Presença de coinfecção viral

Durante o estudo foi detectada a presença de dois vírus na mesma amostra em 7/58 (12,1%) dos pacientes, onde 6 apresentaram sinais e sintomas de doenças infecciosas e neutropenia febril, sendo 5/7 (71,4%) com alterações respiratórias e 1/7 com presença de exantema súbito (roséola infantum) e positividade para HHV-7 e CMV. Dentre os pacientes com coinfecção não foi observado variação significativa do número de neutrófilos e CRP em relação aos pacientes positivos para um único vírus (P = 0,756).

A análise da presença de coinfecção neste estudo revelou contagem média global de neutrófilos de 0,6 células/mm3 (variando de 0,3 – 0,9) e a dosagem média de PCR de 8,66 mg/dl (variação de 4,23 – 14,58) resultados pouco elevados (Valor de Referência abaixo de 5,0 mg/dl).

A permanência (mediana) em regime de internação hospitalar foi de 11 dias (variação de 5 – 18 dias), sendo que todos os pacientes receberam antibióticoterapia de amplo espectro como tratamento para a sepse, mesmo sem identificação do microrganismo em 53/58 (91,4%) dos casos em que as hemoculturas e culturas de urina foram negativas. A descrição das amostras com coinfecção são apresentadas na Tabela 14, abaixo:

Tabela 14. Presença de coinfecção nas amostras dos pacientes com neutropenia febril

Paciente Vírus Sintomas Neutrófilos (mm3_{) CRP (mg/dl)}

5 CMV + PvB19 AR 0.8 6.58 13 HHV-7 + PvB19 AR 1.0 7.89 27 HHV-7 + CMV Exantema Súbito 0.5 14.58 34 HHV-6 + EBV AR 0.4 11.80 36 CMV + PvB19 AR 0.6 5.89 42 HHV-7 + BKV AR 0.3 4.23 51 HHV-6 + HHV-7 Nenhum 0.9 9.65 HHV-7, Humano Herpesvírus 7; HHV-6, Humano Herpesvírus 6; PvB19, Parvovírus B19; CMV, Citomegalovírus; BKV, Poliomavírus; EBV, Epstein Barr vírus; AdV, Adenovírus; AR, Alterações respiratórias; PCR, Proteína C Reativa.

Dentre os sintomas pesquisados as alterações respiratórias foram as de maior relevância, com maior período de internação entre os pacientes estudados com mediana de 16 (14 - 18) dias. Dentre os pacientes com infecções respiratórias o CMV foi o causador de maior morbidade com 3 casos de pneumonia confirmados através da radiografia de tórax, sendo um caso em associação com o PvB19 com período de internação de 18 dias e suspensão do tratamento quimioterápico por 35 dias, após o início dos primeiros sintomas de infecção, conforme Figura 8 e 9.

O terceiro caso de pneumonia em associação com o CMV foi de um paciente logo após tratamento quimioterápico e queda acentuada dos neutrófilos em período menor de 3 dias, contagem de 0,1 neutrófilos /mm³ no hemograma, alterações hepáticas com aumento das transaminases, sendo TGO 130 U/L e TGO 95 U/L, CRP de 5,98 mg/dL próximo à normalidade. Entretanto, o paciente estava em tratamento de uma recidiva da doença (LLA) com presença de doença residual mínima (DRM).

Figura 8. Paciente 36: Radiografia de pulmão com coinfecção por CMV e PvB19. (Fonte: Hospital da Criança do GRENDACC).

Figura 9. Paciente 21: Radiografia de pulmão com infecção por CMV

Figura 10. Paciente 25: Radiografia de pulmão com infecção por CMV após quimioterapia para tratamento de recidiva de LLA com DRM.

6. Discussão

A realização do diagnóstico pela biologia molecular para pacientes com câncer, suspeita de doença infecciosa e neutropenia febril para detecção de microrganismos causadores de infecção está sendo muito utilizado atualmente12. A identificação rápida do agente etiológico causador de febre em pacientes neutropênicos é crucial, pois a administração da terapia correta e específica contra os microrganismos identificados melhora os resultados dos pacientes acometidos por uma possível infecção99. Quando a identificação do microrganismo causador da infecção, na presença de sinais e sintomas de sepse, não é realizada, antibióticos de amplo espectro são utilizados de maneira empírica para resolução do processo de infecção12,99.

Os resultados obtidos neste estudo somente com a identificação de microrganismos através dos testes convencionais, como a hemocultura, restrito a fungos e bactérias, foi realizado em um prazo de até 6 dias e apresentou baixa positividade (6,9%). Logo, todos os pacientes foram tratados com antibióticos de amplo espectro de forma empírica.

Essa positividade em amostras de hemocultura em pacientes oncológicos pediátricos com neutropenia e febre foi discordante dos resultados pesquisados em literatura atual, que variou entre 15 a 30% de positividade, apesar de todos os testes serem coletados conforme orientação do fabricante, que preconiza a coleta de 1 a 3 ml de sangue para cada teste de hemocultura. Entretanto, alguns estudos sugerem aumentar a quantidade de volume de amostra para os testes de hemocultura, pois a metodologia utilizada visa à detecção de microrganismos viáveis na amostra16-17. Após a análise dos resultados obtidos neste estudo e revisão de literatura, e em concordância com o fabricante, aumentamos o volume de sangue coletado para 5 a 7 ml.

Estudos recentes em pacientes com doenças oncohematológicas mostram que, aproximadamente 60% dos casos de sepse ocorrem em pacientes com neutropenia e febre em tratamento com quimioterapia. Entretanto, aproximadamente 71% dos casos são tratados como febre de origem desconhecida e apenas 14,6% dos casos foram confirmados por identificação de microrganismos em amostras coletadas em pacientes com neutropenia febril53.

Em nosso estudo, através da análise dos prontuários e dos resultados obtidos com os testes de hemocultura, encontramos infecção documentada em 38% dos pacientes analisados, com foco respiratório, urinário ou hemocultura positiva. Pacientes sem foco de infecção foram 62%, diagnosticados e tratados como febre de origem desconhecida e esses achados foram discordantes com a literatura atual.

A relevância do trato urinário como fonte de infecção para pacientes com neutropenia febril é pouco conhecida na literatura para crianças e adolescentes com câncer.

Estudo em pacientes portadores de doenças oncohematológicas apontam para 2,9 a 8,6% de infecções do trato urinário em neutropênicos com febre, mesmo sem a presença de sinais e sintomas de infecção84. Enquanto que, em crianças não portadoras de câncer, os casos positivos variam de 3,3 a 5,3% dos pacientes admitidos em serviços de emergência68. Este encontrou 1,7 % de positividade em amostras de urina sendo o microrganismo isolado a Eschirichia coli, multirresistente aos antibióticos testados. O tratamento à bactéria isolada foi modificado após os resultados da urocultura e antibiograma com resolução do processo infeccioso. Neste paciente os resultados de hemocultura foram negativos, não havendo associação com bacteremia neste caso.

A utilização de marcadores bioquímicos de infecção é frequente na prática médica, seja em pacientes com câncer, neutropenia e febre ou em pacientes sem essas características, para avaliação do grau de infecção99. A proteína C - reativa (PCR) é um dos marcadores mais utilizados, porém, inespecífico, pois encontra-se aumentada em casos de infecção e inflamação sistêmica, entretanto, é muito discutida sua utilização em pacientes com câncer, seja pela falta de isolamento de microrganismos em comparação com os resultados de PCR ou pela condição dos pacientes em tratamento quimioterápico. Em nosso estudo, nas amostras com isolamento bacteriano, os índices de PCR estiveram aumentados em relação aos casos negativos e com positividade para infecção viral (103 vs 12 mg/dl / p≥0,008). Entretanto, Loonen e colaboradores100 mostrou não haver diferença entre os resultados da concentração de CRP em pacientes com hemocultura positiva e negativa (105 versus 119 mg/L), neutropênicos com febre em tratamento quimioterápico.

Sugiura e colaboradores101 reportaram elevação dos níveis de CRP antes da instalação da neutropenia febril, sugerindo a presença de infecção subclínica ou outra forma de dano tecidual de característica infecciosa ou inflamatória, ou seja, a dosagem de CRP poderia ser fator preditivo da ocorrência de neutropenia febril nos pacientes portadores de doenças oncohematológicas101.

Há mais de 30 anos atrás, Pizzo e colaboradores publicaram um estudo com avaliação de mais de 1.000 casos de crianças e adolescentes com câncer e febre, sendo fungos e bactérias os principais microrganismos isolados nos casos com hemoculturas positivas31. Contudo, com o desenvolvimento de novos testes para a detecção dos vírus, através do diagnóstico molecular, a positividade para esses microrganismos atinge níveis de pelos menos 34% em pacientes com neutropenia febril, seja em tratamento quimioterápico ou após transplante de medula óssea102. Uma significativa morbidade e mortalidade foram atribuídas às

infecções virais em decorrência das características de alguns vírus de infecção primária, latência e reativação102.

O presente estudo revelou DNA viral em 39/58 (67,2%) das amostras coletadas. Esse resultado é superior ao encontrado por Benites et al75, com 52/104 (50%) e Torres et al95, com 477/1044 (46%). Entretanto é um resultado similar ao observado por Haeusler et al29, que detectou a presença de vírus em amostras de 75% dos pacientes em tratamento quimioterápico. Estes resultados estão apontando a necessidade da realização de exames de vigilância viral, além da realização de outros exames convencionais de pesquisa de fungos e bactérias em situações de neutropenia febril.

Neste estudo, dentre todos os vírus pesquisados, observamos que o HHV-7 foi o vírus mais detectado entre as amostras analisadas, seguido do HHV-6 e PvB19, demonstrando a importância da pesquisa desses vírus nos pacientes pediátricos portadores de doença oncohematológica65, 76_.

O herpesvírus tipo 7 (HHV-7) é conhecido causador de infecções exantemáticas em crianças, similar ao HHV-6, e neste estudo foi detectado em 24,1% dos episódios de neutropenia febril. Person et al68_{, que analisaram 20 episódios de neutropenia febril através de}

técnicas de sorologia, não detectou a presença de imunoglobulinas anti-HHV-7. O estudo do HHV-7 em pacientes pediátricos com câncer e neutropenia febril é pouco, por esse motivo não sabemos corretamente sua participação nesses casos de infecção. Nos casos detectados através da técnica de nested-PCR deste estudo, não foi realizada a quantificação viral, entretanto, a presença de HHV-7 em amostras de soro dos pacientes não foi associada a morbidade e mortalidade, sendo em média 5 dias de internação e nenhum óbito ocorreu com a presença do vírus. Não há ainda tratamento específico para o HHV-7.

O HHV-6 é um conhecido herpesvírus causador de infecção na primeira infância. Estima-se que 90% das crianças realizem soroconversão até os 2 anos de idade, sendo característico o HHV-6 permanecer em latência nas células das glândulas salivares e a saliva é a principal via de transmissão35, 44, 72.

Em nosso estudo, detectamos 20,7% de positividade para o HHV-6 nos episódios de neutropenia febril, resultado semelhante a outros estudos. Yee-Guardino et al41 e Hubeck et

al66 detectaram presença de DNA do HHV-6 em 29,1% e 18% em crianças com câncer, respectivamente. Entre os casos positivos para o HHV-6, sinais e sintomas de doença infecciosa foram observados em 7/12 (58,3%) dos pacientes. A presença de exantema súbito (roséola

infantum) foi observada em 5/7 (71,4%) comum na infecção primária pelo vírus e alterações

O PvB19 é um conhecido vírus causador de eritema infeccioso em crianças, podendo ter características de uma leve infecção, as vezes até subclínica, ou se apresentar com febre, lise de precursores eritróides, anemia e aplasia da linhagem eritróide103.

A pesquisa deste vírus por qPCR neste estudo revelou que os resultados foram similares aos encontrados por Jitschin et al78 para o PvB19, que detectou 22/110 (20%) dos pacientes. Detectamos a presença do DNA para PvB19 em 10/58 (17,2%) dos pacientes com neutropenia febril. A presença de sinais e sintomas de infecção respiratória foi encontrada em 6/10 (60%) dos casos positivos para PvB19 e não foi constatado presença de rash cutâneo, hepatoesplenomegalia e linfonodomegalias.

Entretanto, todos os pacientes com infecção respiratória possuíam concentração de hemoglobina abaixo dos níveis normais com mediana de 8,4 mg/dl e em 3 casos, a carga viral encontrava-se elevada para acima de 5.000 cópias/μL e o período de internação (mediana) foi de 10 dias, havendo necessidade de suspensão do protocolo de terapia antineoplásica por 12 dias.

Os pesquisadores Zaki e Ashray, em 2010, realizaram um estudo com 3 grupos de pacientes para a presença de infecção pelo PvB19 em pacientes pediátricos com leucemia: o grupo I continha pacientes em tratamento quimioterápico e teve positividade de 22,2% (DNA) em amostras de soro, resultado muito semelhante ao nosso estudo, entretanto, a técnica foi de PCR convencional e não realizou quantificação da carga viral dos pacientes. O segundo grupo (II) incluía pacientes com diagnóstico recente de leucemia e ainda não tinha sido iniciado o protocolo de quimioterapia. Nestes, a positividade foi de 45% (DNA) em amostras de soro e o terceiro grupo foram pacientes sem infecção pelo PvB19. A comparação entre os grupos de Zaki e Ashray com os resultados deste estudo e os valores de hemoglobina para o grupo I, II e III foram respectivamente (mediana) 8,5 mg/dl, 9,1 mg/dl e 10,7 mg/dl, frente a 8,4 mg/dl em nosso estudo. Entretanto, dentre os pacientes do grupo I, a presença de linfonodomegalia e hepatoesplenomegalia acometeu 70% dos casos positivos, resultado não observado em nosso estudo.

Em estudo realizado por Broliden104de 7 casos de infecção documentada para o PvB19 em crianças com câncer e tratamento quimioterápico, foi demonstrado infecção persistente e aplasia da linhagem eritróide, entretanto, neste estudo, não foi possível a demonstração da persistência de infecção pelo PvB19, visto que coletamos somente 1 amostra por paciente, não havendo seguimento dos casos. A literatura atual chama atenção para a presença de PvB19 em crianças e adolescentes com câncer, seja em tratamento ou ao diagnóstico, contudo, nenhum estudo relatou tratamento com antiviral.

O CMV é um Betaherpesvírus, conhecido causador de uma variedade de infecções em diversos tipos de populações, seja em pacientes neonatos (infecção congênita), mononucleose infecciosa em indivíduos em bom estado de saúde e infecção e reativação em pacientes imunodeprimidos, principalmente em pacientes após transplante de medula óssea69. A detecção do DNA do CMV em nosso estudo foi similar aos resultados encontrados em literatura. Han et al96 encontrou presença de DNA do CMV em 407/4382 (9,3%) dos pacientes em tratamento antineoplásico. Nosso estudo encontrou 6/58 (8,6%) de positividade de material genético para o CMV em pacientes com neutropenia febril, e a presença de sinais e sintomas de doença infecciosa associada à presença do material genético viral ocorreu em 3/6 (50%). Estes pacientes tiveram sinais e sintomas de infecção respiratória. Um dos mais prevalentes sintomas de infecção pelo CMV em pacientes imunodeprimidos são alterações gastrointestinais70, não observadas em nosso estudo.

Em estudo realizado por Ogata et al72 _{foi estudado o monitoramento da reativação}

viral do CMV antes e durante o tratamento antineoplásico, sendo encontrado positividade em plasma em 18/34 (50,6%) dos pacientes em até 100 dias após o início da terapia e considerado doença por CMV pacientes com carga viral acima de 100 cópias / μL em plasma. Segundo o estudo a presença superior a 1.000 cópias / μL foi característico de persistência de infecção pelo vírus com mediana de 42 dias de detecção do DNA em plasma acima de 100 cópias / μL e em 1/34 (3%) foi relacionado a presença de pneumonia e óbito por infecção pelo CMV. Em nosso estudo não relacionamos a detecção do DNA e carga viral para o CMV ao início da terapia ou ciclo antineoplásico. Contudo, todos os pacientes encontravam-se em tratamento (indução ou consolidação) e em um período menor que 120 dias do início do primeiro ciclo de terapia.

Durante o período deste estudo não tivemos óbito relacionado à infecção pelo CMV, mesmo com 3 casos relacionados à pneumonia e carga viral elevada.

Rahbarimanesh et al 2015105, realizaram um estudo em pacientes pediátricos com leucemia (LLA ou LMA), em vigência de quimioterapia, com diagnósticos e tratamento com antiviral para os casos positivos de CMV com presença de complicações clínicas e carga viral elevada (maior que 500 cópias / μL).

Foram detectados durante o estudo 11/172 (6,4%) de DNA de CMV em plasma e dentre os casos positivos 4 pacientes com complicações clínicas e elevada carga viral, e os pacientes foram tratados com valganciclovir (10 mg/kg), duas vezes ao dia, durante 6 semanas e reavaliação em duas semanas após o término da terapia antiviral com resolução do processo infeccioso em 100% dos pacientes, não ocorrendo óbito entre os casos estudados.

O poliomavírus humano (BKV), outro vírus comum em pacientes imunocomprometidos, está associado a graves complicações, como uretrite estenóide, nefropatia e cistite hemorrágica em pacientes submetidos a transplante renal e de medula óssea81. Poucos estudos relacionam o BKV a infecções em pacientes com câncer e neutropenia febril em tratamento quimioterápico, mesmo sendo estes vírus conhecidos por causar infecção primária na infância e permanecer em latência durante muitos anos nas células mononucleares do sangue periférico, epitélio urinário e células do endotélio vascular106.

Para o BKV, todas as amostras analisadas em nosso estudo não foram similares ao encontrado em literatura. Ohrmaln et al97 detectou presença de DNA para BKV em 12/52 (22%) dos casos, enquanto que em nosso estudo, somente 2/58 (3,4%) dos pacientes com neutropenia febril foram positivos para a presença do material genético desse vírus.

Apesar da diferença entre os resultados obtidos neste estudo e o encontrado por Ohrmaln et al, os sinais e sintomas detectados em ambos os estudos foram semelhantes e relacionados a alterações do sistema respiratório. Em estudo realizado por Pambrun et al 2014, foram avaliados 72 pacientes receptores de transplante renal adultos com desordens hematológicas (pancitopenia) e pesquisa do BKV em aspirado de medula óssea com positividade de 8/72 (11%), mostrando a importância do estudo desses vírus em pacientes imunodeprimidos. Em nosso estudo não foram realizados testes em aspirado de medula óssea, entretanto, em diversas fases do tratamento, os pacientes apresentaram pancitopenia, mesmo após longos períodos de ausência de quimioterapia, o que mostra também, a necessidade do monitoramento viral para os pacientes imunodeprimidos com câncer.

O EBV é conhecido como o causador de sintomas de mononucleose infecciosa em pacientes saudáveis na adolescência, e em adultos jovens, e foi associado ao surgimento de Linfoma de Burkitt em 1964, por Epstein et al.

Neste estudo, o DNA do EBV foi evidenciado em 2/58 (3,4%) amostras de soro dos pacientes em questão, sendo 1/58 (1,7%) com presença de sinais e sintomas de mononucleose infecciosa, como linfonodomegalias e alterações leucocitárias e hepáticas durante o episódio de neutropenia febril. Esses resultados são superiores ao encontrado em literatura, onde a presença de EBV foi relatado em apenas 2/610 (0,3%)71 e Lindblom et al98 1/90 (0,9%) em pacientes com neutropenia febril.

Não foram encontrados casos positivos para a presença de DNA do AdV no soro nos pacientes do estudo. Esses resultados são semelhantes aos encontrados em literatura, onde uma pequena quantidade de amostras de aspirado de nasofaringe foi positiva para a presença de DNA do AdV em pacientes com câncer. Torres et al95 _{detectou a presença de DNA do AdV}

em 13/404 (3,2%) dos pacientes, enquanto que Lindblom et al98 detectou DNA do AdV em 4/90 (4,4%) dos pacientes. Entretanto, apesar da baixa ocorrência do AdV em pacientes com neutropenia febril, a positividade está relacionada com o aumento do tempo de hospitalização de crianças e adolescentes com câncer e suspensão da terapia antineoplásica28, 37.

A presença de DNA de dois vírus na mesma amostra (coinfecção) foi detectada em 7/58 (12,1%) dos pacientes, onde 5/7 (71,4%) apresentaram alterações do sistema respiratório e 1/7 (14,3%) o paciente apresentou presença de exantema súbito (roséola infantum). Esses resultados foram semelhantes aos reportados por Lindblom et al98 9/90 (10%), entretanto, diferente ao encontrado por Benites et al75 e Torres et al95 que reportaram 7/104 (6,7%) e 66/756 (8,7%), respectivamente, para a presença de dois vírus durante o episódio de neutropenia febril.

Alterações do sistema respiratório foram os sintomas mais comuns da presença de coinfecção nesses estudos75, 95, 98. Para Koskevuo et al21 a coinfecção entre vírus respiratórios e bactérias em pacientes com LLA em vigência de quimioterapia foi detectada em 50% dos casos, com presença de DNA e hemocultura positiva. Já no estudo de Lindblom98_{, os casos de}

coinfecção entre vírus respiratórios e bactérias refletiram um longo período de internação em pacientes com neutropenia febril e câncer. Em nosso estudo não tivemos coinfecção entre os vírus pesquisados e bactérias.

A quantificação da carga viral, bacteriana e fúngica em crianças com câncer e neutropenia febril é pouco relatado na literatura, sendo discutido qual a relevância desses dados nos processos infecciosos9,12-13. Em nosso estudo, os vírus CMV, PvB19 e BKV foram quantificados através da técnica de qPCR e nos casos de infecção com presença de CMV e sinais de pneumonia verificado através do exame de radiografia de tórax, a carga viral estava aumentada. O paciente 36 tinha carga viral de 5.550 cópias / µL e positividade para o PvB19 que apresentou carga viral de 3.300 cópias / µL. O paciente 21, apresentou pneumonia e carga viral de 6.900 cópias / µL e o paciente 26, com positividade para o CMV e pneumonia, tinha carga viral de 7.255 cópias / µL.

Altas cargas virais podem direcionar para uma gravidade maior da doença associada ao vírus detectado e essa é a vantagem da quantificação através da PCR em Tempo Real quantitativa.

Testes moleculares utilizados durante a vigência do tratamento antineoplásico em pacientes com câncer e neutropenia febril se mostram importantes e cada dia mais promissores, principalmente com a implantação da PCR em Tempo Real quantitativa, que pode estimar a gravidade da infecção com a quantificação da carga viral e com isso, permitir a utilização de