reações. L = Ladder 1kb (marcador de peso molecular); 1 = vetor sem ação de PstI. Gel de agarose 1%.
Primeiramente, a construção pTKeGFP contendo a ECR1 e o vetor pGL2-TK-Luc foram digeridos com a enzima SacI, como mostrado na Figura 20.
Após esta primeira reação, os produtos foram purificados e submetidos a uma segunda reação de digestão, desta vez, com a enzima de restrição XhoI (Figura 21).
L 1a 1b 2a 2b
Figura 20 – Gel de agarose com as reações de digestão com a enzima SacI. 1a: Vetor pGL2- TK-Luc não digerido com a enzima SacI. 1b: Vetor pGL2-TK-Luc totalmente linearizado após a reação de digestão com a enzima SacI. 2a: Construção de expressão pTKeGFP com a ECR1 não digerido. 2b: Construção de expressão pTKeGFP com a ECR1 parcialmente linearizada após ser digerida com a enzima SacI. L= Ladder 1 kb (marcador de peso molecular). Gel de agarose 0,8%.
Figura 21 - Gel de agarose com as reações de digestão com a enzima XhoI. 1a: Vetor pGL2- TK-Luc não digerido. 1b: Vetor pGL2-TK-Luc, previamente digerido com SacI, após a reação de digestão com a enzima XhoI. 2a: Construção de expressão pTKeGFP com a ECR1 não digerido. 2b: Construção de expressão pTKeGFP com a ECR1, previamente digerida com SacI após ser digerida com a enzima XhoI; a seta vermelha destaca a excisão do fragmento de aproximadamente 700pb, correspondente a ECR1 e regiões flanqueadoras que foram anteriormente inseridas neste vetor. Este fragmento aparece fracamente devido à baixa quantidade de amostra utilizada para verificação. L= Ladder 1 kb (marcador de peso molecular). Gel de agarose 0,8%.
Todo o volume das reações obtidas das digestões com XhoI foi aplicado em gel de agarose 0,8% para que o vetor pGL2-TK-Luc digerido com as enzimas de restrição SacI e XhoI e a ECR1 excisada da construção do pTKeGFP fossem purificados do gel após a separação dos fragmentos pela corrida eletroforética (Figura 22). Estes produtos foram então submetidos à reação de ligação.
A reação de ligação do vetor pGL2-TK-Luc com o fragmento correspondente à ECR1 foi realizada utilizando a porção de 1:5, sendo que para cada 100 ng do vetor pGL2-TK- Luc, foi acrescentada a ECR1 purificada em quantidade equivalente a cinco vezes a quantidade equimolar. A transformação foi feita em bactérias competentes DH5α e 30 diferentes colônias obtidas foram isoladas para reação de verificação da transformação da ligação por PCR. Utilizando-se primers específicos que flanqueiam a região do polylinker do vetor pGL2-TK- Luc, foi possível verificar se houve a inserção do fragmento de interesse no vetor, uma vez que se observa um amplicon correspondente ao tamanho do fragmento que os primers amplificam no vetor, somado ao tamanho do fragmento inserido (Figura 23).
L pGL2-TK-Luc ECR1
Figura 22 – Eletroforese em gel dos produtos das digestões com as enzimas SacI e XhoI. Após as reações de digestão com as enzimas de restrição, o vetor pGL2-TK-Luc e o fragmento correspondente à ECR1, que foi excisado da construção com pTKeGFP, foram recortados do gel de agarose para purificação. A seta em vermelho destaca o fragmento que corresponde à ECR1 excisada do vetor pTKeGFP. L = Ladder 1kb (marcador de peso molecular). Gel de agarose 0,8%.
As colônias positivas para inserção da ECR1 foram então cultivadas em meio líquido para extração do DNA plasmidial. As construções obtidas após o processo de clonagem foram sequenciadas e a construção que apresentou maior fidelidade à sequência de interesse foi utilizada para os ensaios de eletroporação nas células 3T3-L1. O sequenciamento da construção de expressão utilizada nestes ensaios encontra-se no Apêndice G.