UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
FERNANDA CRISTINA DA VEIGA
Busca por possíveis elementos cis-reguladores do gene
Dact1 em pré-adipócitos de camundongo (Mus musculus)
CAMPINAS
Busca por possíveis elementos cis-reguladores do gene
Dact1 em pré-adipócitos de camundongo (Mus musculus)
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Biologia Celular e Estrutural, na área de Biologia Tecidual.
Orientadora: PROFA. DRA. LÚCIA ELVIRA ALVARES
ESTE ARQUIVO DIGITAL
CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA
DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA
Fernanda Cristina da Veiga
, EORIENTADA PELA PROFA. DRA.
LÚCIA ELVIRA ALVARES.
CAMPINAS
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Veiga, Fernanda Cristina da,
V533b VeiBusca por possíveis elementos cis-reguladores do gene Dact1 em
pré-adipócitos de camundongo (Mus musculus) / Fernanda Cristina da Veiga. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
VeiOrientador: Lúcia Elvira Alvares.
VeiDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Biologia.
Vei1. Genes Dapper. 2. Regulação da expressão gênica. 3. Adipócitos. 4.
Fatores de transcrição. I. Alvares, Lúcia Elvira,1968-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Searching for potential cis-regulatory elements of Dact1 gene in mouse (Mus musculus) preadipocyte
Palavras-chave em inglês: Dapper genes
Gene expression regulation Adipocytes
Transcription factors
Área de concentração: Biologia Tecidual
Titulação: Mestra em Biologia Celular e Estrutural Banca examinadora:
Lúcia Elvira Alvares [Orientador] Marcelo Alves da Silva Mori
Carolina Prado de França Carvalho Data de defesa: 28-03-2016
Programa de Pós-Graduação: Biologia Celular e Estrutural
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Lúcia Elvira Alvares (Orientadora) Prof. Dr. Marcelo Alves da Silva Mori
Profa. Dra. Carolina Prado de França Carvalho
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica da aluna.
À Beth, Clarice e Marcus; à minha família extensiva e aos meus amigos queridos que caminharam pacientemente comigo, sobretudo com muito carinho, por este importante percurso de amadurecimento profissional e pessoal.
carinho durante todo este período e mais, durante toda minha vida. Uma companheira para todas as horas. À minha avó por todas as orações e afeto que me dedicou desde sempre. Ao Marcus, meu grande companheiro, por estar ao meu lado sempre atento a me ouvir, me consolar e, ainda, me proporcionar tanto amor. À Shirley e Elza pela presença constante na minha vida.
Agradeço também meus queridos amigos de laboratório, que acima de tudo, se tornaram amigos para vida: Bianca, Paula, Diego, Luís, Lucimara, Mika, Valquíria, Bruno e Ricardo. Obrigada por fazerem nossos dias mais alegres e mais leves. E obrigada pelos cafés. Em especial, agradeço à Viviane Rosa por toda ajuda na cultura celular e à Marina e Carol pela ajuda com os ensaios de clonagem. Aos demais colegas do Bloco H do Departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual - Aline, Maria Gabriela, Marcela, Cíntia, Ricardo, Dani, Leandro – agradeço imensamente pela companhia, carinho e respeito dispendidos durante todos esses anos.
À Natália, técnica de laboratório, por todo esforço e dedicação empregados para manter nosso ambiente de trabalho sempre funcionando e, ainda, por me tratar com tamanha ternura.
À Profa. Dra. Lúcia Elvira Alvares, minha orientadora, por ter me aberto não só as portas do Laboratório de Biologia do Desenvolvimento, como também as portas para o caminho profissional que escolhi trilhar. Sempre com muita delicadeza, respeito e afeto me proporcionou muitos aprendizados durante todos esses anos como sua aluna.
Ao Prof. Dr. Henrique Marques-Souza por compartilhar os laboratórios de Biologia Molecular e de Cultura Celular, permitindo que todos os experimentos pudessem ser realizados. Ao Prof. Dr. José Xavier-Neto por ceder seu laboratório no LNBio para que pudessem ser realizados os ensaios de subclonagem e leitura dos dados da transfecção de células com o vetor pGL2-TK-Luc.
Às Professoras Dra. Vera Solferini e Dra. Helena Barbosa, por cederem espaço e equipamentos para realização dos ensaios com cultura de bactérias e eletroporação de células, respectivamente.
À Profa. Dra. Dora Maria Grassi Kassisse por ajudar com ensaios-piloto de extração de pré-adipócitos de murinos.
À Universidade Estadual de Campinas e ao Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural, pela formação profissional proporcionada.
Ao Fundo de Apoio ao Ensino Pesquisa e Extensão (FAEPEX) e CNPq (Bolsa de Mestrado, processo número 131251/2014-7) pelo auxílio financeiro concedido para realização desta pesquisa.
importantes funções na embriogênese e na manutenção da homeostase pós-natal. Em particular, estas proteínas são importantes moduladoras das vias de sinalização Wnt e TGF-β, sendo requeridas para regular os níveis de sinalização parácrina em diferentes contextos celulares, maximizando a eficiência de vários processos biológicos. Estudos recentes associaram ao gene Dact1 a capacidade de modular a diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos maduros, demonstrando a grande plasticidade deste gene. Isto posto, uma nova perspectiva se abre em relação ao mecanismo molecular que pode estar agindo sobre a transcrição desse gene no tecido adiposo branco. Neste trabalho foi identificada uma ECR (do inglês, Evolutionary Conserved Region) que potencialmente exerce um papel regulatório na expressão de Dact1, podendo coordenar temporal e espacialmente sua ação. A partir desta abordagem, esta pesquisa aprofundou o conhecimento sobre a ação dessa ECR no contexto da adipogênese, tendo como técnicas análises de Bioinformática, clonagem de fragmentos de DNA genômico, construção de vetores de expressão, análise de expressão gênica por RT-PCR e análise funcional em cultura de células pré-adipogênicas 3T3-L1. Os resultados mostraram que, de fato, o gene Dact1 está sendo transcrito nos pré-adipócitos em estado proliferativo e também durante a indução da diferenciação em células 3T3-L1, assegurando que o aprofundamento no entendimento da regulação deste gene no contexto da adipogênese se faz pertinente e necessário. Neste trabalho também foi analisada a conservação desta ECR entre os vertebrados, identificando os principais polimorfismos presentes nos sítios de ligação para fatores de transcrição presentes nesta região e que são conservados entre diferentes ordens de mamíferos e aves. Ademais, as análises de Bioinformática apontaram que o gene Dact1 pode ser modulado por esta ECR durante a adipogênese, pois apresenta, nesta região, sítios de ligação altamente conservados entre aves e mamíferos para os fatores de transcrição PPARγ e SMADs, personagens centrais do processo adipogênico. Além disso, as análises dos dados de ChIP-Seq do banco de dados da UCSC mostraram que este provável elemento cis-regulador deve agir em outros contextos celulares nos camundongos, como cardiomiócitos e hepatócitos. Ensaios de eletroporação de células 3T3-L1 com construções de expressão contendo a ECR regulando a atividade dos genes-repórter eGFP e Luciferase foram realizados para testar a funcionalidade deste elemento genômico em pré-adipócitos. Os resultados obtidos mostraram que há uma alteração na expressão dos genes-repórter, indicando que esta ECR deve estar sendo induzida neste contexto
embryogenesis and in the maintenance of postnatal homeostasis. In particular, these proteins are important modulators of Wnt and TGF-β signaling pathways, since they are required to regulate the levels of paracrine signaling in different cellular contexts, maximizing the efficiency of many biological processes. Recent studies have assigned to Dact1 gene the ability to modulate the differentiation of preadipocytes into mature adipocytes, demonstrating the great plasticity of this gene. This finding opens a new perspective in relation to the molecular mechanism that may be acting on the transcription of this gene in white adipose tissue. In this work we identified an ECR (Evolutionary Conserved Region) that potentially plays a regulatory role in Dact1 expression, and can coordinate its action both temporally and spatially. From this approach, this research deepened the understanding of the possible roles of this ECR in the context of adipogenesis, using Bioinformatics tools, cloning genomic DNA fragments, constructing expression vectors, analyzing gene expression by RT-PCR, and performing functional assays in cultured 3T3-L1 cells. The results showed that, in fact, Dact1 is being transcribed in preadipocytes in proliferative state and during the induction of differentiation in 3T3-L1 preadipogenic cells, ensuring that the deepening in understanding the regulation of this gene in the context of adipogenesis is made relevant and necessary. In this study we also analyzed the ECR conservation among vertebrates, identifying polymorphisms in major transcription factors binding sites present in this region that are conserved among different orders of mammals and birds. Furthermore, the Bioinformatics analysis showed that Dact1 could be modulated by this ECR during adipogenesis, as it has in this region binding sites highly conserved between birds and mammals for the transcription factors PPARγ and SMADs, central characters in the adipogenic process. Additionally, studies based on ChIP-Seq data from the UCSC database showed that this putative cis-regulatory element should act on other cellular contexts in mice, as in heart and liver cells. Electroporation assays in 3T3-L1 cells using expression constructs containing the ECR regulating the activity of the reporter gene eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) and Luciferase were conducted to test the functionality of this genomic element in preadipocytes. The results showed that there is a change in the reporter gene expression, indicating that this ECR is being induced in this cellular context. Additional studies will be important to elucidate the mechanism by which this genomic region is activated.
adipócitos marrons e células musculares, além de osteoblastos...23
Figura 2 – Mecanismo de ação de Pref-1...25
Figura 3 – Esquema da ativação da via TGF-β canônica...27
Figura 4 – A via TGF-β/Smad3 ativa o processo adipogênico...28
Figura 5 – Interface apresentada pelo navegador genômico Ensembl...36
Figura 6 - Vetor pTKeGFP utilizado para clonagem...40
Figura 7 - Vetor pGL2-TK-Luc utilizado para subclonagem...42
Figura 8 - Vetor pmaxGFP utilizado como controle positivo para eletroporação...44
Figura 9 – Organização do lócus gênico de Dact1...48
Figura 10 – Diagrama de conservação mostrando as regiões evolutivamente conservadas (ECRs) localizadas entre os genes Dact1 e Daam1...50
Figura 11 – Diagrama mostrando a presença de vários TFBSs na ECR1...52
Figura 12 – Representação das posições relativas dos grupos de TFBSs na ECR1...54
Figura 13 – Interação da ECR1 com H3K4me1 em células de coração e fígado mostrada em experimentos de ChIP-Seq, sugerindo tratar-se de um enhancer...58
Figura 14 – Interação da ECR1 com CTCF em células de coração e fígado mostrada em experimentos de ChIP-Seq, indicando que este elemento genômico localiza-se próximo à uma região isoladora...59
Figura 15 – Expressão do gene Dact1 e dos potenciais reguladores da ECR1 em pré-adipócitos 3T3-L1...71
Figura 16 – Eletroforese em gel da reação de PCR para amplificação da ECR1...72
Figura 17 – Eletroforese em gel da reação de digestão dos fragmentos amplificados de DNA com a enzima SmaI...73
Figura 18 - Extração de DNA plasmidial após transformação em células competentes...73
Figura 19 – Gel de agarose com as reações de digestão com a enzima PstI após extração de DNA plasmidial...74
Figura 20 – Gel de agarose com as reações de digestão com a enzima SacI...75
Figura 21 - Gel de agarose com as reações de digestão com a enzima XhoI...75
Figura 22 – Eletroforese em gel dos produtos das digestões com as enzimas SacI e XhoI...76
Figura 23 - Triagem dos clones positivos por PCR de colônias individuais e eletroforese em gel...77
Figura 25 - Imagens de microscopia de fluorescência após a eletroporação das células 3T3-L1 quatro dias após o início da indução da diferenciação...81
Tabela 2 - Sequências dos primers utilizados para confirmação da expressão de genes da família
Dact, PPARγ e Smad3...46
Tabela 3 – Localização genômica dos genes Kiaa0586, Dact1 e Daam1...49
Tabela 4 – Lista dos TFBSs localizados na ECR1 divididos por grupos...53
Tabela 5 – Análise dos polimorfismos encontrados nos TFBSs da ECR1...66
Tabela 6 – Valores obtidos com a leitura da atividade da Luciferase por luminômetro no primeiro ensaio de eletroporação com o vetor pGL2-TK-Luc e a construção de expressão desse vetor com a ECR1...83
Tabela 7 - Valores obtidos com a leitura da atividade da Luciferase por luminômetro no segundo ensaio de eletroporação com o vetor pGL2-TK-Luc e a construção de expressão desse vetor com a ECR1...83
Tabela 8 – Sequências de nucleotídeos da ECR1 obtida pelo software Mulan...111
Tabela 9 – Lista dos fatores de transcrição para os quais foram encontrados sítios de ligação na ECR1 e suas principais funções...113
Tabela 10 – Sequências correspondentes aos sítios de ligação para seus respectivos fatores de transcrição...117
Tabela 11 – Lista das espécies que possuem regiões conservadas ortólogas à ECR1...118
AP4 –Activating Enhancer Binding Protein 4 BLAST – Basic Local Alignment Search Tool BLAT – BLAST-Like Alignment Tool
C/EBP – CCAAT/Enhancer-Binding Protein CDXA – Caudal Type Homeobox 1
ChIP – Chromatin Immunoprecipitation
ChIP-Seq – Chromatin Immunoprecipitation Sequencing CHOP-10 – C/EBP Homologous Protein
CMV – Cytomegalovirus
COMP1 – Cooperates with Myogenic Proteins 1 CTCF – CCCTC-Binding Factor
Dact1 – Gene Dact1
DACT1 - Proteína do Dact1 DKK1 – Dickkopf Homologue-1 Dlk1 – Delta-Like Protein-1
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO – Dimetilsufóxido
Dvl – Dishevelled
ECR – Evolutionary Conserved Region
ECR Browser – Evolutionary Conserved Region Browser eGFP – enhanced Green Fluorescent Protein
ENCODE – ENCyclopedia Of DNA Elements FBS – Fetal Bovine Serum
FOXD3 – Forkhead Box D3 FOXO – Forkhead Box O FREAC2 – Forkhead Box F2 HFH – Forkhead Box
HNF – Hepatocyte Nuclear Factor 4 IBMX – 3-isobutil-1-metilxantina Id2 – Inhibitor of DNA Binding 2 LBP1 – Upstream Binding Protein 1
MULAN – MUltiples Sequence Local AligNment and Conservation Visualization Tool Myf – Myogenic Factor
MyoD – Myogenic Differentiation MyoG - Myogenin
Myogenin – Miogenina
NHGRI – National Human Genome Research Institute Osx – Osterix
PCR – Polymerase Chain Reaction Pol II - RNA Polymerase II
PPAR – Peroxisome Proliferator-Activated Receptor PRDM16 – PR Domain Containing 16
Pref-1 – Preadipocyte Factor-1
qRT-PCR – Real Time Quantitative PCR RunX2 – Runt-Related Transcription Factor 2 sFRP – secreted Frizzled-Related Protein SIRT – Sirtuin 1
SMAD – SMA/MAD Related
SNP – Single Nucleotide Polymorphism SOX9 – SRY-Box 9
SRY – Sex Determining Region Y TACE – TNF-α Converting Enzyme TBP – TATA-Binding Protein TF – Transcription Factor
TFBS – Transcription Factor Binding Site TGF-β – Transforming Growth Factor β TK – Thymidine Kinase
TRANSFAC – TRANScription FACtor data base UCP-1 – Uncoupling Protein-1
UCSC – University of California, Santa Cruz UTR - Untranslated Region
Wnt – Wingless-Type MMTV Integration Site XVENT-1 – VENT Homeobox 1
1. INTRODUÇÃO ...18
2. REVISÃO DE LITERATURA ...21
2.1 Origem e desenvolvimento do tecido adiposo ...21
2.2 O pré-adipócito e seu principal marcador...24
2.3 As proteínas SMADs e a via de sinalização TGF-β ...26
2.4 Dact1 e sua ação pró-adipogênica por meio da via de sinalização Wnt ...28
2.5 Elementos cis-reguladores atuam como moduladores da ação gênica ...30
3. OBJETIVOS ...33
3.1 Objetivo geral ...33
3.2 Objetivos específicos ...33
4. METODOLOGIA ...34
4.1 Análises de Bioinformática ...34
4.1.1 Localização de ECRs no entorno do gene Dact1 ...34
4.1.2 Caracterização dos sítios de ligação para fatores de transcrição conservados evolutivamente ...34
4.1.3 Identificação de ECRs com potencial adipogênico ...35
4.1.4 Estudo da interação ECR-proteínas por ChIP usando o banco de dados Ensembl ...35
4.1.5 Análise da conservação evolutiva da ECR1 ...36
4.2 Clonagem da ECR1 do lócus do gene Dact1 com potencial adipogênico ...37
4.2.1 Desenho de primers para amplificação da ECR1...37
4.2.2 Extração de DNA genômico ...37
4.2.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificação da ECR1 ...37
4.2.4 Preparação dos produtos de PCR para clonagem – reação de fill-in ...38
4.2.5 Preparação do vetor para clonagem ...39
4.2.6 Reação de Ligação ...40
4.2.7 Transformação em bactérias competentes ...40
4.2.8 Extração de DNA plasmidial e triagem dos clones ...41
4.2.9 Subclonagem do fragmento correspondente a ECR1 para construção do vetor de expressão contendo o gene da Luciferase ...41
4.3 Eletroporação da ECR1 em pré-adipócitos da linhagem 3T3-L1 ...42
4.3.1 Cultura e expansão de células 3T3-L1 ...42
4.3.2 Indução da diferenciação das células 3T3-L1 ...43
4.3.3 Eletroporação da construção de expressão em cultura de células 3T3-L1 ...43
4.4 Análises de expressão gênica...45
4.4.1 Extração de RNA total de células 3T3-L1 ...45
4.4.2 Síntese de DNA complementar (cDNA) ...45
4.4.3 Desenho de primers para verificação da expressão de fatores adipogênicos de interesse ...46
4.4.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ...46
UCSC...56
5.4 Análise da conservação da ECR1 entre os vertebrados ...59
5.4.1 A ECR1 não está presente em vertebrados não-amniotos ...60
5.4.2 Investigação dos polimorfismos e padrões observados nas sequências dos TFBSs em diferentes espécies de vertebrados ...60
5.5 Análise Funcional da ECR1 ...71
5.5.1 Os genes Dact1, Dact3, PPARγ e Smad3 são expressos em células 3T3-L1 durante a indução da diferenciação ...71
5.5.2 Preparo dos vetores de expressão contendo a ECR1 ...72
5.5.3 Análises em cultura de células 3T3-L1 revelaram que há atividade da ECR1 neste tipo celular ...77
5.5.3.1 Eletroporação de pré-adipócitos com a construção pTKeGFP contendo a ECR1...78
5.5.3.2 Eletroporação de pré-adipócitos com a construção pGL2-TK-Luc contendo a ECR1 ...82
6. DISCUSSÃO ...84
6.1. O papel do gene Dact1 no contexto da adipogênese corrobora a hipótese da modulação deste gene no metabolismo ...84
6.2. A arquitetura da ECR1 sugere ser um elemento regulador ...86
6.3. O potencial funcional da ECR1 é corroborado pelos dados de ChIP-Seq da UCSC ...91
6.4. Polimorfismos estão presentes nas ECR1 de diferentes grupos de animais ...92
6.5. Possível papel da ECR1 no controle de Dact1 em pré-adipócitos ...94
6.6. Perspectivas futuras ...95
7. CONCLUSÕES ...96
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...97
9. APÊNDICES ... 111
1. INTRODUÇÃO
A obesidade é definida pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma patologia decorrente do acúmulo excessivo de gordura no corpo, que pode trazer riscos à saúde em indivíduos nesta condição (WHO, 2013a). O Índice de Massa Corporal (IMC) é uma medida simplificada comumente utilizada para classificar sobrepeso e obesidade em adultos (WHO, 2013a). O IMC é definido pelo peso em quilogramas dividido pelo quadrado da altura em metros do indivíduo; de acordo com a OMS, quando este índice se iguala ou supera 25 o indivíduo é considerado com sobrepeso; quando este índice chega a 30 ou mais é denominado obesidade (WHO, 2013a).De acordo com a Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura (FAO), atualmente 500 milhões de pessoas no mundo estão obesas e 1,4 bilhão estão acima do peso (WHO, 2013a). Muitos investimentos têm sido feitos no estudo sobre os processos envolvidos no desenvolvimento da obesidade, uma doença altamente relacionada ao atual estilo de vida adotado em grandes centros urbanos, particularmente consequência do sedentarismo e má alimentação. Apesar disto, ainda há muitas questões a serem respondidas sobre mecanismos moleculares e genes envolvidos no desenvolvimento das células de gordura e sobre como eles podem atuar neste processo.
Os genes da família Dact, inicialmente identificados como proteínas interagentes de Dishevelled (Dvl), controlam a embriogênese em Xenopus atuando como antagonistas de Dvl para modular as vias Wnt canônica e não-canônica (CHEYETTE et al., 2002). Dact1, um dos membros da família Dact, é um importante regulador de Dvl, sendo responsável pela modulação negativa da via de sinalização Wnt devido a sua capacidade de promover a degradação lisossomal de Dvl (WEN et al., 2010). Camundongos knockout para Dact1 apresentam múltiplos comprometimentos que se assemelham à Síndrome de Regressão Caudal (SRC) de neonatos humanos, exibindo agenesia das vértebras caudais, malformação anorretal e dos rins, além da perda da bexiga urinária (WEN et al, 2010). Estudos revelam que a sinalização da polaridade celular planar deve ser regulada por Dact1 por meio de alterações nos níveis e localização da proteína Dvl nas células (WEN et al., 2010).
Lagathu e colaboradores (2009) demonstraram que o gene Dact1 é, também, um gene pré-adipogênico e que, ao final do processo de adipogênese, sua expressão é diminuída. Em seus ensaios observou-se que o knockdown de Dact1 impede a adipogênese por meio da ativação da via de sinalização Wnt/β-catenina. Já a superexpressão constitutiva de Dact1
promove a adipogênese e confere resistência a ligantes da via Wnt que são antiadipogênicos, pois aumenta a expressão endógena de Sfrps1, antagonistas desta via. Interessantemente, em experimentos in vivo, foi demonstrado que, no tecido adiposo branco, Dact1 e a sinalização Wnt/β-catenina têm um perfil coordenado de expressão em resposta às alterações nutricionais, à estimulação da adipogênese por fármacos e, também, durante o desenvolvimento da obesidade, seja genética ou por indução por meio da dieta (LAGATHU et al., 2009).
Para contribuir com o entendimento dos mecanismos de regulação do gene Dact1 no contexto da adipogênese, uma estratégia interessante é o uso de ferramentas de Bioinformática como, por exemplo, a genômica comparativa. Este é um importante recurso para as anotações funcionais de genomas complexos, pois já se foi demonstrado que a conservação filogenética de uma sequência de DNA pode servir como um guia confiável para a identificação de elementos genômicos com funções biológicas importantes (OVCHARENKO, 2004), tais como promotores, enhancers, isoladores ou silenciadores.
Os enhancers foram descobertos há quase três décadas, mas apenas recentemente, com o desenvolvimento de novas tecnologias, foi possível delinear seus mecanismos de ação. Eles são encontrados nas regiões intergênicas, bem como em íntrons e nas 5’ e 3’ UTRs2 e,
geralmente, ficam localizados a grandes distâncias do promotor gênico (BULGER & GROUDINE, 2011). Um dos critérios empregados para identificar enhancers putativos é a conservação de sequências não codificantes, mas apenas na última década essa abordagem se tornou possível, quando genomas completos de diversos organismos foram sequenciados e disponibilizados para comparação (BULGER & GROUDINE, 2011). Em adição, mais recentemente, têm sido feitas análises em larga escala de ChIP3 em células humanas e de camundongo para modificações específicas de histonas, que são importantes indicadoras de que um determinado segmento genômico atua como um elemento regulador (O’GEEN et al., 2011).
Sabendo que sequências de DNA conservadas ao longo do tempo evolutivo - ECRs4 - são fortes candidatas a terem um papel funcional no controle da expressão gênica, o propósito desse trabalho foi identificar e caracterizar elementos genômicos que pudessem representar reguladores transcricionais do gene Dact1 no contexto da adipogênese. As análises de Bioinformática realizadas mostraram que o lócus de Dact1 possui uma ECR comum a aves e mamíferos, que poderia representar um elemento cis-regulador no contexto adipogênico. Isto foi postulado com base na presença de sítios de ligação para importantes fatores de transcrição
1 do inglês, secreted Frizzled-Related Proteins 2 do inglês, Untranslated Regions
3 do inglês, Chromatin Immunoprecipitation 4 do inglês, Evolutionary Conserved Regions
relacionados ao processo de adipogênese, como SMAD3 e PPARγ, os quais são conservados filogeneticamente. Esta ECR foi clonada em vetores de expressão e sua capacidade para dirigir a expressão de dois genes-repórter diferentes (eGFP5 e Luciferase) foi testada por eletroporação de células 3T3-L1 em cultura. Além disto, foram feitas análises de Bioinformática adicionais visando identificar polimorfismos nesta ECR característicos de diferentes grupos de animais, bem como localizar dados de ChIP-Seq em bancos de dados que corroborassem a funcionalidade deste elemento genômico em pré-adipócitos ou outros tipos celulares. Os resultados dos ensaios de eletroporação em células 3T3-L1 após o início da indução da diferenciação mostraram um aumento da expressão do gene-repórter da Luciferase dirigido pela ECR1 quando comparado com o vetor sem esta região, indicando um papel regulador da transcrição. As análises adicionais de Bioinformática realizadas revelaram vários polimorfismos nos sítios de ligação para fatores de transcrição, dentro e entre os grupos de animais comparados, em particular, entre mamíferos e aves. Este fato sugere que pequenas modificações na sequência da ECR1 poderiam estar associadas a particularidades funcionais deste elemento no controle transcricional de Dact1 em diferentes grupos de animais. Em adição, as análises dos dados de ChIP-Seq evidenciaram que nesta região estão presentes marcadores para modificações de cromatina característicos de enhancers ativos em células do fígado e coração de camundongos. Em conjunto, estes resultados abrem novas perspectivas para o estudo dos mecanismos de ação da ECR1 no controle da regulação transcricional de Dact1 no contexto da adipogênese nos vertebrados.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1
Origem e desenvolvimento do tecido adiposo
Cada um à sua maneira, todos os grupos de animais, do Caenorhabditis elegans ao Homo sapiens, desenvolveram uma forma de armazenar energia na forma de gordura (GESTA et al., 2007), para suprir a demanda energética quando necessário. O nemátoda C. elegans armazena gordura no epitélio intestinal (MCKAY et al., 2003), enquanto que os tubarões utilizam o fígado para este propósito (VAN VLEET et al., 1984), ambos tecidos de origem endodérmica (GESTA et al., 2007). No entanto, na maioria das espécies, o acúmulo de lipídios ocorre em um tecido de origem mesodérmica, chamado de tecido adiposo branco. Nos invertebrados, nos anfíbios e, na maioria dos répteis, o principal local de armazenamento de gordura é intra-abdominal, em focas e baleias é subcutâneo, enquanto que mamíferos e aves possuem tanto tecido adiposo intra-abdominal quanto subcutâneo (GESTA et al., 2007). Os mamíferos possuem não somente o tecido adiposo branco, principal responsável pelo armazenamento de triglicerídeos, mas também tecido adiposo marrom, que é capaz de fazer o dispêndio energético ser convertido em energia na forma de calor. Isto é possível pois este tecido expressa uma importante proteína conhecida como proteína desacopladora 1 (UCP-1)6 presente na membrana interna das mitocôndrias e que permite a dissipação do gradiente de prótons gerado pela respiração celular na forma de calor (CANNON & NEDERGAARD, 2004).
O tecido adiposo, assim como os músculos e os ossos, tem origem mesodérmica. A formação do mesoderma começa com a migração da camada de células entre o endoderma primitivo e a ectoderme. Esta camada se espalha ao longo dos eixos antero-posterior e dorso-ventral no embrião em desenvolvimento, dando origem aos mesodermas axial, intermediário, lateral e paraxial. O mesoderma paraxial se segmenta em somitos, os quais se compartimentalizam em dois domínios: o esclerótomo, que forma o esqueleto axial, e o dermomiótomo, que gera os músculos esqueléticos do tronco e membros, bem como o dermátomo, que irá formar a derme (GESTA et al., 2007). A placa mesodérmica lateral origina o coração, células sanguíneas, o celoma e o esqueleto dos membros (GESTA et al., 2007). No entanto, os ossos e músculos do crânio e da face são de origem ectodérmica, especificamente da crista neural (BRONNER-FRASER, 1994), e já foi demonstrado que as células-tronco desta
última são capazes de se diferenciar em adipócitos em cultura (BILLON et al., 2007). Presume-se que essas regiões mesodérmicas dão origem ao tecido adiposo nos locais correspondentes ao dermátomo; assim como ocorre com o tecido adiposo branco, o tecido adiposo marrom tem a mesma origem mesodérmica (GESTA et al., 2007).
Após o nascimento, as células precursoras de adipócitos brancos (CD24+ PPARγ+), originárias de células-tronco mesenquimais, residem em compartimentos de células murais da vasculatura do tecido adiposo. A diferenciação desses precursores é dirigida pelos fatores de transcrição PPARγ7 e C/EBPs8 (Figura 1). Esta população de células precursoras reconstitui os depósitos de tecido adiposo branco mesmo durante a vida adulta do indivíduo, sempre respondendo à demanda energética (PARK et al., 2008). Já os adipócitos marrons compartilham os mesmos precursores com as células musculares e têm como fator de transcrição característico Myf59. A indução da expressão de PRDM1610 leva à diferenciação dessas células em adipócitos marrons. Na ausência de PRDM16 e presença de outros fatores miogênicos, miogenina11 e MyoD12, elas se comprometem com o destino da diferenciação muscular (PARK et al., 2008). Os osteoblastos, responsáveis pela formação do tecido ósseo, também são originários de células-tronco mesenquimais e, na presença de fatores de transcrição como RunX213 e Osx14 estes últimos atingem a forma de osteócitos, células que ficam aprisionadas na matriz óssea mineralizada (FRANZ-ODENDAAL et al., 2006).
7 do inglês, Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ 8 do inglês, CCAAT/enhancer-binding proteins
9 do inglês, Myogenic Factor 5 10 do inglês, PR Domain Containing 16 11 do inglês, Myogenin
12 do inglês, Myogenic Differentiation
13 do inglês, Runt-Related Transcription Factor 2 14 do inglês, Osterix
Dentre os principais fatores de transcrição relacionados à adipogênese encontram-se os membros da família de receptores ativados por proliferadores de peroxissomos, conhecidos como PPAR15 e que possuem três isoformas: PPARα, PPARγ e PPARδ (também denominado PPARβ). Estes fatores são importantes reguladores da homeostase lipídica das células, pois controlam o balanço entre a queima e o acúmulo dos ácidos graxos de cadeia longa (SHI et al., 2002). Camundongos deficientes em PPARα não conseguem responder à ação dos proliferadores de peroxissomos e não induzem a expressão de vários genes que são necessários para o metabolismo dos ácidos-graxos, incluindo acil-CoA oxidase (ACOX-1) (LEE et al., 1995). Leone e colaboradores (1999) demostraram também que a inativação do gene PPARα acarreta no acúmulo de lipídios no fígado, grave hipocetonemia, hipoglicemia, hipotermia e altos níveis de ácidos graxos livres no plasma dos camundongos mutados. PPARγ é um fator de transcrição característico do tecido adiposo branco crucial para a ativação da adipogênese, enquanto que PPARδ é um potente inibidor da ativação transcricional de PPARα e PPARγ (SHI et al., 2002).
Shi e colaboradores (2002) demonstraram que PPARδ funciona como um repressor transcricional por duas maneiras distintas. Uma delas, por meio da sua própria capacidade de reprimir a transcrição basal. Na outra, a coexpressão de PPARδ com PPARα ou PPARγ leva à inibição da expressão dos genes-alvo dos PPAR. PPARδ é capaz de bloquear a expressão da enzima acil-CoA oxidase, enzima que atua na reação de β-oxidação dos ácidos graxos e alvo
15do inglês, Peroxisome Proliferator-Activated Receptor
Figura 1- As células-tronco mesenquimais podem originar precursores de adipócitos brancos, adipócitos marrons e células musculares, além de osteoblastos. Na presença de fatores de transcrição PPARγ e C/EBPα ocorre a diferenciação em adipócitos maduros. Adaptado de PARK et al., 2008.
direto de PPARα, além do próprio processo de adipogênese, no qual é necessária a presença de PPARγ.
Dentre as muitas cascatas transcricionais envolvidas na adipogênese, a principal isoforma de PPARγ responsável por este processo é a PPARγ2, uma das formas decorrentes do splicing alternativo do gene PPARγ. Quando o pré-adipócito recebe os sinais hormonais como dos glicorticóides ou AMP cíclico (cAMP) e insulina, a expressão de fatores de transcrição C/EBPβ e C/EBPδ é transientemente aumentada durante o processo de diferenciação em adipócitos e, juntos, estes fatores induzem a expressão de PPARγ2. PPARγ2 então se heterodimeriza com o receptor X retinóide e induz a expressão de C/EBPα, que subsequentemente assume a função de C/EBPβ e C/EBPδ de manter a transcrição de PPARγ2 via um mecanismo de feedback positivo, que leva à indução de outros genes adipogênicos envolvidos neste programa de diferenciação celular (TAN et al., 2012).
2.2
O pré-adipócito e seu principal marcador
O tecido adiposo branco contém a chamada fração vascular estromal, que é composta por pré-adipócitos, células endoteliais, macrófagos e outras células semelhantes a fibroblastos. Um dos principais marcadores de pré-adipócitos é o Pref-116, também chamado de
Dlk117 e é tido como um fator inibidor da diferenciação de pré-adipócitos para adipócitos
maduros (HUDAK & SUL, 2013), atuando para manter a célula em estado indiferenciado. Somado a isto, estudos observaram que Pref-1 tem sua expressão reduzida durante a diferenciação, permitindo que o processo de adipogênese tome lugar, agindo sempre de forma autócrina/parácrina (SMAS et al., 1993; SMAS et al., 1999; HUDAK & SUL, 2013).
Pref-1 é sintetizada como uma proteína transmembrana que contém seis repetições EGF-semelhante no domínio extracelular. Após a clivagem proteolítica por TACE18, são geradas diversas formas solúveis de Pref-1, sendo a forma maior, de 50 kDa, a biologicamente ativa (HUDAK & SUL, 2013). Hudak e Sul demonstraram que Pref-1 induz a expressão de Sox9 por meio da ativação da via MEK/ERK (Figura 2) e, portanto, a superexpressão constitutiva de Sox9 pode inibir a diferenciação em adipócitos. Além disso, com a queda dos níveis de expressão de Pref-1 durante a adipogênese, observa-se um aumento dos fatores C/EBPβ e C/EBPδ, que precede a indução de C/EBPα e PPARγ. Portanto, Sox9 mantém o
16do inglês, Preadipocyte Factor-1 17do inglês, Delta-Like Protein-1 18do inglês,TNF-α Converting Enzyme
estado de pré-adipócito suprimindo a transcrição de C/EBPβ e C/EBPδ, se ligando diretamente as regiões promotoras desses genes (HUDAK & SUL, 2013)
A deleção do gene Pref-1 em camundongos causa o aumento da adiposidade nestes animais, observando-se grande diferenciação dos pré-adipócitos em adipócitos (MOON et al., 2002; WANG et al., 2010). Por outro lado, os camundongos transgênicos que superexpressam a forma solúvel de Pref-1 no tecido adiposo ou no fígado apresentam uma queda na adipogênese e consequente diminuição da adiposidade (LEE et al., 2003; VILLENA et al., 2008; WANG et al., 2010).
Figura 2 – Mecanismo de ação de Pref-1. A proteína transmembrana Pref-1 é clivada pela ação da enzima TACE, gerando a sua forma solúvel. Pref-1 interage com a fibronectina formando um complexo que interage com a integrina α5β1 (receptor de fibronectina) que então ativa a via de sinalização MEK/ERK, levando à expressão de Sox9 e consequente inibição da transcrição de C/EBPβ e C/EBPδ. A dexametasona (DEX) é um corticosteróide que diminui a expressão de Pref-1, enquanto que IBMX (3-isobutil-1-metilxantina) aumenta sua expressão. Epinefrina, hormônios do crescimento e estrógeno também são substâncias que aumentam a expressão de Pref-1. Adaptado de HUDAK & SUL, 2013
Fibronectina
Pref-1 TACE
MEK/ERK
2.3
As proteínas SMADs e a via de sinalização TGF-
β
A família de fatores TGF-β19 compreende um grande número de fatores de crescimento capazes de regular inúmeros fenômenos celulares, como proliferação, determinação, diferenciação, motilidade, adesão e morte celular (MASSAGUÉ, 1998). A via TGF-β atua em padrões temporais e tecido-específicos, controlando o desenvolvimento e a homeostase de uma vasta gama de tecidos. Esta via de sinalização envolve proteínas receptoras serina/treonina quinases na superfície da célula e os seus substratos, as proteínas SMADs20. Estas proteínas se translocam para o núcleo onde ativam a transcrição de genes-alvo em associação com outros elementos que se ligam ao DNA. De acordo com Massagué (1998), as proteínas SMADs são categorizadas em três subfamílias: SMADs que são substratos diretos dos receptores quinases da família TFG-β (SMAD1, 2, 3, 5 e 8), SMADs que participam da sinalização associando-se com estes receptores após a ligação com as SMADs que são substratos diretos (SMAD4) e SMADs que inibem o processo de ativação da via pelas outras SMADs (SMAD6 e 7).
Em termos estruturais, as SMADs são proteínas modulares com dois domínios conservados, o domínio N-terminal MH1 que funciona como uma sequência específica para ligação do DNA, exceto nas SMADs 6 e 7, e o domínio C-terminal MH2 que medeia interações com os receptores, que é responsável pela oligomerização dessas proteínas e também para a translocação delas para o núcleo celular (SHI & MASSAGUÉ, 2003). Na via TGF-β canônica, quando ativada, SMAD2 e SMAD3 são fosforiladas e se oligomerizam com SMAD4, formando um complexo que é translocado para o núcleo da célula, onde se liga ao DNA modulando eventos transcricionais (TAN et al., 2012). Os receptores TGF-β I e II são os responsáveis pelo recrutamento e fosforilação das SMAD2 e SMAD3, que então se complexam com a SMAD4 (Figura 3).
19 do inglês, Transforming Growth Factor β 20 do inglês, SMA/MAD Related
Estudos recentes levaram à descoberta de que a ativação aumentada da via de sinalização TGF-β/Smad3 é observada no tecido adiposo branco de camundongos geneticamente obesos (ob/ob). Em humanos, o nível de TGF-β1 no tecido adiposo e o índice de massa corpórea foram intimamente relacionados a indivíduos com obesidade mórbida (TAN et al., 2012). A deficiência em SMAD3 leva à regulação positiva do fator anti-adipogênico CHOP-1021, que se liga diretamente ao fator C/EBPβ para liberar a transcrição de PPARβ/δ, enquanto impede a ativação de PPARγ2, principal fator de transcrição que leva ao início da adipogênese (Figura 4). Ainda neste contexto, camundongos knockout para Smad3 exibem uma adiposidade diminuída e aumento de tolerância à glicose e sensibilidade à insulina. Essa descoberta indica que Smad3, como mediador da via TGF-β canônica, age como um versátil regulador da homeostase metabólica, podendo ser um importante alvo farmacológico. A disponibilidade de inibidores específicos para Smad3 poderiam, no futuro, contribuir para o controle da obesidade e diabetes, consideradas atuais epidemias do mundo moderno.
21 do inglês, C/EBP Homologous Protein
Figura 3 – Esquema da ativação da via TGF-β canônica. Os receptores de sinalização TGF-β dos tipos I e II recrutam e ativam SMADs, que se oligomerizam e são translocadas para o núcleo, onde regulam a expressão de genes no nível transcricional. Adaptado de TAN et al., 2012.
2.4
Dact1 e sua ação pró-adipogênica por meio da via de sinalização
Wnt
Os membros da família de proteínas DACT22 foram inicialmente identificados por meio do estudo das interações com Dishevelled (Dvl), uma proteína citoplasmática central na sinalização Wnt. A via Wnt23, por sua vez, compõe uma família de glicoproteínas com efeitos parácrinos e autócrinos na regulação da proliferação, sobrevivência, destino e comprometimento celulares, e foi comprovadamente relacionada à regulação da adipogênese (QIN et al., 2010).
Na via Wnt canônica, os membros desta família se ligam a receptores frizzled (FZD) e a co-receptores LRP5/6 levando à inativação do complexo de degradação da β-catenina, que inclui GSK-3β, axina e APC. Desta forma, na presença de Wnts, GSK-3β deixa de bloquear a fosforilação da β-catenina. A hipofosforilação da β-catenina e a sua translocação para o núcleo celular leva à ligação com membros da família de fatores de transcrição LEF/TCF e a ativação de genes alvo da via Wnt (CHRISTODOULIDES et al., 2009). Estudos realizados mostram
22 do inglês, Dishevelled-Binding Antagonist of β-Catenin 23 do inglês, Wingless-type MMTV integration site
Figura 4 – A via TGF-β/Smad3 ativa o processo adipogênico. O knockout de Smad3 favorece a β-oxidação e inibe a adipogênese, pois SMAD3 deixa de inibir CHOP-10, liberando-o para interação com C/EBPβ e, por conseguinte, permitindo a expressão de PPARδ. Adaptado de TAN et al., 2012.
que a via de sinalização Wnt inibe a diferenciação dos adipócitos por meio do bloqueio da expressão de fatores de transcrição cruciais para o processo: PPARγ e C/EBPα (ROSS et al., 2000). C-myc, ciclina D1 e PPARδ são importantes genes-alvo da via Wnt (HE et al., 1998; HE et al., 1999; SHTUTMAN et al., 1999; CAWTHORN et al., 2007). Freytag e colaboradores (1992) demonstraram que c-myc impede o processo de adipogênese inibindo a expressão de C/EBPα; além disso, ciclina D1 e PPARδ atuam como supressores de PPARγ (SHI et al., 2002; FU et al., 2005; CAWTHORN et al., 2007). Desta forma, pode-se concluir que as proteínas Wnt agem como um “freio” funcional durante o recrutamento dos pré-adipócitos para o programa de diferenciação em adipócitos.
Lagathu e colaboradores (2009) demonstraram que o gene Dact1 é primariamente expresso em pré-adipócitos de humanos e murinos e na fração vascular estromal do tecido adiposo branco. A expressão de Dact1 confere potencial pró-adipogênico e sua presença nos pré-adipócitos é necessária para que haja diferenciação em adipócitos maduros. Foi também demonstrado que esse papel atribuído ao gene Dact1 deve-se ao fato de ele atuar como um antagonista da via Wnt/β-catenina nos pré-adipócitos (LAGATHU et al., 2009), permitindo a cascata de reações que leva à degradação da β-catenina e que, portanto, permite a expressão de fatores de transcrição adipogênicos, como PPARγ e C/EBPα. Lagathu e colaboradores demonstram, ainda, que sob condições de resistência à insulina, quando a adipogênese e a deposição de gordura atingem um platô, esta rede deixa de ocorrer, mas Dact1 continua atuando, facilitando a expansão do tecido adiposo a fim de armazenar nutrientes baseado na situação nutricional e metabólica do indivíduo. A desregulação dessa complexa rede pode ser a base patológica que leva a um balanço alterado entre o crescimento dos adipócitos e o recrutamento dos pré-adipócitos que, em última instância, leva à variação entre a hipertrofia e a hiperplasia neste tecido (LAGATHU et al., 2009).
Enquanto que Dact1 pôde ser relacionado ao processo de adipogênese, não se sabe se os outros membros que compõem esta família – Dact2, Dact3 e Dact4 – participam direta ou indiretamente deste processo. Dact2, além de ter sido descrito em humanos e camundongos, também foi encontrado em galinha, répteis, bem como no peixe de nadadeira lobada celacanto e em vários peixes teleósteos (WAXMAN et al., 2004; ALVARES et al., 2009; SCHUBERT et al., 2014). Durante o desenvolvimento do peixe-zebra, Dact2 regula os movimentos de extensão convergente regulando a via de sinalização Wnt/Polaridade celular planar (WAXMAN et al., 2004). Quanto ao desenvolvimento em camundongos, sabe-se que Dact2 age como um modulador negativo da via Wnt canônica durante a formação dos dentes, pois reprime a expressão de Pitx2 (LI et al., 2013). Por fim, foi demonstrado também que Dact2
diminui a sinalização TGF-β/Nodal facilitando a degradação lisossomal de receptores ALK4 e ALK5 durante a indução do mesoderma no desenvolvimento embrionário (ZHANG et al., 2004; SU et al., 2007; LEE et al., 2010).
Dact3 foi primariamente descrito apenas nos mamíferos (FISHER et al., 2006). No entanto, estudos recentes revelaram que dois parálogos desse gene (Dact3a e Dact3b) agem dinamicamente durante o desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. A repressão epigenética de Dact3 foi associada com o aumento da via Wnt canônica em casos de câncer colorretal, sugerindo que Dact3 age como um modulador negativo desta via (JIANG et al., 2008). Camundongos knockout para Dact3 não apresentaram nenhuma anormalidade morfológica nitidamente detectável, mas se mostraram com peso corporal ligeiramente mais baixo do que os camundongos do tipo selvagem, indicando que este gene pode ter um papel importante no crescimento normal desses animais (XUE et al., 2013). Assim como Dact1, estudos corroboram com papel de antagonista da via Wnt exercido pelo Dact3 (JIANG et al., 2008).
2.5
Elementos cis-reguladores atuam como moduladores da ação
gênica
Elementos genômicos reguladores podem estar localizados upstream, downstream ou mesmo dentro das regiões codificadoras de um gene. O perfil global de expressão de um gene deve-se à presença de vários módulos reguladores, sendo que estes, individualmente, podem ser compostos de múltiplos sítios de ligação para fatores de transcrição, que geralmente possuem de 6 a 15 pb (DAVIDSON, 2001; KADONAGA, 2004; STRÄHLE & RASTEGAR, 2008). Estes elementos reguladores podem atuar como promotores, enhancers, silenciadores e isoladores – os quais são necessários para controlar onde e quando um gene em particular é transcrito (GILBERT, 2010).
Promotores são locais onde a RNA polimerase e fatores de transcrição basais se ligam ao DNA para iniciar a transcrição, promovendo níveis basais de expressão de um gene. Por sua vez, enhancers são sequências de DNA que controlam a eficiência e a taxa de transcrição de um promotor específico. Os enhancers são elementos definidos pela sua capacidade de ativação da transcrição de determinado gene, independentemente da sua distância e orientação em relação ao promotor deste último (BULGER & GROUDINE, 2010). Assim, eles podem também ativar promotores presentes no mesmo cromossomo (i.e, ligados em cis) e, por isso, são chamados de elementos ou módulos cis-reguladores. Estes elementos geralmente
ativam a transcrição remodelando a cromatina a fim de expô-la ao promotor e/ou facilitando a ligação deste último à RNA polimerase por meio da estabilização dos fatores associados à TBP24 (GILBERT, 2010). A ligação do remodeladores de cromatina deve envolver grupos químicos presentes nos nucleossomos. Histonas, proteínas constitutivas dos nucleossomos, podem ser dinamicamente modificadas, isto é, acetiladas, metiladas ou fosforiladas em diferentes resíduos. Sugere-se que a maquinaria celular reconheça o código de elementos de DNA baseada na combinação dessas modificações (JENUWEIN & ALLIS, 2001). Silenciadores são regiões do DNA onde se ligam fatores de transcrição repressores da transcrição de um gene em particular, impedindo o acesso de fatores ativadores à região do promotor por meio de mudanças na conformação da cromatina, acionando uma rede de fatores que culminam no estado de heterocromatina (RAAB & TOMAKAKA, 2010). Em alguns casos, elementos repressores agem bloqueando a ligação de um fator de transcrição ativador ou então competindo pelo mesmo sítio (MASTON et al., 2006). Os isoladores são complexos formados pela interação DNA-proteína que são capazes de bloquear a interação entre um enhancer e um promotor e/ou funcionam como barreiras contra os efeitos silenciadores do estado de heterocromatina. No entanto, nem todas as sequências descritas como isoladoras apresentam estas duas propriedades. Isoladores de barreira devem agir recrutando enzimas envolvidas em modificações de histonas que são capazes de cessar o espalhamento do silenciamento de um gene por meio da formação de heterocromatina (HUANG et al., 2007). Em vertebrados, os isoladores de enhancer atuam, principalmente, por meio da interação com CTCF25, uma proteína multifuncional envolvida na regulação gênica (RAAB & TOMAKAKA, 2010).
A exata expressão espaço-temporal dos genes depende da ação de elementos cis-reguladores, onde se ligam fatores de transcrição que são célula-específicos ou fatores que são expressos na presença de sinais externos, por exemplo, hormônios, em um ponto específico do desenvolvimento da célula, como a diferenciação ou proliferação (SAKABE et al., 2012). Embora estes elementos cis-reguladores venham sendo estudados há décadas, foi somente com o advento da técnica experimental de ChIP, ferramenta com a qual é possível localizar sítios no DNA onde proteínas específicas estão ligadas, que permitiu a identificação de milhares de elementos putativos.
Devido à importância atribuída a este complexo mecanismo de regulação da expressão gênica, novas ferramentas de Bioinformática também foram desenvolvidas e/ou aprimoradas para que se pudesse predizer com maior especificidade potenciais regiões que
24 do inglês, TATA-Binding Protein 25 do inglês, CCCTC-Binding Factor
atuam como elementos reguladores. Com esses adventos, foi possível revelar a importância dos estudos comparativos entre os genomas de vertebrados inferiores e superiores ao longo do tempo evolutivo, como forma de apontar uma possível pressão seletiva para que essas regiões se mantivessem conservadas, sugerindo um potencial papel funcional dessas regiões.
Regiões regulatórias podem ser modificadas ou moduladas de diferentes maneiras. Elas podem surgir pelo acúmulo de mutações dentro de uma gama de algumas centenas de pares de base, criando um cluster funcional de fatores de transcrição (STRÄHLE & RASTEGAR, 2008). Ou então, os elementos reguladores existentes podem sofrer mutações e serem modificados, gerando novos padrões de expressão gênicos – podendo perder sítios de ligação para fatores de transcrição ou, então, mudanças na sequência poderiam gerar novos sítios, para novos fatores, dentro deste cluster. Por fim, mudanças ao longo do tempo evolutivo podem ocorrer não nos elementos reguladores, mas sim no padrão de expressão dos fatores de transcrição que ali interagem, causando a ativação de um enhancer em um novo tipo celular, onde até então este último permanecia inativo (STRÄHLE & RASTEGAR, 2008).
3. OBJETIVOS
3.1
Objetivo geral
Identificar e estudar regiões evolutivamente conservadas (ECRs) que possam atuar como elementos genômicos reguladores da transcrição do gene Dact1, no contexto da diferenciação dos pré-adipócitos em adipócitos maduros.
3.2
Objetivos específicos
Localizar ECRs no lócus gênico de Dact1;
Identificar os sítios de ligação para fatores de transcrição que estejam conservados nessas ECRs e analisar suas possíveis funções na adipogênese a partir de comparações com dados da literatura;
Selecionar ECRs com potencial cis-regulador relacionado à diferenciação dos pré-adipócitos em pré-adipócitos maduros de acordo com os sítios de ligação para fatores de transcrição encontrados;
Escolher uma ECR para caracterização funcional e detalhamento das análises de Bioinformática;
Determinar a conservação filogenética da ECR pré-adipogênica identificando também os principais polimorfismos presentes nos sítios de ligação para os fatores de transcrição avaliados;
Analisar os bancos de dados públicos para detectar dados de ChIP (Chromatin Immunoprecipitation) que pudessem confirmar a funcionalidade de ECR selecionada; Clonar a ECR de interesse em vetores de expressão (pTKeGFP e pGL2-TK-Luc); Confirmar o papel regulador da transcrição da ECR por meio de ensaios de transfecção
4. METODOLOGIA
4.1
Análises de Bioinformática
4.1.1
Localização de ECRs no entorno do gene Dact1
Para identificar ECRs no lócus do gene Dact1 de vertebrados foi utilizado o programa ECR Browser26, que permite a visualização e análise de ECRs em genomas de espécies já sequenciadas (OVCHARENKO et al., 2004), a partir da comparação entre os genomas de vertebrados amniotos representados pela galinha, camundongo e humano. O genoma humano foi utilizado como base para as comparações.
Os parâmetros utilizados para definir as ECRs são aqueles considerados padrão do algoritmo do programa: 1) comprimento mínimo de 100 pb e 2) 70% de identidade de sequência.
Os alinhamentos das sequências de galinha, camundongo e humano foram realizados com o auxílio do programa Mulan27, que é capaz de realizar alinhamentos múltiplos de sequências de DNA.
4.1.2
Caracterização dos sítios de ligação para fatores de
transcrição conservados evolutivamente
Após o emprego do Mulan foi utilizada a ferramenta MultiTF28, que identifica sítios de ligação para fatores de transcrição evolutivamente conservados entre múltiplas espécies (OVCHARENKO et al., 2005), a partir da biblioteca do TRANSFAC29 que possui um total superior a 400 famílias de fatores de transcrição de vertebrados catalogados. A similaridade de matriz foi pré-definida como otimizada para função (optimized for function), de forma a utilizar diferentes parâmetros para diversos sítios de ligação de fatores transcricionais, minimizando e balanceando a abundância de hits falso-negativos de diferentes matrizes (LOOTS & OVCHARENKO, 2007).
26 Evolutionary Conserved Region Browser (http://ecrbrowser.dcode.org/)
27 MUltiple sequence Local AligNment and conservation visualization tool (http://mulan.dcode.org/) 28 http://multitf.dcode.org/
4.1.3
Identificação de ECRs com potencial adipogênico
Após a identificação das ECRs e dos sítios de ligação para fatores de transcrição conservados evolutivamente, foi realizada uma análise utilizando-se o banco de dados TRANSFAC, bem como por meio dos dados presentes na literatura para identificar os contextos biológicos nos quais cada um dos fatores de transcrição está majoritariamente envolvido. Com base nas informações obtidas, uma das ECRs detectada foi selecionada para aprofundamento dos estudos. Daqui por diante, tal ECR será denominada ECR1.
4.1.4
Estudo da interação ECR-proteínas por ChIP usando o
banco de dados Ensembl
Para verificar as interações que ocorrem entre a ECR1 e proteínas específicas tendo como base os dados de sequenciamento de cromatina imunoprecipitada - ChiP-Seq30 -
(ROBERTSON et al., 2007), foi empregado o navegador genômico da UCSC31 que tem em seu banco informações providas pelo projeto ENCODE32. Este banco de dados é composto por dados experimentais disponibilizados pelo projeto ENCODE, que é uma colaboração internacional de grupos de pesquisa fundada pelo NHGRI33. O propósito deste projeto é construir uma abrangente biblioteca de informações sobre elementos funcionais, incluindo elementos que podem atuar nos níveis de proteína ou RNA e sobre elementos reguladores que controlam as diferentes circunstâncias em que um gene é ativo. Um dos principais dados disponibilizados são aqueles gerados por experimentos de ChIP-Seq, empregados em inúmeros tipos celulares.
Utilizando a montagem genômica NCBI37/mm9 que fornece dados gerados a partir de experimentos com camundongos, a sequência da ECR1 correspondente neste organismo foi utilizada na ferramenta BLAT34, aplicando-se todos os tracks disponíveis para análise de "Expressão e Regulação”, fornecendo, assim, o maior número possível de informações relacionadas aos sítios de ligação para fatores de transcrição conservados na sequência de estudo e as interações com diversas proteínas já observadas experimentalmente e incorporadas ao banco de dados.
30 do inglês, Chromatin Immunoprecipitation Sequencing
31 University of California, Santa Cruz – UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/) 32 ENCyclopedia Of DNA Elements (http://www.genome.gov/encode/)
33 National Human Genome Research Institute
4.1.5
Análise da conservação evolutiva da ECR1
A fim de verificar a conservação da ECR1 flanqueadora do gene Dact1, a sequência desta ECR em humanos foi utilizada como base para comparação com o genoma de outras espécies de vertebrados utilizando-se a ferramenta BLAST35 do navegador genômico
Ensembl36. Sequências ortólogas à ECR1 foram buscadas comparando esta sequência à todas
as sequências de vertebrados catalogadas neste banco de dados, conforme os parâmetros mostrados na Figura 5, permitindo a localização de sequências relativamente conservadas e, consequentemente, similares mesmo em organismos distantes filogeneticamente. Apenas as sequências que se encontravam no lócus gênico do Dact1 foram selecionadas para análise.
As sequências encontradas foram, então, alinhadas pelo software BioEdit37 e manipuladas para verificar a conservação presente nesta região do lócus do gene Dact1 no que tange os sítios de ligação para os fatores de transcrição previamente apontados pela ferramenta MultiTF. Além disso, para cada um dos sítios foi analisada a presença de polimorfismos nesta região do genoma em cada um dos vertebrados apontados pela análise descrita acima.
35 Basic Local Alignment Search Tool (http://www.ensembl.org/Multi/Tools/Blast?db=core)
36 Ensembl release 83 - December 2015 © WTSI / EMBL-EBI (http://www.ensembl.org/info/about/index.html) 37 BioEdit Sequence Alignment Editor v. 7.2.5 – Copyright © 1997-2013 Tom Hall
Figura 5 – Interface apresentada pelo navegador genômico Ensembl. A imagem mostra os parâmetros utilizados para a comparação da ECR1 realizadas por BLASTN (Nucleotide-Nucleotide BLAST), tendo como base o genoma humano, com as demais sequências genômicas para diversas espécies disponíveis no banco de dados.
4.2
Clonagem da ECR1 do lócus do gene Dact1 com potencial
adipogênico
4.2.1
Desenho de primers para amplificação da ECR1
Após a identificação da ECR1 com sítios de ligação para fatores de transcrição relacionados ao desenvolvimento do tecido adiposo branco, e que possivelmente estão relacionados à modulação da atividade do gene Dact1 nesse contexto específico, foram desenhados primers para ensaios de PCR38 com o auxílio das ferramentas Primer-BLAST39 e Primer3: WWW Primer Tool40, a fim de se obter a amplificação do fragmento genômico correspondente à ECR1 para validação do elemento cis-regulador em camundongos. Os primers direto e reverso foram desenhados flanqueando a região da ECR1 em aproximadamente 200 pb.
Tabela 1 - Sequências dos primers utilizados para amplificação da ECR1.
ECR Primer Direto Primer Reverso Amplicon
ECR1 TCCACCCTACACCCTCCTTT TTGCCCAAACAGAACACAAGC 665 pb
4.2.2
Extração de DNA genômico
O DNA genômico de camundongo foi obtido a partir de material biológico desse organismo (protocolo da Comissão de Ética no Uso de Animais no 3402-1) utilizando o Kit Wizard de Extração de DNA (Promega), conforme instruções do fabricante.
4.2.3
Reação em cadeia da polimerase (PCR) para
amplificação da ECR1
Para a amplificação da ECR1 foram preparadas reações contendo 300 ng de DNA genômico de camundongo; 1 μL de dNTPs (10 mM); 3 μL de MgCl2 (25 mM); 2,5 μL de
38 do inglês, Polymerase Chain Reaction
39 NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
40 Whitehead Institute for Biomedical Research - Copyright © 1996 – 1998
DMSO41; 0,5 μL de Taq DNA Polimerase (Fermentas); 0,5 μL 10X Taq Buffer (Fermentas); 1 μL de cada um dos primers (direto e reverso); e água tratada com DEPC para completar o volume para 50 μL. A amplificação do fragmento foi realizada no Termociclador Eppendorf Mastercycler Pro nas seguintes condições:
Pré-desnaturação: 95ºC, 2 minutos Primeira fase (5 ciclos):
95ºC, 30 segundos 65ºC, 30 segundos 72ºC, 1 minuto Segunda fase (30 ciclos):
95ºC, 30 segundos 55ºC, 30 segundos 72ºC, 1 minuto Extensão final:
72ºC, 10 minutos
A verificação da reação de amplificação foi feita em gel de agarose 1%, no qual foi aplicado 1 µL do produto de PCR, 1 µL do corante de ácidos nucléicos Gel Red (Uniscience), e 8 µL de água tratada com DEPC. Para verificação do tamanho do fragmento foi realizada eletroforese e utilizados 1 µL do marcador de peso molecular O´GeneRuler 1kb Ladder (0,1 µg/µL, 50 µg, Fermentas), 1 µL do corante e 8 µL de água tratada com DEPC. A purificação do produto de PCR foi feita com o MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN), conforme instruções do fabricante.
4.2.4
Preparação dos produtos de PCR para clonagem – reação
de fill-in
Após a ação da enzima Taq polimerase, os produtos de DNA gerados apresentam uma adenina excedente nas extremidades 3’. Por isso, é necessário fazer o fill-in dessas amostras, que consiste em adicionar uma timina nas extremidades 5’ dos fragmentos de DNA
para restaurá-las. Foi preparada uma reação contendo 37 μL do produto de PCR purificado, 1 μL de dNTPs (10 mM), 1 μL da enzima T4 DNA polimerase (Thermo Fisher Scientific), 10 μL do 5X T4 Buffer (Thermo Fisher Scientific) e 1 μL de água tratada com DEPC, completando 50 μL. A reação foi deixada por 5 min a temperatura ambiente e em seguida foi interrompida pela adição de 1 μL de EDTA 0,5M e incubação a 70°C por 10 min. Uma nova purificação foi então realizada com o MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN).
4.2.5
Preparação do vetor para clonagem
Para a clonagem foi utilizado o vetor pTKeGFP (Figura 6), que possui o promotor TK (Herpes simplex virus thymidine kinase promoter) upstream ao gene repórter eGFP. A ECR1 foi clonada upstream ao promotor TK. Para tanto, o vetor pTKeGFP foi digerido e linearizado com a enzima SmaI. Para a digestão do vetor com SmaI, 2 µL desta enzima (10u/µL, Invitrogen) foram adicionados a uma reação contendo 70 µL de DNA (200ng/µL), 10 µL do 10x Buffer (Invitrogen) e 18 µL de água tratada com DEPC, totalizando 100 µL de reação. Seguiu-se, então, a incubação por 2 h a 37°C. Após verificar, por eletroforese em gel de agarose 1%, se o vetor foi devidamente clivado, o DNA do vetor foi purificado com MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN), conforme instruções do fabricante.
4.2.6
Reação de Ligação
O fragmento correspondente à ECR1 foi clonado no vetor aberto com a enzima SmaI. Para cada 100 ng do vetor pTKeGFP aberto, foi acrescentado o produto de PCR purificado em quantidade equivalente a três vezes a quantidade equimolar, 1 µL da enzima T4 DNA Ligase (5 U/µL, 200 U, Fermentas), 2 µL do 10x Buffer (Fermentas), 0,5 µL da enzima SmaI, 2 µL de 50% PEG 4000 e 12,8 µL de água tratada com DEPC, totalizando 20 µL de reação. A reação foi deixada a 22°C overnight. A ligação entre o vetor e o inserto foi verificada por eletroforese de uma alíquota em gel de agarose 1%.
4.2.7
Transformação em bactérias competentes
A transformação foi feita com 10 ng do produto de ligação, que foram adicionados a 50 µL de bactérias E. coli (DH5α) competentes e submetidas a choque térmico a 42°C por 1 min. Após a transformação, as bactérias foram adicionadas a 0,5 mL de meio LB42 e permaneceram em shaker a 250 rpm, 37°C, por 1 hora. Após esse período, foram plaqueados 100 µL do produto da transformação em placas de meio LB-ágar contendo 100 mg/mL de ampicilina. As placas foram então levadas armazenadas em estufa a 37oC overnight.
42 Luria-Bertani
Figura 6 - Vetor pTKeGFP utilizado para clonagem. Em azul está destacado o promotor mínimo TK, upstream ao gene repórter eGFP. Destacado com um asterisco vermelho está o sítio da enzima de restrição SmaI (5’-CCCGGG-3’) utilizado para a abertura do vetor e clonagem da ECR1.
