FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
DANIEL THOME CATALAN
DETECÇÃO MOLECULAR DE INFECÇÕES VIRAIS EM
PACIENTES ONCOLÓGICOS PEDIÁTRICOS COM FEBRE E
NEUTROPENIA
CAMPINAS 2018
DETECÇÃO MOLECULAR DE INFECÇÕES VIRAIS EM
PACIENTES ONCOLÓGICOS PEDIÁTRICOS COM FEBRE E
NEUTROPENIA
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutor em Ciências na Área de Clínica Médica.
Orientadora: Profa. Dra. Sandra Helena Alves Bonon
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINALDA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO DANIEL THOME CATALAN, E ORIENTADO PELA PROFª DRA. SANDRA HELENA ALVES BONON.
Campinas 2018
ORIENTADOR: PROFA. DRA. SANDRA HELENA ALVES BONON
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. SANDRA CECÍLIA BOTELHO COSTA
2. PROF. DR. RICARDO MENDES PEREIRA
3. PROF. DR. EROS ANTONIO DE ALMEIDA
4. PROFA. DRA. CLAUDIA DE MOURA
5. PROF. DR. EDUARDO JOSÉ CALDEIRA
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Este estudo é dedicado a todas as crianças e adolescentes com câncer que lutam diariamente pela vida! Se através destes dados outros pesquisadores possam aprimorar as técnicas e ajudar a salvar uma única vida já valeu a pena cada esforço desde a montagem do projeto até a sua finalização.
Agradeço todo o conhecimento transmitido pela minha orientadora Profa. Dra. Sandra Helena Alves Bonon que esteve presente em todos os momentos nesses 4 anos de estudo. Agradeço a toda a minha família pelo apoio incondicional durante todos esses anos de estudo e em especial à minha esposa Caroline e filho Lucas parte integrante dessa luta diária entre trabalho e estudos, sem eles jamais teria conseguido.
Aos colegas do Laboratório de Virologia FCM/UNICAMP e do Laboratório de Análises Clínicas do GRENDACC pelo companheirismo e ajuda com este estudo.
neutropenia
Pacientes com câncer possuem longos períodos de neutropenia grave e são particularmente vulneráveis às infecções. Muitos episódios de neutropenia febril são tratados com antibióticos de amplo espectro, sem identificação do foco e microrganismo causador da infecção. Os testes moleculares, como a reação em cadeia da polimerase podem contribuir para a detecção de microrganismos causadores de infecção nessa população, otimizando os resultados e possibilitando aos médicos assistentes decidir sobre o tratamento. O objetivo principal deste estudo foi detectar a presença de material genético de vírus de maior ocorrência na população infantil em pacientes portadores de doença oncológica com neutropenia febril, como os herpesvírus Epstein Barr (EBV), Citomegalovírus (CMV), Herpesvírus 6 (HHV-6) e Herpesvírus 7 (HHV–7). Outros vírus pesquisados foram: Parvovírus B19 (PvB19), Poliomavírus (BKV) e o Adenovírus (AdV). Amostras de soro de pacientes de 3 a 14 anos foram avaliadas através de técnicas de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e de marcadores bioquímicos de infecção. Amostras de sangue total e urina também foram coletadas para a realização dos exames de cultura microbiológica, seguindo os protocolos internos dos hospitais. Foram incluídos 58 pacientes com neutropenia febril. Dentre as hemoculturas coletadas destes pacientes, 4/58 (7%) foram positivas e dentre as uroculturas, 1/58 (1,7%) foi positiva. Pela reação em cadeia da Polimerase tipo nested, os vírus HHV-6 e HHV-7 foram os mais detectados, com positividade em 12/58 (20,7%) e 14/58 (24,1%) amostras, respectivamente. Através da técnica da PCR em Tempo Real, o PvB19 foi positivo em 10/58 (17,2%), CMV em 6/58 (10,3%) e o BKV em 2/58 (3,4%). Coinfecção viral foi detectada em 7/58 (12,1%) amostras com associação a sintomas respiratórios em 5/7 (71,4%) pacientes. Os resultados de proteína C reativa tiveram maior concentração nas infecções bacterianas, com média de 113 mg/dL, enquanto que em infecções virais a média foi de 11 mg/dL, não foi fator preditivo para a detecção de infecções. As análises dos resultados obtidos através das técnicas de biologia molecular mostraram que em crianças e adolescentes com neutropenia febril a presença dos vírus detectados é comum e podem contribuir para o aumento da morbidade. Com a utilização da detecção molecular destas viroses, podem ocorrer consequências favoráveis como a diminuição dos gastos hospitalares e o aumento da eficácia da terapia.
Palavras-chave: neutropenia febril, câncer pediátrico, quimioterapia, febre de origem desconhecida.
Patients with malignancies have long periods of severe neutropenia and are particularly vulnerable to infectious complications. Most episodes of febrile neutropenia are treated with empiric broad-spectrum antibacterial therapy without identifying the site or causative agent of infection. Molecular tests with a polymerase chain reaction may contribute to detection of microorganisms that cause infection, optimizing the results and helping it possible for medical assistant’s decision about treatment. The aim of this study was to identify the genome of herpes virus Epstein Barr Virus (EBV), Cytomegalovirus (CMV), Human Herpes virus - 6 (HHV-6), Human Herpes virus - 7 (HHV-7), and others virus with Parvovirus B19 (PvB19), Polyomavirus (BKV), and Adenovirus (AdV). Serum samples of pediatric cancer patients of 3 to 14 years old were analyzed by Polymerase Chain Reaction (PCR) and for biochemistry marks of infectious disease. Whole blood and urine were collected for cultures were performed using an internal protocol. Fifty-eight cancer patients were included with fever and neutropenia. Among blood culture collected 4/58 (7%) were positive and 1/58 (1.7%) to urine culture was positive for this patients. For nested-PCR HHV-6 and HHV-7 were the most commonly detected viruses in 12/58 (20.7%) and 14/58 (24.1%) of samples, respectively. Through of real time PCR the PvB19 was positive in 10/58 (17.2%), CMV in 6/58 (10.3%) and BKV in 2/58 (3,4%). The presence of viral DNA of two or more microorganisms were observed in 7/58 (12.1%) and patients with respiratory diseases in 5/7 (71.4%). The C reaction protein (CRP) results had high concentration in bacterial infections with media oh 113 mg/dL. Although, viral infections had a media of 11 mg/dL, and were not a good predictive factor for detection of viral infections. The analyzed of these results checked through molecular methods showed that in children and young patients with febrile neutropenia the virus presence is common and may contribute for high incidence of morbidity. The utility of molecular detection of these viruses, favorable consequences to help such as the reduction of hospital expenses and the increase of the efficacy therapy.
Figura 1: Blastos de paciente portador de LLA 21
Figura 2: Blastos de paciente portador de LMA 21
Figura 3: Estrutura básica dos herpesvírus humano 29
Figura 4: Linfócito monocitóide e quatro linfócitos normais 30
Figura 5: Estrutura do citomegalovírus 31
Figura 6: Antibiograma laboratório de pesquisas microbiológicas do Instituto Oswaldo Cruz
38
Figura 7: Curva padrão de quantificação absoluta de uma reação de qPCR e resultados de amostras (CMV)
41
Figura 8: Paciente 36: Radiografia de pulmão com coinfecção por CMV e PvB19 57 Figura 9: Paciente 21: Radiografia de pulmão com infecção por CMV 57 Figura 10: Paciente 25: Radiografia de pulmão com infecção por CMV após
quimioterapia para tratamento de recidiva de LLA com DRM
58
pediátricos
Tabela 2: Principais fungos causadores infecção em pacientes oncológicos pediátricos
27
Tabela 3: Descrição dos primers da PCR convencional para detecção do AdV 46
Tabela 4: Descrição da técnica de PCR para detecção do AdV 46
Tabela 5: Sequência dos primers utilizados nas detecções dos vírus EBV, HHV-6 (A e B) e HHV-7 através da N-PCR
47
Tabela 6: Descrição da técnica de N-PCR para os vírus EBV, HHV-6 e HHV-7 48 Tabela 7: Sequência de primers da Beta-globina e localização no genoma
humano
49
Tabela 8: Reação de qPCR para detecção dos vírus CMV, PvB19 e BkV 50 Tabela 9: Características dos pacientes incluídos no estudo 52
Tabela 10: Alterações observadas nos pacientes 53
Tabela 11: Resultados dos testes complementares nos pacientes 54 Tabela 12: Concentração de CRP em pacientes com infecção bacteriana e viral 54 Tabela 13: Presença de DNA viral em pacientes com febre e neutropenia 55 Tabela 14: Presença de coinfecção nas amostras dos pacientes com neutropenia
febril
ºC Grau Celsius % Símbolo de porcentagem < Menor que > Maior que 5’ 3’ Sentido de transcrição µL Microlitro µg Micrograma ml Mililitro mm3 Milímetros cúbicos
ml/min Mililitros por minuto
nm Nanômetros
A Adenina
AdV Adenovírus humano
AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida ANVISA Agência nacional de vigilância sanitária
BkV Poliomavírus humano CD Cluster of differentiation CRS Célula de Reed-Sternberg CMV Citomegalovírus humano C Citosina Cópias/µL CRP
Cópias por microlitro Proteína C Reativa
DNA Ácido desoxirribonucleico
DH Doença de Hodgkin
DHL Desidrogenase lática
EBV Vírus Epstein-Barr
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay ou ensaio imunoenzimático
EPC Equipamento de proteção coletiva
EPI Equipamento de proteção individual
F Feminino
HHV-5 Herpesvírus humano 5 HHV-6 A Herpesvírus humano 6 tipo A HHV-6 B Herpesvírus humano 6 tipo B
HHV-7 Herpesvírus humano 7
H2O Fórmula química da água
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
Inv Inversão cromossômica
Kpb Quilobases
LH Linfoma de Hodgkin
LLA Leucemia linfóide aguda
LMA Leucemia mielóide aguda
LMA Leucemia mielóide aguda tipo M6
LMA Leucemia mielóide aguda tipo M7
LNH Linfoma não-Hodgkin
M Masculino
NK Célula natural killer
Nested-PCR (N-PCR) Reação em Cadeia da Polimerase tipo Nested
OMS Organização Mundial da Saúde
OS Osteossarcoma
pb Pares de bases
PBS Tampão fosfato salino
PCR Reação em cadeia da polimerase
PML/RAR Alteração genética na leucemia promielocítica aguda
p-value Valor de p
PvB19 Parvovírus B19
qPCR Reação em cadeia da polimerase em Tempo Real quantitativa
RX Radiografia
RNA Ácido ribonucleico
T Timina
t Translocação
Taq Thermus aquaticus
TGO (AST) Transaminase oxalacética TGP (ALT) Transaminase pirúvica
TMO Transplante de Medula Óssea
TP53 Gene supressor tumoral
Unicamp Universidade Estadual de Campinas
1. Introdução 17 2. Objetivos 18 2.1 Objetivos gerais 18 2.2 Objetivos específicos 18 3. Revisão de literatura 19 3.1 Câncer infantil 20 3.2 Tratamento do câncer 21 3.2.1 Quimioterapia 21
3.3 Intercorrências médicas no paciente pediátrico com câncer 22 3.3.1 Infecções em pacientes oncológicos pediátricos 24 3.3.2 Infecções bacterianas em pacientes com câncer 25 3.3.3 Infecções fúngicas em pacientes com câncer 26 3.3.4 Infecções virais em pacientes com câncer 27
3.3.4.1 Vírus da família Herpesviridae em pacientes pediátricos com episódios de febre
28
3.3.4.1.1 Herpesvírus humano 4 (Vírus Epstein Barr – EBV) 29 3.3.4.1.2 Herpesvírus humano 5 (Citomegalovírus – CMV) 30
3.3.4.1.3 Herpesvírus humano 6 (HHV-6) 31
3.3.4.1.4 Herpesvírus humano 7 (HHV-7) 32
3.3.4.2 Outros vírus causadores de infecções em crianças 33
3.3.4.2.1 Adenovírus humano (AdV) 33
3.3.4.2.2 Parvovírus B 19 (PvB19) 33
3.3.4.2.3 Poliomavírus humano (BkV) 34
3.4 Identificação de microrganismos através dos testes de hemocultura e urocultura
3.4.1.2 Hemocultura (HMC) 36
3.4.1.3 Antibiograma e antifungigrama 37
3.4.2 Técnicas moleculares para identificação de microrganismos causadores de infecção
38
3.4.2.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 38 3.4.2.2 Reação em Cadeia da Polimerase tipo Nested-PCR (N-PCR) 40 3.4.2.3 Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) 40 3.5 Testes complementares para avaliação da infecção 42
3.5.1 Hemograma completo 42 3.5.2 Proteína C reativa (CRP) 42 4. Casuística e Métodos 44 4.1 Pacientes 44 4.2 Definições 44 4.3 Critérios de inclusão 44 4.4 Critérios de exclusão 45 4.5 Amostras biológicas 45
4.6 Extração do material genético para análise 45
4.7 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para o Adenovírus humano 46 4.8 Reação em Cadeia da Polimerase tipo Nested (N-PCR) 47
4.8.1 Detecção do EBV, HHV-6 e HHV-7 47
4.9 Detecção dos fragmentos amplificados 48
4.10 Amplificação do gene da Beta – Globina (β-globina) 49 4.11 Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) 49
4.14 Biossegurança 51
5. Resultados 52
5.1 Resultados das hemoculturas e uroculturas 54
5.2 Resultados para os vírus estudados 55
5.2.1 Presença de coinfecção viral 55
6. Discussão 59
7. Conclusões 67
Referências bibliográficas 68
1. Introdução
As leucemias geralmente acometem crianças na primeira infância, sendo aproximadamente um terço dos casos de câncer nessa faixa etária1-3. Até meados da década de 1970 as neoplasias infantis eram em sua grande maioria fatais, entretanto com a introdução da quimioterapia e radioterapia a porcentagem de óbitos diminuiu progressivamente, passando de 25% para 75% a sobrevida dos pacientes assistidos por um protocolo com terapia intensiva e ajustada a grupos específicos de risco3-5.
Pacientes pediátricos portadores de doença oncohematológica possuem longos períodos de neutropenia em decorrência dos protocolos de tratamento utilizados com quimioterápicos e, em menor frequência a radioterapia e a cirurgia6. Devido ao alto risco de sepse nesses pacientes com episódios de febre, o protocolo para a neutropenia febril ainda utilizado é a administração de antibióticos de amplo espectro. Contudo, a geração de microrganismos multirresistentes aos antibióticos convencionais é frequente7-9.
Segundo estudos recentes até 25% dos casos de febre nesses pacientes são diagnosticados através dos métodos convencionais10. Durante a neutropenia os episódios de
febre são diagnosticados através da hemocultura, considerada padrão ouro, mas restrita a fungos e bactérias8. A mortalidade por infecções nos pacientes pediátricos portadores de neoplasias é relativamente baixa, frequentemente menor que 10%, mas variando de 3% a 17%, dependendo da condição imunológica do paciente, do agente etiológico e das condições de suporte à antibioticoterapia11-15. Muitos casos de sepse em pacientes oncológicos pediátricos são causados pela associação de neutropenia e bactérias Gram positivas, entretanto 60% a 80% dos casos ainda são tratados como febre de origem desconhecida16-19.
Os casos de febre provocados por agentes virais possuem baixa casuística na rotina laboratorial convencional, entretanto, a forma de transmissão viral em crianças e adolescentes é mais relevante do que fungos e bactérias20.
Dada a urgência na identificação dos microrganismos causadores da febre nesses pacientes, a busca pela utilização de testes de detecção molecular de agentes virais é necessária, com o objetivo de aumentar a sensibilidade e diminuir o tempo do diagnóstico, além de poder identificar mais microrganismos em um menor período de tempo, indicando inclusive a carga viral no organismo dos pacientes21-25. Por isso, resolveu-se avaliar as técnicas de PCR, nested PCR e PCR em tempo real para contribuir com a identificação dos vírus, aumentando a sensibilidade e diminuindo o tempo do diagnóstico proporcionando tratamento adequado26.
2. Objetivos
2.1 Objetivo geral:
Detectar a presença do material genético (DNA) dos herpesvírus Epstein Barr (EBV), Citomegalovírus (CMV), Herpesvírus Humano 6 6), Herpesvírus Humano 7 (HHV-7) e dos vírus Parvovírus B19 (PvB19), Poliomavírus (BKV) e Adenovírus (AdV) em amostras de soro de pacientes pediátricos oncológicos com episódios de febre e neutropenia pelas técnicas de Reação em Cadeia da Polimerase.
2.2 Objetivos específicos:
Avaliar a contribuição dos testes moleculares e dos testes de cultura de material biológico na identificação da etiologia da febre;
Comparar os resultados das técnicas moleculares e culturas com testes bioquímicos (Proteína C Reativa e Transaminases TGO/TGP).
3. Revisão de literatura
Os termos câncer, neoplasia, doença oncológica, neoplasma ou simplesmente tumor referem-se atualmente ao conjunto de doenças caracterizadas por alterações em nível de material genético de uma única célula de um tecido ou órgão. Entretanto, com a constante evolução do conhecimento das neoplasias sua definição modifica-se, sendo a mais aceita atualmente:
“Neoplasia é uma proliferação anormal do tecido, que foge parcial ou totalmente ao controle do organismo e tende à autonomia e à perpetuação, com efeitos agressivos ao hospedeiro” (Pérez-Tamayo, 1987; Robbins, 1984).
As alterações chamadas por muitos de mutação podem ser causadas por agentes químicos, físicos e biológicos encontrados no habitat natural dos seres humanos. A expectativa é que milhões de novos casos de câncer serão diagnosticados a cada ano em todo o mundo. A maior incidência acontece entre adultos de ambos os sexos principalmente entre os 40 e 79 anos de idade. Nesses indivíduos, os carcinomas são os principais tipos de neoplasias. Entre mulheres de 40 a 59 anos se os tumores de mama, já entre homens de 40 a 79 anos destacam-se os tumores de pulmão, próstata e brônquios1-5.
O câncer infantil pode ser considerado raro, acometendo cerca de 2% a 5% de todos os diagnósticos de câncer e difere em muitos parâmetros das neoplasias em adultos. Em crianças, as neoplasias podem acometer vários sítios primários com grande diversidade histológica, enquanto que no adulto prevalecem o câncer de mama, pulmão, brônquios e próstata. Na pediatria, a prevalência da neoplasia está em alterações de células embrionárias, sendo as leucemias, linfomas, neuroblastomas e tumor Wilms os mais incidentes. Atualmente na pediatria, as neoplasias são divididas em leucemias e tumores sólidos2.
As leucemias geralmente acometem crianças na primeira infância, sendo aproximadamente um terço dos casos de câncer nessa faixa etária. Até meados da década de 1970 as neoplasias infantis eram em sua grande maioria fatais, entretanto com a introdução da quimioterapia e radioterapia a porcentagem de óbitos diminuiu progressivamente, passando de 25% para 75% a sobrevida dos pacientes assistidos por um protocolo com terapia intensiva e ajustada a grupos específicos de risco3. A utilização de quimioterápicos e radioterapia trouxe benefícios ao tratamento do câncer pediátrico, contudo a susceptibilidade a infecções aumentou em decorrência da imunossupressão pela utilização dos medicamentos3, 4.
O risco de desenvolvimento de neutropenia é frequente e a maior limitação na administração de medicamentos quimioterápicos no tratamento do câncer. Foi descrita em estudo científico de Bodey et al, em 1966 quando pela primeira fez a associação entre administração de medicação quimioterápica foi relacionada à diminuição do número de células do sistema imunológico e consequente risco de febre e infecção. A neutropenia febril acontece em 40% dos casos já no primeiro ciclo de quimioterapia, é associada com significante risco de morbidade e com mortalidade variando de 0% a 3% em todos os tipos de neoplasias5.
A febre em geral é a primeira manifestação de infecção no paciente oncológico pediátrico e muitas vezes são persistentes durante vários dias. O agente etiológico ou o foco infeccioso da febre nas crianças com câncer é identificado em 30% a 40% dos episódios febris, através dos testes laboratoriais de rotina, como a hemocultura e urocultura. A incidência de bacteremia varia de 8,5% a 28% nos quadros de febre, dependendo da intensidade da quimioterapia, contagem global de leucócitos e diferencial de neutrófilos e monócitos principalmente5-7.
A mortalidade por infecções nos pacientes pediátricos portadores de neoplasias é frequentemente menor que 10%, mas variando de 3% a 17%, dependendo da condição imunológica do paciente, do agente etiológico e das condições de suporte à antibióticoterapia. Muitos casos de sepse em pacientes oncológicos pediátricos são causados pela associação de neutropenia e bactérias Gram positivas, entretanto 60% a 80% dos casos ainda são tratados como febre de origem desconhecida7-10.
3.1 Câncer infantil
Pela perspectiva clínica muito se debate sobre a faixa etária considerada como câncer infantil, mas muitos dados estatísticos e epidemiológicos sugerem que neoplasias pediátricas são doenças que ocorrem até os 15 anos de idade7. O câncer infantil acomete milhares de crianças todos os anos, estima-se que aproximadamente 2% a 5% de todos os tipos de neoplasias acometem crianças até 15 anos de idade. Cerca de 10% das mortes na primeira infância estão relacionadas ao câncer, sendo a segunda causa de morte dentro desta população4.
É certo que o câncer é uma doença genética, ou seja, células normais sofrem várias mutações genéticas até se tornarem células neoplásicas. As neoplasias na infância não são diferentes nesse aspecto, entretanto a proporção de novos casos de câncer na população pediátrica, com clara evidência de hereditariedade, é pequena. A hereditariedade nesses casos implica em alterações genéticas transmitidas pelos pais ou uma nova mutação que ocorreu no óvulo e/ou espermatozoide antes da fecundação9.
O câncer em pacientes pediátricos geralmente evolui para a cura chegando a 85% em alguns tipos de leucemias e 100% para alguns tipos de linfomas. As leucemias predominam na população infantil entre os 2 a 15 anos, seguido dos tumores de sistema nervoso central, como os neuroblastomas e tumores nos linfonodos chamados linfomas. Já entre os adolescentes os linfomas e leucemias predominam seguidos pelos tumores de partes moles, como o tumor de Wilms 11,12.
Até meados da década de 1940, aproximadamente, 5% das crianças com leucemia tinham obtenção de cura. Atualmente, combinações de drogas quimioterápicas, protocolos de tratamento em constante atualização, tratamento profilático do SNC e o escalonamento dos pacientes em grupos de risco com base em novos testes laboratoriais, elevaram significativamente a sobrevida no paciente pediátrico portador de leucemia. De 10% a 15% na década de 1960, para 80% em meados de 2000 e alcança níveis de até 90% em países em desenvolvimento13-16. Entretanto, a mielodepressão do sistema imunológico, decorrente do
tratamento e, pela própria doença, promovem leucopenia e neutropenia, causando altos índices de morbidade pediátrica nos portadores de LLA e LMA16.
As figuras a seguir mostram os blastos de um caso de LLA e outro de LMA:
Figura 1: Blastos de paciente portador de
LLA. (Fonte: Laboratório GRENDACC). Aumento x1000.
Figura 2: Blastos de paciente portador de
LMA. (Fonte: Laboratório GRENDACC). Aumento x1000.
3.2 Tratamento do câncer
O tratamento dos pacientes com câncer, de uma forma geral, é realizado através da administração de medicamentos quimioterápicos, radioterapia e cirurgia, seguindo protocolos estabelecidos por estudos prévios27.
3.2.1 Quimioterapia
Desde a introdução da quimioterapia a mais de 60 anos atrás, o prognóstico favorável dos pacientes com câncer aumentou drasticamente, muitos dos quais eram fatais e
sem possibilidade de cura. A sobrevida livre de doença em cinco anos para todos os tipos de câncer aumentou em 68%28.
O objetivo inicial do tratamento com drogas quimioterápicas é a remissão da neoplasia a níveis muito baixos. Os protocolos atuais utilizam vários tipos de quimioterápicos em conjunto para a obtenção da remissão da doença. Neste período, a concentração das drogas é muito elevada e é chamado de período de indução, com duração de aproximadamente 60 a 120 dias. As medicações do período de indução promovem a remissão do câncer na grande maioria dos casos, entretanto não são específicas somente para as células do tumor, acometendo também as células sadias, com toxicidade para as células eritróides, leucócitos e plaquetas. A diminuição dos leucócitos é responsável pelo surgimento de infecções com episódios de febre, frequentes no período de indução e consolidação25, 27-29.
Os protocolos atuais têm duração de aproximadamente dois anos variando conforme o tipo de neoplasia, toxicidade dos agentes quimioterápicos, episódios de febre e infecções. Estes protocolos são divididos em períodos ou fases, sendo: indução, consolidação
e manutenção. Dependendo do tipo de neoplasia, esses períodos podem ser intercalados com
fases de radioterapia e/ou cirurgia29.
Os períodos de indução e consolidação são aqueles com agentes quimioterápicos em maior concentração, na sua maioria administrados de forma endovenosa. É neste período que a toxicidade desses agentes pode causar febre e infecções devido à mielossupressão, muitas vezes com episódios de neutropenia febril28.
Na fase de manutenção as drogas são administradas por via intramuscular e em baixas concentrações, entretanto a leucometria permanece em índices abaixo dos valores considerados normais e com sua fisiologia alterada. Contudo, os episódios de febre e infecções são menores29.
3.3 Intercorrências médicas no paciente pediátrico com câncer
Estudos demonstram que a febre no paciente oncológico é frequente em decorrência da imunodepressão causada pelos agentes quimioterápicos, doença de base e exposição a agentes biológicos. Em instituições de saúde, durante os vários períodos de internação, 86% são hospitalizados devido aos episódios de febre30-35.
Os episódios de febre aliados à imunodepressão decorrente do uso de quimioterápicos ou radioterapia merecem atenção médica imediata. O risco aumentado de infecções, nestes casos, tem variabilidade conforme o tipo de deficiência ou tratamento ao qual
este paciente é submetido, mas nem sempre é possível a identificação do agente etiológico9. Metade dos episódios de febre o agente etiológico não é identificado, logo o consenso entre a maioria dos oncologistas é o tratamento com antibióticos de amplo espectro. Com base em estudos anteriores, os pacientes são classificados conforme o grau de risco para o desenvolvimento de infecção, principalmente com a análise do número de neutrófilos absolutos no sangue periférico, temperatura corpórea, fase da quimioterapia e outros episódios de febre com detecção de microrganismo36-39.
Os critérios de risco são listados no quadro abaixo:
Quadro 1. Classificação de risco nos episódios de febre
Pacientes com baixo risco de infecção:
- São pacientes com contagem absoluta de neutrófilos < 1.000 células/mm3 até 500 células/mm3 em períodos menores de 7 dias, sem sinais e sintomas de disfunção
renal e hepática.
Pacientes com alto risco de infecção:
- São pacientes com contagem absoluta de neutrófilos < 500 células/mm3 por um período superior a 7 dias, comprometimento renal e hepático;
- Pacientes com contagem absoluta de neutrófilos < 100 células/mm3, independente do período de neutropenia e comprometimento dos rins e fígado. Outros tipos de sinais e sintomas que aumentam o risco de infecção:
- Instabilidade hemodinâmica;
- Mucosite oral ou gastrointestinal com episódio de vômito e diarreia; - Disfunção gastrointestinal, causando enjoo, vômitos e diarreia; - Alterações do sistema nervoso central;
- Infecção de cateter venoso central; - Metástase pulmonar e hipoxemia;
- Recidiva tumoral com metástase hepática e pulmonar;
- Evidência de insuficiência hepática com aumento das transaminases > 5 vezes o valor normal;
- Evidência de insuficiência renal com aumento do clearence de creatinina > 30 ml/min.
Alguns estudos, como o realizado por Peack et al, 2007, sugerem o acompanhamento laboratorial dos pacientes neutropênicos, desde a detecção da neutropenia no exame de hemograma, independente da febre. Este estudo utilizou técnicas convencionais de detecção de microrganismos, encontrando 23/773 (3,0%) hemoculturas positivas em pacientes com neutropenia, sendo que, destes, 18 apresentaram febre após 1 ou 2 dias da detecção da neutropenia e a hemocultura também foi positiva no episódio de febre40.
3.3.1 Infecções em pacientes oncológicos pediátricos
A associação entre câncer, pacientes imunocomprometidos, morbidade e mortalidade relacionados à infecção estão bem estabelecidos na prática médica. As complicações infecciosas aumentam o risco de morte desses pacientes e podem comprometer os benefícios dos protocolos de terapia antineoplásicas32, 41-45.
Crianças com câncer possuem o comprometimento do sistema imunológico em decorrência da doença, bem como em virtude da terapia antineoplásica administrada para o tratamento da doença. É importante reconhecermos que existem variações na imunidade entre os pacientes, seja em relação à condição ou tipo de neoplasia ou terapia e consequentemente nos tipos de infecções às quais eles estão susceptíveis3,31.
Algumas doenças malignas como, o Linfoma de Hodgkin (LH) e Linfoma Não-Hodgkin (LNH) possuem alterações na resposta imune celular, predispondo esses pacientes às infecções virais tal qual as causadas por Herpes Simplex Vírus (HSV) e Varicela-Zoster Vírus (VZV), bem como às infecções fúngicas como a criptococose. Já pacientes portadores de leucemias agudas são mais susceptíveis à graves infecções por bactérias Gram negativas em decorrência da neutropenia grave46-49.
Logo, crianças portadoras de doenças oncológicas possuem risco de infecções graves e potencialmente fatais, seja pelo tipo de doença associada ou em decorrência do protocolo de terapia antineoplásica2. Ambas as condições promovem alterações de suma importância nas barreiras naturais do sistema imunológico para a prevenção de infecções, como pele, mucosas e células da resposta imune mediada por neutrófilos, monócitos e linfócitos32. As células do sistema retículo endotelial fagocitário parecem ter menor sensibilidade aos efeitos do tratamento antineoplásico, portanto estão menos comprometidas. Entretanto, o conjunto de alterações favorece o surgimento de infecções nessa população, sendo o primeiro sinal de risco os episódios de febre e neutropenia nesses pacientes13.
A neutropenia febril é uma complicação comum em pacientes submetidos aos protocolos de tratamentos antineoplásicos e a mais comum causa de hospitalização em crianças
com câncer29. O protocolo clínico para pacientes com neutropenia febril, em geral, envolve coletas de culturas para identificação de possíveis microrganismos, início imediato de antibiótico endovenoso de amplo espectro e internação hospitalar até a recuperação da contagem global dos neutrófilos30,35. Esta estratégia diminuiu drasticamente as taxas de mortalidade nesses pacientes. Entretanto, com o início imediato da terapia antimicrobiana de amplo espectro e em muitos casos sem a identificação do sítio da infecção, tão pouco do microrganismo pelo tempo de identificação através das culturas, a resistência às drogas antimicrobianas aumentou de forma exponencial50.
3.3.2 Infecções bacterianas em pacientes com câncer
Aproximadamente 10 a 20% dos pacientes portadores de câncer pediátrico com febre e neutropenia desenvolvem bacteremia após internação e realização de pelo menos um ciclo de quimioterapia29. Em pacientes sem uso de acesso venoso central, as infecções do
sistema respiratório representam 25% dos casos, sendo a de maior incidência, seguida das mucosites orais e anal 10%, infecções do trato gastrointestinal 10% e infecções do trato geniturinário em 10% dos casos, em pacientes pediátricos portadores de câncer, sendo que a manipulação incorreta do dispositivo venoso central ainda é a maior causa de sepse50.
As bactérias Gram negativas como Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e
Klebsiella pneumoniae ainda hoje são as mais frequentes isoladas nesses pacientes, bem como
associadas à resistência aos medicamentos antimicrobianos de amplo espectro e possuem índices elevados de morbidade e mortalidade, interrompendo por várias vezes o tratamento. Nos últimos anos vários estudos relatam a presença de infecções causadas por bactérias Gram
positivas. Entre elas o Sthaphylococcus aureus, Sthaphylococcus epidermidis, alguns Streptococcus do grupo alfa-hemolítico e os Enterococcus estão figurando entre os
microrganismos mais isolados em cultura52.
Os índices de morbidade e mortalidade são maiores em pacientes com isolamento e identificação de bactérias Gram negativas. Entretanto, pacientes com neutropenia maiores de 7 dias possuem risco de sepse por bactérias residentes da própria microbiota do paciente, entre elas as bactérias Gram positivas que, habitualmente, não estão relacionadas a infecção em pacientes não portadores de imunossupressão. Uma exceção entre os pacientes sem neutropenia prolongada estão as bactérias Gram positivas alfa-hemolíticas ou também conhecidas como
Estreptococos viridans. Esses microrganismos podem causar diminuição da pressão arterial,
com progressão para a síndrome do choque de Frank, caracterizada por alterações cardiorrespiratórias, pneumonia, alterações renais e do sistema nervoso central, podendo
evoluir para o choque séptico50-55.Os principais microrganismos bacterianos causadores de febre e infecção em pacientes com algum tipo de imunossupressão são listados na tabela 1, abaixo:
Tabela 1. Principais bactérias causadoras infecção em pacientes oncológicos pediátricos.
Bactérias Gram positivas Gram negativas
Staphylococcus spp Escherichia coli
Streptococcus spp Pseudomonas aeroginosa Enterococcus spp Kleibsiella spp
Corynebacterium spp Enterobacter spp Bacillus spp Serratia spp Clostridium spp Anaeróbios
Fonte: Freifeld AG, Walsh TJ, Pizzo TA, 199731.
Apesar dos recentes avanços no diagnóstico dos episódios de febre em pacientes portadores de neoplasias, somente em 10% a 30% dos casos de febre são identificados os microrganismos. Contudo, quando identificado o agente etiológico pelos métodos laboratoriais convencionais como a hemocultura e urocultura, de 85% a 90% dos casos são Gram positivas e Gram negativas54.
3.3.3 Infecções fúngicas em pacientes com câncer
Febre e infecções por fungos são menos frequentes em pacientes pediátricos portadores de neoplasias. Entretanto, estas infecções aparecem com maior incidência em pacientes com prolongada neutropenia (> 10 dias), recebendo altas doses de corticoides e durante a imunossupressão, após transplantes de órgãos sólidos e medula óssea52.
Os fungos podem causar infecções superficiais e profundas. As infecções superficiais acometem a pele, unha e cabelos. Contudo, em pacientes imunodeprimidos, as infecções superficiais subcutâneas da pele podem causar abscessos ou granulomas. As infecções fúngicas profundas podem cursar com fungemia, principalmente por fungos oportunistas como a Candida spp, Aspergillus e Criptococcus. Nestes pacientes existe risco considerável à vida e as infecções são caracterizadas por necrose tecidual, hemorragia e oclusão vascular53.
Os fungos normalmente isolados através das técnicas laboratoriais tradicionais são listados na Tabela 2, a seguir:
Tabela 2. Principais fungos causadores infecção em pacientes oncológicos pediátricos Fungos Candida spp Aspergillus spp Zygomycetes Fusarium spp Scedosporium spp Cryptococcus neoformans Pneumocystis jirovec
Fonte: Freifeld AG, Walsh TJ, Pizzo PA, 199731.
Através das técnicas tradicionais utilizadas na rotina laboratorial, um pequeno número de fungos é identificado, pois esses microrganismos possuem crescimento lento. Mas com a introdução das técnicas de automação das hemoculturas e biologia molecular um número maior desses microrganismos pode ser identificado em pacientes pediátricos portadores de doença oncológica, com febre e neutropenia prolongada, enquanto em outros tipos de pacientes a detecção foi menor55.
3.3.4 Infecções virais em pacientes com câncer
Os episódios de febre em pacientes com neutropenia são tratados como febre de origem desconhecida, em 40% a 70%. Os microrganismos identificados na rotina laboratorial pela hemocultura restringem-se a bactérias e fungos. O caso de febre provocado por vírus é pouco identificado na rotina laboratorial. Entretanto, a forma de transmissão e a patogênese dos vírus são muito mais fáceis de acometer crianças do que fungos e bactérias54-55.
Vírus respiratórios são transmitidos através de secreções e gotículas aéreas de forma que a transmissão entre indivíduos da mesma espécie é rápida e capaz de causar epidemias56. Outros vírus são caracterizados por causar infecções leves e assintomáticas em crianças com sistema imunológico em boas condições, como o Herpes simplex e a reativação pode ocorrer em pacientes imunodeprimidos, seja pela doença de base ou pela utilização de medicamentos imunossupressores. Esses e outros vírus das famílias Herpesviridae, Adenoviridae,
infância, e permanecer em estado de latência durante muitos anos após a primeira infecção, podendo causar reinfecções em pacientes imunodeprimidos, como as crianças portadoras de neoplasias. A infecção primária pelo Citomegalovírus, ou sua reativação, podem causar pneumonia, colite, hepatite, pancitopenia e febre em pacientes após quimioterapia antineoplásica ou transplantados57- 61.
3.3.4.1 Vírus da família Herpesviridae em pacientes pediátricos com episódios de febre
Diversos estudos sugerem que a participação dos vírus nos episódios de febre deve ser considerada. Os vírus da família Herpesviridae, como o Herpesvírus humano 4 (Vírus Epstein-Barr – EBV /HHV-4), Herpesvírus humano 5 (Citomegalovírus Humano – CMVH), Herpesvírus humano 6 (HHV-6), variante A e B e o Herpesvírus humano 7 (HHV-7), são conhecidos patógenos causadores de infecção em pacientes portadores da imunodeficiência humana adquirida e em pacientes submetidos a transplante. Entretanto, o estudo da participação desses vírus como agentes infecciosos em pacientes portadores de doenças oncológicas é pouco descrito na literatura59, 62.
Os vírus da família Herpesviridae possuem DNA como material genético envolto por um capsídeo icosaédrico e envelopado. São divididos em Alphaherpesvirus – Herpesvírus
tipos 1 e 2 (HHV-1 e HHV-2) e Vírus da Varicela-zoster (HHV-3); Betaherpesvirus – Citomegalovírus humano, Herpesvírus tipos 6 e 7 (CMVH, HHV-6 e HHV-7) e Gamaherpesvirus – Epstein-Barr vírus (EBV/HHV-4) e HHV-8. São considerados vírus
cosmopolitas, infectando todos os grupos raciais e não possui sazonalidade definida, ou seja, causa infecção durante todo ano. O homem é seu único hospedeiro, sendo altamente espécie-específico. Esses patógenos geralmente produzem infecções sem sinais e sintomas clínicos relevantes, acometendo principalmente crianças na primeira infância63-71.
Uma característica relevante dos Herpesvírus é a capacidade de permanecer em latência no organismo do hospedeiro infectado, reativando-se quando estes se encontram com o sistema imunológico comprometido, como nos casos de doenças oncológicas66.
As estruturas básicas comuns a todos os membros da família Herpesviridae são mostradas na figura 4 abaixo:
Figura 3. Estrutura básica dos herpesvírus. (Fonte: http://stdgen.northwestern.edu)
3.3.4.1.1 Herpesvírus humano 4 (Vírus Epstein-Barr – EBV)
O EBV foi descoberto em 1964 por Epstein e Barr, que lhe deram o nome. Foi identificado a partir da observação de vírions típicos dos Herpesvírus humanos numa biópsia em Linfoma de Burkitt do tipo africano. Desde então, está amplamente relacionado à mononucleose infecciosa em crianças menores de 5 anos e em adultos jovens, assim como no surgimento de alguns tipos de câncer. Apresenta uma vasta distribuição mundial e transmitem-se pela saliva, objetos contaminados (escova de dente, talheres, louça, etc.) ou através de transfusões de sangue64.
O EBV faz parte da subfamília dos herpesvírus denominada Gamaherpesviridae, gênero Epstein-Barr vírus. É composto por um capsídeo revestido por glicoproteínas tegumentares de adesão com aproximadamente 180nm de diâmetro no qual está inserido o material genético composto por DNA de 172 kpb de comprimento70.
O período de incubação pode variar de 30 dias a mais de 50 dias, dependendo do estado fisiológico do infectado. Normalmente acomete as glândulas da região cervical, e em indivíduos com perfeita saúde pode ser assintomática ou gerar a mononucleose, caracterizada pela presença de linfócitos atípicos com aspecto monocitóide ao exame de hemograma70. O leucograma pode estar normal ou ligeiramente aumentado em pacientes sem doença oncológica, entretanto, as características dessa infecção em pacientes oncológicos pediátricos sob tratamento com quimioterápicos ainda não estão bem estabelecidas64, 70.
Após a infecção, o EBV permanece latente no interior dos linfócitos B do sangue periférico, medula óssea, linfonodos e tecidos68. A representação do linfócito infectado pelo EBV em um caso de mononucleose infecciosa confirmada por sorologia positiva (IgM e IgG) está representado na Figura 5:
Figura 4: Linfócito monocitóide e quatro linfócitos normais. Fonte: Laboratório Grendacc. Aumento x1000.
3.3.4.1.2 Herpesvírus humano 5 (Citomegalovírus humano - CMV)
O CMV pertence à família Herpeviridae, subfamília Betaherpesviridae e gênero
Cytomegalovirus, sendo o maior tipo de herpesvírus, com tamanho médio de 200nm. A
partícula viral consiste de um capsídeo de 110nm de diâmetro composto por 162 capsômeros revestido por proteínas tegumentares e no interior se encontra o material genético (DNA), com aproximadamente 240 kpb60-62 A maioria das pessoas adultas em todo o mundo já foi infectada pelo Citomegalovírus humano (CMV)63.
As manifestações clínicas resultantes de uma infecção por CMV dependem da condição do sistema imunológico do indivíduo e do modo de contaminação do mesmo61. São geralmente infecções assintomáticas, adquiridas durante a primeira infância, que algumas vezes podem causar alteração na morfologia linfocitária promovendo uma infecção muito semelhante à mononucleose infecciosa, causada pelo EBV63. Diversos trabalhos foram realizados em relação à infecção primária e reativação do CMV em pacientes que realizaram transplante de medula óssea ou órgãos sólidos, sugerindo que o tratamento precoce mediado pela positivação dos testes diagnósticos de infecção ativa é válido para o controle da infecção e da doença associada, uma vez que a terapia universal com o medicamento específico utilizado pode causar neutropenia nos pacientes imunodeprimidos67.
Independentemente do modo de infecção, a criança libera na urina, grandes quantidades do CMV, durante longos períodos, constituindo uma fonte de disseminação. Em pacientes com doença oncológica, podem surgir complicações graves, como por exemplo, pneumonite intersticial60. A figura abaixo mostra as características morfológicas do CMV.
Linfócito normal Linfócito Atípico
Figura 5. Estrutura do citomegalovírus. Fonte: modificado de http://biografix.de/
3.3.4.1.3 Herpesvírus humano 6 (HHV-6)
Inicialmente denominado por Vírus Humano B – linfotrópico, o HHV-6 foi primeiramente isolado em pacientes portadores do vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) ou doença linfoproliferativas, por Salahuddin em 1986. A partícula viral possui entre 160nm e 200nm de tamanho, o DNA viral central está envolto por um capsídeo e uma estrutura tegumentar de revestimento, assim como os demais herpesvírus. O DNA é formado por um conjunto de genes de aproximadamente 159 kpb a 170 kpb de tamanho e possui sete genes em comum com os demais herpesvírus56-58.
Como a maioria dos herpesvírus, permanece no hospedeiro em períodos prolongados de latência no interior dos linfócitos B, monócitos e células das glândulas salivares que secretam em pequenas quantidades HHV-6 juntamente com a saliva, reativando-se em períodos de imunodepressão prolongada63. A frequente detecção do DNA do HHV-6 em saliva e tecido de glândulas salivares sugere que a saliva é um veículo de transmissão, tanto de mãe para filho, quanto de criança para criança. A detecção do DNA viral em cordão umbilical de recém-nascidos saudáveis e em ausência de imunoglobulinas M (IgM) no soro corroboram com a hipótese de transmissão intra-uterina65, 66.
O HHV-6 é um Betaherpesvirus com subgrupos A e B e está relacionado principalmente com roséola e exantema súbito, sendo denominada a primeira infecção que acomete crianças de até 3 anos de idade, mas geralmente ocorre no primeiro ano após o nascimento ou através da via transplacentária em um número menor de casos. Cerca de 100% dos indivíduos possuem sorologia positiva para o HHV-6 mundialmente, sendo que ainda não foi comprovada sua sazonalidade70. O subgrupo B é a variante frequentemente relacionada com
a infecção de indivíduos sadios e a variante A possui maior relação com pacientes imunodeprimidos, onde muitas vezes pode causar febre e complicações no sistema nervoso central como encefalite, principalmente em pacientes portadores do HIV. Já em pacientes com imunodepressão prolongada por doença oncológica a infecção ou reativação viral é responsável por sérias complicações infecciosas como mielodepressão, pneumonia, encefalopatias, hepatite e febre72.
3.3.4.1.4 Herpesvírus humano 7 (HHV-7)
O HHV-7 também é um membro da subfamília Betaherpesvirus, gênero
Herpesvírus humano 7 e suas características são semelhantes às do HHV-6. Foi isolado
primeiramente da saliva de indivíduos sadios e posteriormente em doentes com Síndrome da Fadiga Crônica na década de 9061.
Sua capacidade de causar doença com sinais e sintomas em indivíduos sem quaisquer alterações do sistema imunológico é a menor entre os herpesvírus. Algumas vezes pode causar o surgimento de roséolas, assim como no HHV-6, raramente causa febre, permanecendo os sinais por cerca de 6 dias. A primeira infecção aparece por volta dos 5 anos de idade, acometendo cerca de 95% da população pediátrica57-59. Após a infecção primária, ele permanece no hospedeiro em latência no interior dos linfócitos, podendo causar reativação e infecção em períodos de imunodepressão. Em pacientes imunocomprometidos, o HHV-7 está relacionado com a presença concomitante do CMV e/ou HHV-6 causando episódios de febre e infecção63.
A replicação viral do HHV-7 induz à perda do receptor CD4 na superfície celular. Estudos demonstram que o HHV-7 in vitro pode competir com o HIV (vírus da Imunodeficiência Humana Adquirida tipo 1), interferindo negativamente na replicação deste último, em cultura. Mas, in vivo, o efeito sobre a replicação do HIV-1 permanece incerto e merece investigação, principalmente em crianças com infecção primária pelo HHV-770.
A prevalência da infecção primária pelo HHV-7 na população em geral é alta, sendo de cerca de 5 infectados para cada 7 crianças (71%) segundo relatos de Tanaka e colaboradores. (1994)61. No Brasil, 93% dos indivíduos adultos e das crianças maiores de dez anos de idade apresentam anticorpos de classe IgG contra o HHV-7. A primeira infecção pelo HHV-7 incide em idades entre 5 e 6 anos de vida, um pouco mais tarde do que ocorre para o Herpesvírus Humano Tipo 6 (HHV-6), a qual ocorre aos 2 anos, aproximadamente65.
A transmissão horizontal do HHV-7 se dá, provavelmente, através da saliva. O índice de isolamento do HHV-7 a partir da saliva é muito alto, cerca de 75%70.
3.3.4.2 Outros vírus causadores de infecção em crianças 3.3.4.2.1 Adenovírus (AdV)
Descoberto em 1953 por Rowe e colaboradores, o Adenovírus (AdV) foi descrito como um agente degenerativo da adenoide. Adenovírus são membros do gênero
Mastadenovirus e da família Adenoviridae. São vírus não envelopados contendo uma dupla fita
linear de DNA. São agrupados em 7 espécies (AdV A – G) baseado em análises filogenéticas, organização do genoma, características de replicação e oncogenicidade. Dentro das 7 espécies existem mais de 70 sorotipos diferentes, sendo o tipo de tecido afetado determinante para as manifestações clínicas da infecção. O AdV pode causar infecção da conjuntiva (espécies B, D e E), infecção do trato respiratório (espécies B, C e E) e infecções do trato gastrointestinal (espécies F e G). Todas as espécies circulam globalmente podendo causar surtos de infecções em determinadas populações22, 74.
As infecções por AdV normalmente causam conjuntivite e infecções do trato respiratório com rara progressão para pneumonia e infecções sistêmicas em pacientes sem comprometimento do sistema imunológico. Entretanto, o agravamento com presença de síndrome da angústia respiratória aguda (SARA) possui taxa de mortalidade que varia de 27 a 45%. Infecções sistêmicas são comuns em pacientes imunodeprimidos com alto risco de vida, principalmente em crianças abaixo dos 5 anos de idade75.
A disseminação viral nesses pacientes pode estar relacionada à latência do AdV nas células linfoides tonsilares, podendo causar reativação e infecções persistentes. Nas infecções persistentes do trato gastrointestinal evidenciou-se presença do AdV em linfócitos do tecido intestinal em pacientes após transplante74.
3.3.4.2.2 Parvovírus B19 (PvB19)
O Parvovírus B19 Humano (PvB19) foi descoberto por Cossat e colaboradores na Inglaterra em 1975, e pertence à família Parvoviridae. É um vírus pequeno, de estrutura icosaédrica, não envelopado, com 15 a 28 nm de diâmetro. O material genético (DNA) possui tamanho extremamente limitado e fita simples com aproximadamente 5.500 nucleotídeos, representando aproximadamente 19 a 37% da massa total do nucleocapsídeo, ou seja, a partícula viral causadora de infecção é extremamente pequena76.
A transmissão viral acontece por fluídos respiratórios, bem como por sangue em pacientes com viremia, entretanto a replicação viral não acontece nas células epiteliais do trato
respiratório. O PvB19 replica-se preferencialmente nas células imaturas da linhagem eritróide, ocasionando aplasia transitória e em alguns casos com surgimento de anemia77.
A prevalência do PvB19 na população pediátrica é alta, aproximadamente 50% das crianças abaixo dos 15 anos possuem Imunoglobulina G (IgG) detectável para o vírus. A infecção pode ocorrer em adultos, também, onde 90% possuem níveis de IgG positivos. O PvB19 é sazonal com picos de maior transmissão no outono e inverno, entretanto não há registros, em literatura, de grandes epidemias pelo vírus nos meses de maior ocorrência de transmissão76.
Em estudo recente realizado com crianças e adolescentes com câncer, 45,6% dos pacientes possuíam níveis detectáveis de IgG para o diagnóstico da doença oncológica, sendo 19% destes com presença de DNA viral no soro. Existe uma preocupação médica em relação à possível infecção pelo PvB19 em crianças com câncer e doenças hematológicas em decorrência das repetidas transfusões sanguíneas. Entretanto, estudos recentes apontam para uma baixa incidência de infecções causadas pelo PvB19 após transfusões sanguíneas ou de outros tipos de hemocomponentes77-79.
Após a infecção primária o PvB19 permanece em latência em vários tipos de tecidos diferentes, incluindo medula óssea, pele e pulmão por tempo indeterminado. Entretanto, não há evidências em literatura da integração do DNA viral ao genoma humano78.
3.3.4.2.3 Poliomavírus humano (BkV)
A família Polyomaviridae está se expandindo com novos membros sendo detectados e novas espécies sendo descobertas continuamente. O Poliomavírus foi descoberto acidentalmente na década de 1950 por Gross sendo caracterizado como um agente transmissível causador de múltiplos tumores em roedores, principalmente em cobaias jovens e imunossuprimidas. O BkV possui morfologia e organização estrutural comuns, os vírions são de simetria icosaédrica, não envelopado com partículas virais entre 40 a 45 nm de diâmetro e um DNA circular de dupla fita. São 10 espécies causadoras de infecção em seres humanos, existindo homologia entre os nucleotídeos nas espécies entre 50 a 80%80.
Estudos recentes apontam para uma alta prevalência em seres humanos, sendo o contato inicial com o vírus comum na primeira infância, aumentando a soroprevalência com a idade. As crianças entre 5 e 9 anos possuem positividade detectável através da dosagem de IgG entre 65 a 90%. É comum a coinfecção de mais de uma espécie de poliomavírus em pacientes com algum tipo de alteração do sistema imunológico ou após transplante renal80-81.
A transmissão viral ocorre através do contato de pessoa para pessoa, superfícies contaminadas, comida e água. Após a primeira infecção o vírus persiste em latência nas células renais. Em pacientes imunossuprimidos são responsáveis por alta morbidade causando cistite hemorrágica e nefropatia em pacientes submetidos ao transplante renal e de medula óssea, principalmente81-82.
3.4 Identificação de microrganismos através dos testes de hemocultura e urocultura
A identificação de microrganismos em pacientes com suspeita de sepse passou por grandes transformações nos últimos anos. Entretanto, o custo dos novos testes moleculares e a necessidade de um ambiente específico para a realização dos testes ainda é o grande entrave para a implantação em todos os serviços de saúde. Por esse motivo a cultura de material biológico ainda é considerada padrão ouro para a identificação de microrganismos causadores de infecção sanguínea em pacientes hospitalizados83.
3.4.1 Cultura de material biológico
O diagnóstico laboratorial nos episódios de febre geralmente inicia-se pela coleta de hemocultura periférica, acesso venoso central (cateter) e urocultura quando indicado7. Lavado respiratório e coleta de fezes também podem ser realizadas quando se suspeita de infecção nesses locais9,10. Exames adicionais para avaliação da resposta à infecção também são coletados como hemograma, proteína C reativa, perfil hepático e renal12.
3.4.1.1 Urocultura (UROC)
As amostras de urina são enviadas para cultura quando existe a suspeita de infecção de trato urinário ou em pacientes assintomáticos com alto risco de infecção. As amostras podem ser coletadas de diferentes sítios infecciosos e formas, como urina de primeiro jato, de jato médio, de qualquer jato, urina de sonda vesical e através de punção suprapúbica84.
A metodologia tem por objetivo a pesquisa por inoculação em meios de cultura de microrganismos causadores de infecção em amostra de urina. Os agentes etiológicos que possuem maior relevância para a clínica médica, pois são conhecidos causadores de infecção, são as pertencentes à família Enterobbacteriaceae como a Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Proteus spp., Enterobacter spp. Já os microrganismos Gram positivos de
importância clínica são os Stafilococus, destacando-se o Staphylococcus saprophyticus e o
Enterococcus spp. A grande maioria das infecções do trato geniturinário é caracterizada pela
uroanálise juntamente com a UROC, quando existe a suspeita de infecção urinária. Entretanto, em alguns casos a contagem de leucócitos pode estar normal ou ligeiramente elevada31.
Após a coleta, a semeadura e incubação em meios de cultura deve ser realizada com a maior brevidade possível, preferencialmente em até 2 horas após a coleta em temperatura ambiente, exceto quando são utilizados conservantes nas amostras, como o ácido bórico. Nesses casos as amostras permanecem viáveis para cultura por um período de até 24 horas em temperatura ambiente. Em geral são necessários 10 mL de urina para a realização dos testes de uroanálise e UROC83.
Poucos estudos avaliaram a infecção urinária em pacientes com câncer e neutropenia, remetendo até 10% de positividade nessa população, incluindo pacientes com e sem sinais e sintomas de infecção84.
3.4.1.2 Hemocultura (HMC)
A hemocultura (HMC) ainda é considerada padrão-ouro no diagnóstico de infecções da corrente sanguínea e é baseada na detecção de microrganismos viáveis no sangue dos pacientes com suspeita de bacteremia ou sepse15. A acurácia na identificação dos
microrganismos isolados e a identificação do local da coleta da amostra são fundamentais para a obtenção de resultados de qualidade16-19.
As HMCs positivas possuem a vantagem de permitir a realização do antibiograma para testar a sensibilidade do microrganismo isolado para vários tipos de antibióticos, o que as técnicas moleculares não permitem17. Essa condição é muito importante. Vários estudos demonstram que a terapia antimicrobiana inadequada é um fator de risco para aumento da mortalidade ou falha na terapia, gerando quadros de sepse grave, principalmente em pacientes imunossuprimidos20. Um estudo recente com uma coorte de pacientes avaliados após quadro de choque séptico e hipotensão revelou que a cada hora de demora na administração dos antibióticos corretos está associada com o aumento de 8% no risco de vida12.
Apesar de todas essas vantagens, a HMC possui alguns fatores que podem diminuir sua sensibilidade. Vários protocolos recomendam a coleta de 2 ou 3 acessos venosos diferentes a cada suspeita de bacteremia, aspirando entre 20 a 30 ml de cada local e incubando em meios de cultivo para microrganismos aeróbios e anaeróbios15.
Um dos mais importantes fatores que influenciam no diagnóstico microbiológico pela HMC é o volume de sangue coletados. Foi demonstrado em alguns estudos que a sensibilidade do teste aumenta conforme o volume de sangue incubado nos meios de cultura. Isso é muito relevante em pacientes pediátricos, pois nem sempre conseguimos grandes
quantidades de sangue para cultura. Comprova-se pela literatura que mais de 50% das HMCs coletadas de crianças possuem volume menor de sangue do que o recomendado17.
Outro fator importante para a qualidade do diagnóstico é o tempo entre a coleta do sangue e a incubação das amostras a 35ºC ± 1ºC no equipamento. É adequado que todas as coletas de amostras para HMC sejam incubadas imediatamente para monitoramento contínuo, diminuição do tempo de crescimento e consequentemente diminuindo os casos de resultados falso-negativos. Alguns estudos demonstraram diminuição na positividade de amostras que permaneciam mais de 12 horas fora de incubação e quando foram pré-incubadas a 37ºC antes de serem acomodadas em equipamento automatizado18-20.
Microrganismos de crescimento lento também dificultam o diagnóstico através da HMC. Entre eles destacam-se a Bartenella spp., Francisella tullarensis, Mycoplasma spp., vários tipos de fungos e a Nocardia spp. Outros microrganismos que dificilmente são diagnosticas através da HMC são a Rickettsia spp., Coxiella burnetii, Chlamydophila
pneumoniae e Thopheryma whipplei. A melhor técnica para a identificação desses
microrganismos é o diagnóstico molecular31.
Além dos motivos apresentados anteriormente, o tempo para identificação do microrganismo, após a sinalização da positividade apontada pelo equipamento, também é uma desvantagem da HMC. Os equipamentos mais modernos realizam o monitoramento contínuo das amostras e a detecção de crescimento é realizada através de sensores para fluorimetria ou colorimétricos7-8.
Normalmente, os microrganismos crescem entre 12 a 24 horas após a incubação inicial nos equipamentos, sendo que após o alerta de positividade uma lâmina para coloração de Gram é feita diretamente do material incubado. O material é então semeado em outros meios de cultura para a realização dos testes bioquímicos de identificação onde, via de regra, essa análise é realizada entre 18 a 24 horas. Após os testes bioquímicos é realizado o teste de antibiograma para avaliar a sensibilidade do microrganismo aos antibióticos convencionais. Em geral o tempo entre a coleta e os resultados finais de HMC e antibiograma é de 5 a 6 dias, podendo aumentar quando detectamos a presença de microrganismos de crescimento lento7,8,
15-17.
3.4.1.3 Antibiograma e antifungigrama
Quando ocorrer crescimento bacteriano, tanto no teste de hemocultura como no teste de urocultura, a realização do teste de antibiograma ou antifungigrama se faz necessário para a identificação da sensibilidade bacteriana ou fúngica aos fármacos testados. São testadas
diversas classes de antibióticos e antifúngicos através técnica de difusão em disco contendo aos medicamentos a serem testados diretamente em meio de cultura semeado com a amostra positiva20. A presença de grandes halos ao redor dos discos contendo os fármacos testados representa sensibilidade da cepa ao antibiótico ou antifúngico, conforme mostrado na figura abaixo (Figura 6):
Figura 6. Antibiograma laboratório de pesquisas microbiológicas do Instituto Oswaldo Cruz,
RJ (2007).
3.4.2 Técnicas moleculares para identificação de microrganismos causadores de infecção
Quando a suspeita for de infecção, principalmente viral, a utilização de técnicas moleculares para identificação do material genético viral é indicada, pois, além do diagnóstico ser realizado em menor tempo, a sensibilidade e especificidade é mais elevada do que os testes tradicionais14. Os testes de cultura viral demoram muito tempo para um resultado de efeito citopático e são muito laboriosos.
As técnicas moleculares de reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional, Nested-PCR e PCR em tempo real, contribuem para a identificação de microrganismos causadores de infecção de forma rápida e diretamente a partir dos fluidos corporais, sem necessidade de cultivo viral em linhagens celulares10.
3.4.2.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A reação em cadeia da polimerase convencional é a metodologia de diagnóstico molecular mais empregada para a amplificação e detecção de material genético (DNA ou RNA) alvo em uma amostra biológica.22.
Com a introdução da amplificação de DNA através da reação em cadeia da polimerase (PCR), a detecção de microrganismos aumentou consideravelmente em amostras contendo pequena concentração de material genético viral. A amplificação gênica por meio da PCR permite a produção de grandes quantidades de fragmentos específicos de DNA ou RNA alvo a partir de substratos complexos e em baixas concentrações35.
Essa metodologia, também, permite a amplificação e detecção de RNA pela utilização de enzimas termoestáveis com a capacidade de realizar a transcriptase reversa, ou seja, inseriu uma etapa inicial anterior à amplificação do DNA alvo para transformar o RNA alvo em cDNA através de primers específicos e da enzima transcriptase reversa83.
Repetidos ciclos de síntese de DNA ou cDNA por meio da enzima Taq DNA polimerase e por, pelo menos dois primers com orientações opostas para a realização de uma cópia da sequência alvo84-86. Essa enzima permite o trabalho em altas temperaturas, otimizando a reação sem a necessidade da inclusão de enzima a cada ciclo do teste. Portanto, o exame consiste na cópia de uma determinada sequência do DNA viral através de vários ciclos de clonagem da mesma, aumentando o número de cópias do fragmento alvo muitas vezes mais do que se encontrava na amostra do paciente. Os primers com sua orientação oposta permitem que a síntese de DNA ocorra na região interna entre eles. Logo, o produto da extensão de um primer é utilizado como substrato para o outro em um novo ciclo da reação, o que resulta a cada novo ciclo na duplicação do DNA do ciclo anterior. Temos então, uma produção exponencial do número de cópias de um determinado fragmento alvo podendo chegar a ordem de 106 cópia de uma sequência a partir de uma simples molécula de DNA viral, por exemplo.
Em algum ponto, entretanto, a eficiência da amplificação diminui e eventualmente a quantidade de produto atinge uma fase de platô, seja devido à exaustão dos componentes da reação ou pela competição entre o anelamento dos primers e o produto da amplificação, isto é, a quantidade de cópias da sequência alvo é tão grande que pode acontecer o anelamento entre elas em vez de se anelarem com os primers85-87.
Após a amplificação do DNA ou cDNA as cópias podem ser detectadas por vários métodos diferentes. A metodologia mais utilizada é a simples eletroforese em gel de agarose a 2% corada com brometo de etídio ou outro corante intercalante, que permita a visualização da altura das bandas do produto final da reação através de luz UV83.
A PCR é um método rápido de realização após a extração do material genético das amostras biológicas, específico e extremamente sensível, porém, há resultados falso-positivos derivados da contaminação na execução dos testes. Resultados falso-negativos podem ser
