Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham.
Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham.
Virginia Medeiros de Siqueiraa*, Raphael Contib, Janete Magali de Araújoc,Cristina Maria Souza-Mottaa
a Departmento de Micologia, UFPE, 50670-901 Recife - PE, Brazil.
bDepartmento de Ciências Farmacêuticas, UFPE, 50670-901 Recife - PE, Brazil. c Departmento de Antibióticos, UFPE, 50670-901 Recife - PE, Brazil.
*e-mails: virginiamedeiros@hotmail.com virginiamedeiros_82@yahoo.com.br
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Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham.
Resumo
Fungos endofíticos foram isolados de tecidos sadios de Lippia sidoides, planta medicinal usada principalmente como anti-séptico no Nordeste Brasileiro. A partir de 240 fragmentos de folhas e 240 de caule foi isolado um total de 207 fungos endofíticos, representando 14 espécies pertencentes aos grupos Ascomycota, Coelomycetes e Hyphomycetes. A colonização endofítica foi maior nas folhas (52%) do que no caule (34,1%). Colletotrichum gloeosporiodes foi a espécie com maior freqüência de colonização (12,3%), seguida de Alternaria alternata (7,08%), Guignardia bidwelli (6,87%) e Phomopsis archeri (5,41%). Algumas espécies se mostraram específicas para determinado tecido do hospedeiro: Corynespora subcylindrica, Curvularia pallescens, Dreschlera dematioidea, G. bidwelli, Microascus desmosporum, Peacilomyces variotti, Periconia byssoides e Ulocladium oudemansii foram isolados apenas de folhas e Fusarium lateritium e Phoma tracheiphila foram isolados apenas de caule.
Introdução
O estabelecimento de plantas em seus respectivos habitats envolve sua capacidade de interagir com diferentes espécies de organismos. Os microrganismos interagem de formas distintas em diferentes áreas do vegetal, sendo denominados de endofíticos quando colonizam inter e/ou intracelularmente tecidos sadios da planta hospedeira, tipicamente sem causar sintomas de doença (Petrini, 1991; Azevedo et al. 2000). A relação entre o endofítico e seu hospedeiro é complexa e certamente muda conforme o hospedeiro e o microrganismo (Owen & Hundley 2004), sendo possível se estabelecer uma simbiose que varia desde o mutualismo até a fitopatogenia latente, passando pelo comensalismo e saprofitismo (Clay & Schardl 2002; Strobel & Dayse 2003; Kogel & Franken 2006).
Os primeiros estudos mostrando que os endófitos conferiam algumas vantagens ao seu hospedeiro, por exemplo, protegendo-o de insetos, patógenos e até mesmo de herbívoros domésticos, fizeram deles objetivo de pesquisas mais aprofundadas (Azevedo 1999; Azevedo et al. 2002). Recentemente, endofíticos são vistos como uma ótima fonte de novos produtos naturais bioativos úteis na agricultura, indústria e medicina, uma vez que estes microrganismos ocupam literalmente milhões de nichos ecológicos únicos crescendo em muitos ambientes muitas vezes incomuns (Schulz et al. 2002; Strobel & Dayse 2003; Strobel et al. 2004; Bandara et al. 2006). Muitos endofíticos isolados de plantas medicinais têm se mostrado produtores de metabólitos secundários com forte atividade fungicida e bactericida (Tan & Zou 2001; Gunatilaka 2006).
Investigações detalhadas da micobiota interna de plantas frequentemente descobrem novos taxa e revela novas distribuições das espécies já conhecidas. Pelo fato dos endofíticos serem incompiscuous, a diversidade de espécies da micobiota interna ser relativamente alta e uma pequena porção de potenciais hospedeiros terem sido até então examinados, endofíticos representam um número substancial de fungos ainda não descobertos (Arnold et al. 2000). Investigações de fungos endofíticos de vegetais bem caracterizados e economicamente importantes frequentemente revela novos taxa. Estudos sobre fungos endofíticos são necessários para fornecer informações fundamentais para a avaliação da diversidade e distribuição fúngica global (Stone et al. 2004).
O gênero Lippia pertence à família Verbenaceae e é constituído de aproximadamente duzentas espécies nativas da América do Sul, América Central e África (Lemos et al. 1990; Lacoste et al. 1996). Lippia sidoides Cham., popularmente conhecida como alecrim-pimenta, é um arbusto encontrado no nordeste Brasileiro, principalmente nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte. Baseado nas altas concentrações de timol e carvacrol, componentes do seu óleo essencial, e em muitos testes farmacológicos que vieram validar seu uso como planta medicinal, Lippia sidoides é utilizada na medicina tradicional para o tratamento de doenças infecciosas (Costa et al. 2002). O chá de folhas e flores é manuseado topicamente em ferimentos e queimaduras como agente anti- séptico e antiinflamatório (Matos & Oliveira 1998; Pascual 2001).
Os objetivos do presente estudo foram isolar fungos endofíticos de folhas e caule de
Lippia sidoides para determinar sua freqüência de colonização e fazer um levantamento
de sua distribuição nos diferentes tecidos do vegetal. Em pesquisas futuras, os resultados deste estudo poderão contribuir para a descoberta de novos compostos bioativos provavelmente derivados de fungos endofíticos desta planta medicinal.
Materiais e métodos Material vegetal
A coleta do material vegetal foi realizada na Estação Experimental da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA) em Carpina-PE, Brazil, em julho de 2006. O clima da região é tropical úmido com o período chuvoso de Fevereiro a Setembro. Folhas e caule de cinco indivíduos aparentemente sadios foram aleatoriamente coletados, etiquetados e colocados em sacos plásticos sob refrigeração. As amostras foram enviadas para o Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, Brasil e processadas em até 24h.
Isolamento de fungos endofíticos
Para eliminação de microrganismos epifíticos, o material vegetal foi submetido ao processo de esterilização superficial de acordo com Araújo et al. (2002a). Folhas e caules de L. sidoides foram lavados em água corrente, seguido de imersão em etanol 70% por 1 minuto, em hipoclorito de sódio (2 – 2,5% de cloro ativo) por 4 minutos, em etanol 70% por 30 segundos e lavados três vezes em água destilada e esterilizada. Após
esterilização superficial, as amostras foram cortadas em fragmentos de 0,5cm2 (folhas) e 0,5cm (caule) e transferidas assepticamente para placas de Petri contendo os meios de cultura Sabouraud Dextrose Agar (SAB, contendo (g/L): peptona 10, dextrose 10 e agar 15; pH 5.6) e Batata Dextrose Agar (BDA, contendo (g/L): batata 200, dextrose 20 e agar 15; pH 6.0) suplementados com tetraciclina (100µg/mL) e clorafenicol (100µg/mL) para suprimir o crescimento bacteriano. As placas de Petri foram incubadas a 30oC durante 30 dias, verificadas diariamente e qualquer colônia fúngica presente foi isolada, purificada e preservada em BDA para posterior identificação. O controle de eficiência de esterilização superficial foi confirmado pela inoculação da última água de lavagem em placas de Petri com o meio de cultura Triptona Soja Agar (TSA, contendo (g/L): peptona 5, triptona 5, sodium chlorite 15 e agar 15; pH 5.6). A freqüência de colonização (FC%) foi calculada como o número de isolados obtidos (Ni) pelo número total de fragmentos (Nf) x 100 (FC=Ni/Nf x 100) (Araújo et al. 2002a).
Identificação dos fungos endofíticos
A identificação foi realizada na Coleção de Culturas Micoteca-URM do Departamento de Micologia da UFPE, Recife, Brasil, observando-se características macroscópicas das colônias (cor, aspecto, consistência, presença de pigmento, etc.) e características microscópicas (morfologia de estruturas vegetativas e reprodutivas), utilizando literatura específica (Mason & Ellis 1953; Morton & Smith 1963; Booth 1971; Ellis 1971; Ellis 1976; Button 1980; Barnett & Hunter 1987; Hanlin 2000). Os meios de cultura BDA, SAB e Agar água foram utilizados e incubados a 28 ± 20C por até 30 dias. Após identificação os fungos foram depositados na Micoteca-URM do Departamento de Micologia (UFPE).
Resultados e discussão
De 480 fragmentos analisados (240 de folhas e 240 de caule) foram 207 fungos endofíticos, dando uma percentagem de colonização de 43,1%. Folhas e caule se diferenciaram quanto a sua colonização endofítica com 125 (52%) isolados obtidos de folhas e 82 (34,1%) obtidos de caule (Tabela 1). Estes isolados foram agrupados em 14 espécies pertencentes aos grupos Ascomycota, Coelomycetes e Hyphomycetes (Figura 1). Colletotrichum gloeosporioides foi a espécie mais isolada com freqüência de
colonização de 12,3%, seguida de Alternaria alternata com 7,08%, Guignardia bidwelli com 6,87% e Phomopsis archeri com 5,41%. Os isolados que não desenvolveram estruturas reprodutivas foram agrupados como Mycelia Sterilia. Estes dados estão de acordo com resultados sobre fungos endofíticos de outros hospedeiros nos quais geralmente um amplo grupo de espécies pode ser isolado de um dado vegetal, mas apenas algumas estão presentes em número significante (Petrini et al. 1992). Os gêneros Alternaria, Colletotrichum, Phomopsis e Guignardia são relatados na literatura como endofíticos com alta freqüência de colonização ocorrendo em diferentes tecidos vegetais (Larran et al. 2001; Larran et al. 2002; Hata et al. 2002; Santamaría & Bayman 2005; Chareprasert et al. 2006; Osono 2007; Verma et al. 2007; Lin et al. 2007).
Em adição a este grupo central de espécies consistentemente isoladas, investigações de fungos endofíticos invariavelmente geram longas listas de espécies acidentais. Cada espécie acidental frequentemente é representada por apenas um ou dois isolados dentre centenas (Bills & Pollishook 1992). A ocorrência de espécies acidentais também foi observada neste estudo: Alternaria tenuissima, Curvularia pallescens, Peacilomyces variotti, Periconia byssoides, Ulocladium oudemansii e foram isolados em pequeno número. Os gêneros Periconia e Drechslera segundo Verma et al. (2007) também ocorrem como endofíticos acidentais de Azadirachta indica. Periconia sp. endofítico de Torreya grandifolia é conhecido por produzir Taxol e o antibiótico periconicins (Li et al. 1998; Kim et al. 2004) enquanto que Drechslera gigantia por produzir o inseticida pestasol (Bunkes et al. 1991). Em geral, o número de espécies acidentais e raras é proporcional ao número de fragmentos utilizados (Petrini & Fisher 1986). Nossos resultados certamente indicam que o método de isolamento foi adequado e revelou espécies raras.
Os grupos de espécies se apresentam especificamente em cada tecido vegetal analisado (Figura 2). Por exemplo, Guignardia bidwellii ocorreu apenas de folhas, Phoma tracheiphila apenas de caule e Colletotrichum gloeosporioides e Alternaria alternata em ambos tecidos vegetais de Lippia sidoides. Petrini et al. (1992) concluiu que diferentes tecidos e órgãos vegetais podem de fato constituir distintos micro-habitats, sendo esta preferência um reflexo do conteúdo do tecido vegetal. Além disso, o habitat associado à planta é um ambiente dinâmico no qual muitos fatores como a espécie do hospedeiro, interação com outros endofíticos ou microrganismos patógenos (Araújo et al. 2001; Araújo et al., 2002b), características do local como elevação, exposição,
vegetação associada, tipo de tecido e idade do tecido (Roll & Roll 1979; Fisher et al. 1986; Fisher & Petrini 1990; Fisher et al. 1994; Rodrigues 1994) afetam a composição de espécies e a freqüência de colonização.
Em virtude do valor medicinal de Lippia sidoides, este vegetal foi selecionado para isolamento e identificação de sua micoflora endofítica. Com base na literatura, é possível que as características medicinais da planta sejam conseqüência da capacidade de seus endofíticos de produzir metabólitos secundários biologicamente ativos, como no caso do Taxol, anticancerígeno produzido por Taxus brevifolia e por seu endofíticos Taxomyces andreanea (Stierle et al. 1993). Os resultados deste trabalho mostram a importância relativa da preferência de tecido pelos endofíticos e sua diversidade, um importante passo para o entendimento das relações endofíticas com esta planta medicinal. Em trabalhos futuros, esperamos investigar a potencial produção de compostos antimicrobianos por estes fungos endofíticos.
Agradecimentos
Ao CNPq e ao Projeto Rede de Coleções de Culturas de Microrganismos do Norte e Nordeste do Brasil” (RENNEBRA).
Fungos endofíticos Folhas N % Caule N % Total N %
Alternaria alternata (Fr.) Keissl. 07 2,91 27 11,2 34 7,08
A. tenuissima (Kunze) Wiltshire 01 0,41 01 0,41 02 0,41
Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. 42 17,5 17 7,08 59 12,3
Corynespora subcylindrica nov. sp. 06 2,5 - 06 1,25
Curvularia pallencens Boedijn 01 0,41 - 01 0,20
Dreschlera dematioidea (Bubák & Wróbl.) Scharif 03 1,25 - 03 0,62
Fusarium lateritium Nees - 05 2,08 05 1,04
Guignardia bidwellii (Ellis) Viala & Ravaz 33 13,7 - 33 6,87
Microascus desmosporum (Lechmere) Curzi 02 0,83 - 02 0,41
Peacilomyces variotti Bainier 01 0,41 - 01 0,20
Periconia byssoides Pers. 02 0,83 - 02 0,41
Phoma tracheiphila (Petri) L.A. Kantsch. & Gikaschvili - 08 3,3 08 1,66
Phomopsis archeri B. Sutton (1980) 10 4,16 16 6,6 26 5,41
Ulocladium oudemansii E.G. Simmons 01 0,41 - 01 0,20
Mycelia Sterilia 16 6,6 08 3,3 24 5,0
Total 125 52,0 82 34,1 207 43,1
Tabela 1. Número de fungos endofíticos isolados de cada tecido de Lippia sidoides e sua freqüência de colonização.
N: número
%: freqüência de colonização - : não isolado
1 Alternaria alternata 2 A. tenuissima 3 Colletotrichum gloeosporioides 4 Corynespora subcylindrica 5 Curvularia pallencens 6 Dreschlera dematioidea 7 Fusarium lateritium 8 Guignardia bidwelli 9 Microascus desmosporum 10 Peacilomyces variotti 11 Periconia byssoides 12 Phoma tracheiphila 13 Phomopsis archeri 14 Ulocladium oudemansii 15 Mycelia Sterilia Número de f ungo s isolados
Figura 2. Diferenças em número e especificidade de fungos endofíticos de Lippia sidoides nos tecidos vegetais
Folhas Caule 0 5 10 15 20 25 30
Coelomycetes Hyphomycetes Ascomycetes Mycelia Sterilia
Folha FolhaCaule Caule Folha Caule Folha Caule
% Isolados obtidos
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