Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham. e avaliação da atividade antimicrobiana

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS. Virgínia Medeiros de Siqueira. Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham. e avaliação da atividade antimicrobiana. Recife-PE 2008.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS. Virgínia Medeiros de Siqueira. Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham. e avaliação da atividade antimicrobiana. Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Biologia de Fungos do Departamento de Micologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco em cumprimento da exigência para obtenção do grau de Mestre em Biologia de Fungos.. Orientadora: Profa Dra Cristina Maria Souza Motta Co-orientadora: Profa Dra Janete Magali de Araújo Recife-PE 2008.

(3) Siqueira, Virgínia Medeiros de Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham. e avaliação da atividade antimicrobiana./ Virgínia Medeiros de Siqueira. – Recife: A Autora, 2008. 94 fls. .: il. Dissertação (Mestrado: Biologia de Fungos) – UFPE. CCB 1.Fungos endofíticos 2.Lippia sidoides 3.Atividade antimicrobiana I.Título 582.28 579. CDU (2ª. Ed.) CDD (22ª. Ed.). UFPE CCB – 2008 – 06.

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(5) O objetivo da vida não é ser feliz. É ser útil, honrado, compassivo, fazendo com que nossa vida, bem vivida, faça alguma diferença.. Dedico à Kátia, Érika e Murilo..

(6) AGRADECIMENTOS À minha mãe, Kátia Maria Medeiros de Siqueira, por ser amorosa, honesta, serena e compreensiva. É meu porto seguro e minha referência de vida. Obrigada pelo amor, mimos, confiança e compreensão. Ao meu pai, Raimundo Nonato, por sempre me incentivar a estudar. Aos meus irmãos, Érika e Murilo, pela amizade, pelos momentos de descontração e pelo apoio em todas as horas. Em especial para Érika, além de irmã, uma verdadeira amiga. Quando temos irmãos ao nosso lado, tudo fica mais fácil. À minha avó Gilda Medeiros de Albuquerque (in memorian) pelo acolhimento cheio de mimos e preocupações desde minha chegada em Recife e à minha tia Magnólia Medeiros (in memorian), ser humano de alma superior e de coração único. Obrigada pelos momentos de suas vidas dedicados a mim. A Bidu (in memorian) e Nzinga, pelo amor incondicional indispensável ao meu bem estar. À professora Dra. Cristina Maria Souza Motta, minha orientadora, pelos conhecimentos transmitidos e pela confiança depositada em mim. À professora Dra. Janete Magali, minha co-orientadora, pelos conhecimentos transmitidos e pelo acolhimento sem restrições no Departamento de Antibióticos. Às professoras Débora Maria Massa Lima e Maria José dos Santos Fernandes, pela colaboração na identificação de muitos dos meus fungos isolados. Ao professor Dr. Uwe Braun, da Universidade Martin Luther, Alemanha, pela coautoria de um dos artigos que compõe esta dissertação. Obrigada pela sua colaboração e disponibilidade. Às minha amigas, Ludmila Lima, Evanilza Moura, Ana Josephina, Lucimary Araújo e Pamela Simoa, pelos grandes momentos de amizade vividos juntos, desde nossa infância até os tempos de hoje. A nossa verdadeira amizade eternizou o amor que tenho por vocês. À Judith Advíncula e Alexandra Muniz, pelos conselhos, pelos momentos de estudos e pelas muitas alegrias compartilhadas. A todos os meus colegas do X Curso de Especialização em Micologia, onde dei início aos meus estudos micológicos, pelos ótimos momentos, aulas, trabalhos e seminários. Nesta turma não havia lugar para vaidade ou competição e sim para algo precioso: a simplicidade. Como foi bom conviver com vocês. À Adriana, Ivana e Raphael, um muito obrigado pelo apoio dado em todos os momentos. A companhia de vocês foi essencial para a mim. Vocês são tão especiais que se tornaram minha segunda família, além de serem amigos extraordinários. Obrigado também a todos os meus colegas do Departamento de Antibióticos: a disposição que cada um tem de ajudar o outro é uma riqueza única. Ao CNPq, pela bolsa de estudos concedida durante os dois anos dos meus estudos e pelo apoio financeiro essencial para a realização deste trabalho através do projeto RENNEBRA. A todos que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho..

(7) Toda a nossa ciência, comparada com a realidade, é primitiva e infantil – e, no entanto, é a coisa mais preciosa que temos..

(8) Albert Einstein (1879-1955) RESUMO Fungos endofíticos vivem por todo ou uma parte do seu ciclo de vida no interior de tecidos vegetais, sem causar sintomas de doença. Desde que foram devidamente estudados despertaram grande interesse biotecnológico em virtude da aplicabilidade de seus metabólitos secundários na medicina, indústria e agricultura. Lippia sidoides Cham,. planta medicinal popularmente conhecida como alecrim-pimenta, é encontrada no Nordeste brasileiro e utilizada principalmente como antisséptico. Folhas e caule foram superficialmente desinfectados e fragmentados. Os fragmentos dos tecidos vegetais foram distribuídos na superfície dos meios Batata dextrose agar e Sabouraud agar acrescidos de tetraciclina e cloranfenicol (100µL/mL) contidos em placas de Petri e cultivados a 30o C por até 30 dias. Todos os isolados foram submetidos ao ensaio antimicrobiano primário em meio sólido (bloco de gelose) e aqueles que se mostraram ativos a algum microrganismo teste foram então submetidos ao teste de atividade microbiana em meio líquido (fermentação). Os microrganismos teste utilizados foram Staphylococcus aureus (ATCC-6538), Bacillus subtilis (UFPEDA-16), Escherichia coli (ATCC-25922), Klebsiella pneumoniae (ATCC29665), Pseudomonas aeruginosa (ATCC-27853), Candida albicans (UFPEDA-1007), Malassezia furfur (URM-5436) e Trichophyton rubrum (URM-4350). Um total de 207 fungos endofíticos pertencentes a quatorze espécies foram isolados: 125 (52%) de folhas e 82 (34,1%) de caule. Colletotrichum gloeosporioides foi a espécie mais freqüente, seguida de Alternaria alternata, Guignardia bidwelli e Phomopsis archeri. No bloco de gelose, 8% (16) se mostraram ativos a pelo menos um dos microrganismos teste. Destes, 10 apresentaram atividade nos ensaios em meio líquido, com os melhores halos de inibição de 25mm, 18mm e 13mm contra S. aureus, B. subtillis e K. pneumonie, respectivamente. Palavras-chave: Fungos endofíticos; Diversidade; Atividade antimicrobiana; Lippia sidoides.

(9) ABSTRACT Endophytic fungi colonize healthy living tissue of the host plant, typically causing no apparent symptoms of disease. Since they were truly studied they called great attention to the biotechnological interesting because of the applicability of they secondary metabolites in medicine, industry and agricultural. Lippia sidoides Cham., a medicinal plant popularly known as “alecrim-pimenta”, is founded at Brazilian northeast and used mostly as antiseptic. Leaves and stem were superficially disinfected and fragmented. The fragments were placed on the surface of the media Potato dextrose agar and Sabouraud agar supplemented with tetraciclin (100µg/mL) and chloramphenicol (100µg/mL) on Petri dishes and cultivated at 30o C up to 30 days. All the strains were submitted to the agar plug screening assay (“bloco de gelose”) and those who showed antimicrobial activity were submitted to the fermentation assay. The microorganisms test were Staphylococcus aureus (ATCC-6538), Bacillus subtilis (UFPEDA-16), Escherichia coli (ATCC-25922), Klebsiella pneumoniae (ATCC-29665), Pseudomonas aeruginosa (ATCC-27853), Candida albicans (UFPEDA-1007), Malassezia furfur (URM-5436) and Trichophyton rubrum (URM-4350). A total of 207 endophytic fungi were isolated, 125 (52%) from leaves and 82 (34,1%) from stem, belonging to fourteen species. Colletotrichum gloeosporioides was the mostly frequently specie, fallowed by Alternaria alternata, Guignardia bidwelli and Phomopsis archeri. At the agar plug screening assay, 8% (16) endophytic fungi showed antimicrobial activity to at least one microorganism test. From these, ten showed antimicrobial activity during the fermentation. The bests inhibition zone were 25mm, 18mm e 13mm against S. aureus, B. subtillis e K. pneumonie, respectively. Keywords: Endophytic fungi; diversity, antimicrobial activity; Lippia sidoides..

(10) LISTA DE FIGURAS Figura 1.. Equilíbrio antagônico entre virulência fúngica e defesa da planta. Adaptado de SCHULZ et al. 2002.. 05. Pág..

(11) Figura 2.. Cryptocandin A e Criptocin (LI et al. 2000).. 12. Figura 3.. Colletotric Acid (ZOU et al. 2000).. 13. Figura 4.. 2,4-diidroxi-5,6-dimetil benzoato de etila e phomopsilactona (SILVA et al. 2005).. 13. Figura 5.. Brefeldin A (WANG et al. 2006).. 14. Figura 6.. Planta medicinal Lippia sidoides Cham.. 16. Figura 7.. Estrutura Química do Carvacrol (A) e Timol (B) (COSTA et al. 2001).. 16. Primeiro Capítulo: Fungos Endofíticos de Folhas e Caule de Lippia sidoides Cham. Figura 1.. Percentagem de fungos endofíticos de diferentes grupos.. 37. Figura 2. Diferenças em número e especificidade de fungos endofíticos de Lippia sidoides nos tecidos vegetais. 37. Terceiro Capítulo: Corynespora subcylindrica sp. nov. – uma nova espécie de Hyphomycete do Brasil e uma discussão sobre a taxonomia de gêneros “corynesporalike” Corynespora subcylindrica sp. nov. – Cultura em BDA (Diâmetro da 71 Figura 1. placa de Petri: 90mm). Figura 2.. Corynespora subcylindrica sp. nov. Conidióforo surgindo lateralmente de uma hifa em cultura em BDA, com conídio primário (conídio secundário da cadeia já formado). – Bar = 10 µm.. 71. Figura 3.. Corynespora subcylindrica sp. nov. – A. Hifa. – B. conidioforos. – C. célula conidiogência com proliferação percorrente. – D. conídio. – Bar = 10 µm.. 72. LISTA DE TABELAS Pág. Tabela 1.. Número de espécies endofíticas isoladas de vários hospedeiros mundialmente distribuídos (Adaptado de Stone et al. 2004). 07.

(12) Tabela 2.. Fungos endofíticos freqüentes e acidentais de diferentes hospedeiros.. 08. Primeiro Capítulo: Fungos Endofíticos de Folhas e Caule de Lippia sidoides Cham. Tabela 1.. Número (N) de fungos endofíticos isolados de cada tecido de Lippia sidoides e sua freqüência de colonização (%).. 36. Segundo Capítulo: Potencial antimicrobiano de fungos endofíticos da planta medicinal Lippia sidoides Cham. Tabela 1.. Screening de atividade antimicrobiana de fungos endofíticos. 56. Tabeça 2.. Atividade antimicrobiana do líquido fermentativo de fungos endofíticos. 57. SUMÁRIO Pág. 1. INTRODUÇÃO GERAL 1.1 Introdução. 01 02.

(13) 1.2 Fungos Endofíticos. 03. 1.3 Diversidade e Especificidade de Fungos Endofíticos. 06. 1.4 Importância dos Fungos Endofíticos. 09. 1.5 Antimicrobianos Produzidos por Fungos. 11. 1.5.1 Antibióticos Produzidos por Fungos Endofíticos. 12. 1.5.1.1 Cryptocandin A e Cryptocin. 12. 1.5.5.2 Colletotric Acid. 13. 1.5.5.3 2,4-diidroxi-5,6-dimetil benzoato de etila e Phomopsilactona. 13. 1.5.5.4 Brefeldin A. 14. 1.6 Lippia sidoides Cham.. 15. 3. REFERÊNCIAS. 17. 4. PRIMEIRO CAPÍTULO. 27. 4.1 Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham. 5. SEGUNDO CAPÍTULO. 27 44. 5.1 Potencial Antimicrobiano de Fungos Endofíticos da Planta Medicinal Lippia sidoides Cham. 6. TERCEIRO CAPÍTULO. 45 58. 6.1 Corynespora subcylindrica sp. nov. – uma nova espécie de Hyphomycete do Brasil e uma discussão sobre a taxonomia de gêneros “corynespora-like” 7. CONCLUSÕES 7.1 Conclusões gerais 8. ANEXOS. 59 77 78 79.

(14) 1. INTRODUÇÃO GERAL.

(15) 2. 1.1 Introdução O estabelecimento de plantas em seus respectivos habitats envolve a sua capacidade de interagir com variadas espécies de organismos. Os microrganismos interagem de maneiras distintas em diferentes áreas do vegetal, sendo denominados de endofíticos quando colonizam intra e/ou intercelularmente tecidos sadios de plantas em algum tempo do seu ciclo de vida, sem causar danos aparentes ao seu hospedeiro (PETRINI, 1991; AZEVEDO et al., 2000). Todo vegetal estudado quanto a sua microbiota se mostrou hospedeiro de endofíticos, mas poucas das 300.000 espécies de plantas existentes no Planeta foram até então analisadas. Como resultado, a oportunidade de encontrar novos microrganismos e estes serem produtores de compostos bioativos úteis para indústria, agricultura e medicina vem aumentando a bioprospecção desta micobiota de grande importância para biotecnologia (STROBEL, 2002; STROBEL et al., 2004). A descoberta de novos antibióticos se faz necessária devido ao aparecimento de patógenos resistentes, bem como à evolução de novas doenças como a AIDS e à toxicidade de alguns produtos que já estão no mercado. Considerando-se que seis entre vinte dos medicamentos mais comumente prescritos são de origem fúngica e que, em comparação com fungos obtidos de outros substratos, relativamente poucos metabólitos têm sido isolados de endofíticos, estes oferecem um potencial para desenvolvimento de novos produtos (Schultz et al. 2002). Os microrganismos endofíticos representam uma importante fonte para a produção de metabólitos secundários com ação antibacteriana, antifúngica, antitumoral, dentre outras (TAN; ZOU, 2001; STROBEL; DAYSE, 2003; WIYAKRUTTA et al., 2004; GUNATILAKA, 2006). Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae), popularmente conhecida como alecrimpimenta, é um arbusto encontrado no sertão nordestino. A exemplo de outras espécies do gênero, esta é uma planta aromática, de uso medicinal popular, principalmente como antiséptico, havendo sido introduzida há pouco tempo nos programas de fitoterapia e nas práticas caseiras como fármaco fitoterápico (COSTA et al., 2002). Esse caráter medicinal fundamenta a investigação de fungos endofíticos envolvidos na produção de compostos bioativos que apresentam atividade antagônica contra bactérias e fungos patogênicos ao homem..

(16) 3. 1.2 Fungos Endofíticos Microrganismos endofíticos, em sua maioria bactérias e fungos, são aqueles que passam todo ou uma parte do seu ciclo de vida colonizando inter e/ou intracelularmente os tecidos da planta hospedeira, tipicamente sem causar sintomas aparentes de doença (PETRINI, 1991; CABRAL et al., 1993; BANCON; WHITE, 2000; TAN; ZOU, 2001). A diferenciação entre endofíticos, epifíticos (aqueles microrganismos que vivem na superfície de plantas) e fitopatógenos (aqueles que causam doenças em plantas) depende do nicho ocupado em determinado estágio da interação do microrganismo com o hospedeiro (STROBEL et al., 2004), portanto, a aplicação destes termos tem puro significado didático, havendo ainda dificuldade em determinar limites entre eles (AZEVEDO et al., 2002). Os microrganismos endofíticos se relacionam com diversos tipos de vegetais como plantas herbáceas (TAECHOWISAN et al., 2003), plantas de florestas tropicais (STROBEL, 2002), plantas cultivadas (MELNROY; KLOEPPER, 1995), plantas medicinais (HUANG et al., 2001) e plantas aquáticas (CHEN et al., 2003). Comumente, de dezenas a centenas de isolados podem ser obtidos de um único vegetal e, a partir deste único hospedeiro, pelo menos uma espécie se mostra específica, confirmando o fato que os endofíticos são um componente importante da diversidade microbiana (TAN; ZOU, 2001; STROBEL; DAYSE, 2003). Os endofíticos podem ser transmitidos verticalmente quando penetram pelas sementes ou pela zona radicular, horizontalmente quando penetram através dos estômatos ou diretamente na parede celular utilizando apressórios e haustórios (SAIKKONEM et al., 2004). A colonização endofítica pode ser intracelular e limitada a poucas células, intercelular e localizada ou ainda inter e intracelular sistêmica e pode se desenvolver em qualquer tecido ou órgão do vegetal: raiz, caule, ramos, folhas, flores e frutos (PEIXOTO-NETO et al., 2002; SCHULZ; BOYLE, 2005; MARINHO et al., 2005; JOHRI, 2006). O estudo dos endofíticos pode ser realizado a partir do seu isolamento em meios de cultura e sob condições controladas, pela sua observação direta a partir de técnicas de microscopia ótica ou eletrônica ou pela sua detecção através de técnicas diretas de amplificação de DNA (SCHULZ & BOYLE, 2005). Os fungos endofíticos estão divididos em dois grupos ecológicos: balansiaceous (ou endofíticos de gramíneas) e não-balansiaceous (SCHULZ; BOYLE, 2005). O primeiro grupo composto por espécies de Epichloë e Balansia (e os anamorfos Neothyphodium e Ephelis) que são proximamente relacionadas e apresentam requerimentos ecológicos e adaptações distintas de todos os outros fungos endofíticos (PETRINI, 1996). Por conta da sua importância.

(17) 4. ecológica e econômica, são os mais bem estudados quanto a interação endofítico/hospedeiro sendo encontrados de forma sistêmica e intercelular em todos os órgãos de gramíneas, resultando na transmissão vertical através de sementes (BACON; WHITE, 2000). Os endofíticos balansiaceous produzem uma ampla variedade de metabólitos secundários como alcalóides tóxicos a insetos e vertebrados (SCHARDL, 2000). Em contraste, o grupo dos fungos endofíticos não-balansiaceous é diversificado e formado principalmente por espécies de diferentes famílias de Ascomycota. Estes fungos foram isolados de todos os órgãos de praticamente todas as plantas estudadas (PETRINI, 1991; SCHULZ et al., 1993; STONE et al., 2000; STONE et al., 2004) e a colonização pode ser inter ou intracelular, sistêmica ou localizada (SCHULZ; BOYLE, 2005). Os gêneros mais comumente isolados são Acremonium, Alternaria, Cladosporium, Colletotrichum, Epicoccum, Fusarium, Guignardia, Phyllosticta, Pestalotiopsis, Phomopsis, Phoma e Pleospora (AZEVEDO et al., 2000; ARNOLD et al., 2000; PIMENTEL et al., 2006) A interação endofítico/hospedeiro é complexa e dependente de diferentes fatores como B ambiente (OWEN; HUNDLEY, 2004). A características do vegetal, do microrganismo e do relação que se estabelece tem sido bastante questionada, existindo duas hipóteses principais: a do equilíbrio antagônico e da simbiose mutualística (FAETH, 2002; SELOSSE et al., 2004; RUDGERS et al., 2004; SAIKKONEN et al., 2004; MÜLLER; KRAUSS, 2005; SCHULZ; BOYLE, 2005; KOGEL; FRANKEN, 2006; MAHESHWARI, 2006). Estudos in vitro mostraram que tanto o endofítico como a planta secretam metabólitos que são tóxicos para ambos, fato estranho numa interação assintomática (PETERS et al., 1998) já que na interação de patogenicidade o fungo produz metabólitos tóxicos e em resposta a planta produz metabólitos de defesa (AGRIOS, 1997). Schulz & Boyle (2005) levantaram uma hipótese a partir de estudos sobre estas observações e concluíram que a colonização assintomática é conseqüente da interação antagônica balanceada entre o vegetal e o fungo. Estes mesmos autores ainda relataram que os endofíticos produzem as exoenzimas necessárias para infectar o hospedeiro e a maioria é capaz de também produzir micotoxinas fitotóxicas. Além disso, o hospedeiro pode reagir com as mesmas defesas contra um patógeno, ou seja, com produção de metabólitos e repostas mecânicas. Neste caso há uma estreita harmonia entre a virulência fúngica e a defesa da planta (Figura 01). Se este equilíbrio é afetado, tanto por uma diminuição na defesa da planta como por um aumento da virulência fúngica, há o desenvolvimento de doença (SCHULZ et al., 2002)..

(18) 5. Virulência fúngica. Defesa do hospedeiro Interação Endofítica. Interação Patogênica Figura 01. Equilíbrio antagônico entre virulência fúngica e defesa da planta. Adaptado de SCHULZ et al., 2002.. A interação de equilíbrio antagônico não exclui a possibilidade do endófito exercer uma função benéfica para seu hospedeiro. Nesta interação mutualística, os fungos endofíticos influenciam na produção ou inibição de metabólitos com função de defesa, conferindo ao vegetal vantagens como resistência ao ataque de insetos (AZEVEDO et al., 2000), produção de antimicrobianos contra microrganismos fitopatogênicos (ARNOLD et al., 2003; MUCCIARELLI et al., 2002; SELOSSE et al., 2004; BANDARA et al., 2006), aumento de tolerância a estresses e produção de fitohormônios enquanto que os endófitos recebem nutrientes e proteção da planta (TUDZYNSKI; SHARON, 2002). As primeiras observações mostrando que os endofíticos conferem alguma vantagem ao seu hospedeiro, por exemplo, protegendo-o de ataques de insetos e herbívoros, fizeram com que estes microrganismos começassem a ser objetivo de estudos mais aprofundados (AZEVEDO, 1999; AZEVEDO et al., 2002). Os endofíticos estão sujeitos a constantes interações metabólicas e ocupam literalmente milhões de nichos biológicos únicos presentes em diferentes ecossistemas, sendo vistos atualmente como uma ótima fonte de produtos naturais bioativos úteis para a agricultura, indústria e medicina (SCHULZ et al., 2002; STROBEL;DAYSE, 2003; STROBEL et al., 2004; BANDARA et al., 2006)..

(19) 6. 1.3 Diversidade e Especificidade de Fungos Endofíticos Os estudos sobre fungos endofíticos são de incontestável relevância, pois estes são microrganismos ubíquos, possuem grande potencial na obtenção de substâncias bioativas e estabelecem importantes funções ecológicas. Muitos trabalhos relatam que vegetais são colonizados por dezenas de endofíticos, mostrando a sua importância na estimativa da diversidade fúngica (SAIKKONEM et al., 1998; ARNOLD et al., 2000). Investigações detalhadas da micobiota vegetal têm frequentemente descoberto novos taxa e revelado novas ocorrências de espécies já conhecidas (STONE et al., 2004). A ampla distribuição e diversidade de fungos endofíticos foram relatadas em um levantamento feito por Stone et al. (2004) no qual são relacionados os hospedeiros, tipo de tecido e o número de espécies isoladas (Tabela 1). Geralmente, os endofíticos de certo hospedeiro constituem um grupo consistente caracterizado por poucas espécies dominantes. Em adição a este grupo, surgem as denominadas espécies acidentais que são representadas por apenas um ou dois isolados entre centenas (Tabela 2). O número de espécies obtidas é proporcional à intensidade, variedade do tecido vegetal (BILLS; POLLISHOOK 1992) e menor tamanho do fragmento utilizado durante o isolamento (GAMBOA et al., 2002). As espécies mais frequentemente isoladas pertencem ao filo Ascomycota, incluindo os anamorfos (Hyphomycetes e Coelomycetes). Espécies de Basiodiomycota e Zygomycota também são isoladas como endofíticos, mas representam um número menor (SCHULZ;BOYLE, 2005). Em plantas brasileiras, espécies de Ascochyta, Cladosporium, Colletotrichum, Fusarium, Glomelera, Guignardia, Mucor, Nodulisporium, Pestalotia, Phomopsis, Phyllosticta, Rhizopus e Xylaria são as mais freqüentes (PEIXOTO-NETO et al., 2002). O habitat associado à planta é um ambiente dinâmico no qual muitos fatores afetam a freqüência e composição de espécies das comunidades microbianas. As comunidades endofíticas variam espacialmente no vegetal havendo diferença e especificidade da micobiota entre os diversos tecidos vegetais: raízes, caules, folhas, flores e frutos (NALINI et al., 2005; TEJESVI et al., 2005; GOND et al., 2007). As comunidades endofíticas também são dependentes da interação com outros microrganismos como patógenos e epifíticos (OSONO, 2007; SANTAMARÍA; BAYMAN, 2005), além de sofrerem influência do ambiente (PIMENTEL et al., 2006; UNTERSEHER et al., 2007) e da idade do tecido vegetal (PHOTITA et al., 2001; VUJANOVIC; BRISSON, 2002)..

(20) 7. Tabela 1. Número de espécies endofíticas isoladas de vários hospedeiros mundialmente distribuídos (Adaptado de STONE et al., 2004).. Hospedeiro Abies alba. Tecido ou órgão. No de espécies. Ramos da base. 44. A. alba A. alba Arer macrophyllum. Broto Folhas Folhas; caule. 50 120 9. A. pseudoplatanus. Ramos da base. 28. A. pseudoplatanus A. spicatum. Folhas Raiz. 22 7. Ramos da base. 24. Raízes aquáticas. 46. Folhas; caule Broto Folhas Caule Raiz Ramos da base. 25 27 176 35 14 23. Casca. 155. Folhedo Folhedo Folhas; broto Caule Folhas Folhas Caule Folhas Ramos Folhas Folhas Folhas Folhas Folhas Folhas Folhas Folhas Folhas Caule Folhas; raízes Folhas Broto Raízes Folhas Folhas; raízes; caule Brotos, folhas Folhas Folhas Folhas; caule Folhas; caule. 15 18 88 45 4 23 41 62 18 13 242 14 14 114 11 45 23 24 23 30 259 85 97 9 61 149 31 17 46 23. Alnus glutinosa A. glutinosa A. rubra A. rubra Aretostaphylos uva-ursi A. urva-ursi A. uva-ursi Betula pendula Carpinus carolintana Calocedrus decurrens Chaemacyparis lawsoniana C. thyoides Cuscuta reflexa Dryas octopelata D. octopelata Eucaluptus globulus Euterpe oleracea Fagus sylvatica Gautheria shalon Heisteria concinna Hordeum vulgare Juncus bufonius Juniperus communis Licuala ramsayi Livistona chinensis Manilkara bidentata Musa acuminata Opuntia stricta Oryza sativa Ouratea lucens Picea abies P. marian Pinus densiflora Pteridium aquilinum Quercus ilex Salicornia perennis Tlia cordata Vitis vinifera Zea mays. Observações 17 comuns; 2 endêmicas 13 comuns 16 comuns; 5 endêmicas Hyphomycetes aquáticos 17 comuns; 3 endêmicas; 2 novas espécies 14 comuns; 12 Hyphomycetes aquáticos 12 comuns 13 comuns 23 comuns 29 comuns 8 comuns 14 comuns 11-12 espécies por árvore; 5 Basidiomycetes 1 Basidiomycetes 8-12 espécies por árvore 9 Basidiomycetes 21 comuns 6 comuns 10 espécies dominantes -. Local Alemanha Suíça Suíça Columbia Britânica Alemanha Alemanha Nova Escócia Alemanha Reino Unido Columbia Britânica Columbia Britânica Suíça Suíça Suíça Alemanha EUA EUA EUA EUA Índia Alemanha Suíça Uruguai Brasil Reino Unido EUA Panamá Nova Zelândia EUA Suíça Austrália China Porto Rico China Austrália Itália Panamá Suécia EUA Japão Reino Unido Espanha Reino Unido Alemanha África do Sul Reino Unido.

(21) 8 Tabela 2. Fungos endofíticos freqüentes e acidentais de diferentes hospedeiros.. Tecido vegetal. Endofíticos freqüentes. Endofíticos acidentais. Referência. Aegle marmelos Correae. Hospedeiro. Folhas, raiz e casca. Alternaria alternata; Fusarium roseum; Drechslera ellisii. Trichoderma viride; Corynespora sp.. GOND et al., 2007. Azadirachta indica A. Juss (Neem). Folha, caule e casca. Phomopsis oblonga; Aspergillus flavus; Fusarium oxysporum. Drechslera sp.; Gliomastix sp.. VERMA et al., 2007. Camptotheca acuminata Decne. Centella asiática (L.) Urban. Caule, casca e raiz. Alternaria sp.; Phomopsis sp.;. Trichoderma sp.; Cunninghamella sp.. LIN et al., 2007. Folhas. Colletotrichum higginsianum; Guignardia mangiferae; Glomerella cingulata Colletotrichum sp.; Xylaria sp.; Guignardia sp.;. Nodulisporium sp.; Cladosporium sp.; Physalospora sp.. RAKOTONIRIANA et al., 2007. Mucor sp.; Cladosporium sp.. SANTAMARÍA; BAYMAN, 2005. Verticillium spp.; Nigrospora oryzae; Fusarium verticilloides Alternaria alternata; Colletotrichum gloeosporioides; Cladosporium sp.;. Isariopsis spp.; Ascochyta rabei; Artrobotrys conoides Bipolaris cynodontis; Chaetomiun globosum; Epicoccum nigrum. NALINI et al., 2004. Coffea Arabica L. Crataeva magna (Lour.) DC. Lycopersicon esculentum Mill. Folhas Caule e casca Folhas. LARRAN et al., 2001. Melia azedarach L.. Raiz, caule, folhas. Penicillium sp.; Aspergillus sp.;. Balansia sp.; Pestalotiopsis vesicolor. SANTOS et al.,2003. Musa acuminata L.. Folhas, raiz. Trichothecium sp.; Cladosporium sp.; Spicaria sp.. CAO et al., 2001. Nerium oleander L. Folhas e caule. Gloesporium musae; Aspergillus sp.; Myxosporium sp.; Torula sp.; Phoma spp.. Cladosporium sp.; Chaetomium spp.. HUANG et al., 2007. Colletotrichum sp.; Phyllosticta sp.; Phomopsis sp. Nigrospora oryzae; Xylaria sp.; Acremonium sp. Phomopsis sp.; Colletotrichum sp; Nigrospora sphaerica. Apiognomonia sp.. HATA et al., 2002. Cladosporium sp.; Nodulisporium sp.; Gliocadium virens Schizophyllum commune; Fusarium sp.; Daldinia eschscholzii. SALAZAR; GARCÍA, 2005 CHAREPRASERT et al., 2006. Caule e casca. Pestalotiopsis spp.; Chaetomium globosum. Phialophora spp.; Cladosporium elatum; Melasmia hypophylla. TEJESVI et al., 2005. Folhas. Alternaria alternria; Rhodotorula rubra; Epicoccum nigrum. Pleospora herbarum; Phomopsis sp.. LARRAN et al., 2002. Sementes. Aspergillus niger; Fusarium semitectum; Rhizopus stolonifer. Trichoderma longibrachiatum; Zygosporium gibbum; Helminthosporium australiensis; Drechslera sp.. RODRIGUES; MENEZES, 2002. Pasania edulis Makino. Folhas. Rosa hybrida L.. Folhas. Tectonia grandis L.. Folhas. Terminalia arjuna W. & A. Triticum aestivum L. Vigna unguiculata (L.) Walp..

(22) 9. 1.4 Importância dos Fungos Endofíticos Os endofíticos foram descritos pela primeira vez no início do século XIX e diferenciados dos fitopatógenos por de Bary em 1866, mas apenas a partir dos anos 70 do século XX é que foram devidamente estudados, despertando grande interesse biotecnológico em decorrência da sua importância na obtenção de produtos bioativos para aplicações na indústria farmacêutica (AZEVEDO et al., 2002; ARAÚJO et al., 2002). As primeiras observações mostrando que os endofíticos conferiam alguma vantagem ao hospedeiro fizeram com que estes microrganismos começassem a ser objetivo de estudos mais aprofundados (AZEVEDO, 1999; AZEVEDO et al., 2002). Devido a seu nicho altamente específico, atenções mais recentes estão direcionadas para estudos químicos e biológicos de seus metabólitos, além de sua diversidade e funções ecológicas (TAN; ZOU, 2001; STROBEL, 2002). O taxol, substância extraída da árvore Taxus brevifolia, utilizada contra câncer de mama e de útero, é um exemplo pioneiro que ilustra o interesse pelo potencial dos microrganismos endofíticos. Taxomyces andreanea, fungo isolado de Taxus brevifolia, assim como seu hospedeiro, é capaz de sintetizar o taxol como forma de proteção do vegetal contra fungos fitopatogênicos. Esta descoberta indica grande vantagem na solução de problemas ecológicos, além de possibilitar a produção de compostos com mais rapidez e em maior quantidade (STIERLE et al., 1993). Estudos visando encontrar fungos endofíticos produtores de taxol sugerem que esta droga é mais comumente produzida pelos fungos do que pelo próprio vegetal, além de que estes microrganismos estão amplamente distribuídos em todo o mundo e não são exclusivos de espécies de Taxus (STROBEL, 2003). Pestalotiopsis microspora isolado de Taxus wallichiana (Strobel et al. 1996), P. guepini obtido de Wollemia nobilis (STROBEL et al., 1997) Seimatoantlerium tepuiense endofítico de Maguireothammus speciosus (STROBEL et al., 1999), Periconia sp. endofítico de Torreya grandifolia (LI et al., 1998) e Bartalinia robillardoides endofítico de Aegle marmelos (GANGADEVI; MUTHUMARY, 2007) são exemplos de fungos produtores de taxol. Certos endofíticos melhoram a adaptabilidade de seus hospedeiros aumentando sua tolerância a ambientes com estresse e resistência contra fitopatógenos e/ou herbívoros e insetos. Neotyphodium, por exemplo, é um endofítico de Festuca aerundinacea que beneficia seu hospedeiro aumentando a tolerância à seca (WHITE JR. et al., 2002), o crescimento da raiz, a produção de sementes, a germinação, a captação.

(23) 10 de fósforo e a resistência a nematóides e insetos (PANACCIONE et al., 2001). Arnold et al. (2003) estudaram a resposta de plantas de cacaueiro axênicas (isentas de microrganismos) inoculadas com endofíticos do próprio hospedeiro e com o patógeno Phytophtora sp. e observaram que as plantas inoculadas com os endofíticos apresentaram menos necrose e mortalidade das folhas, quando comparadas aos controles, inoculados apenas com o patógeno. Um levantamento feito por Azevedo et al. (2000) mostra a importância de fungos endofíticos no controle de insetos que atacam plantas. Exemplos como Acremonium lolii, Balansia cyper, Cladosporium sphaerosperum e Phomopsis oblonga são citados como fungos produtores de metabólitos capazes de proteger seu hospedeiro de ataques de insetos. Este fato se deve muitas vezes a produção de toxinas pelo endofítico, correlação feita pela primeira por vez por Bacon et al. (1977) os quais estabeleceram uma ligação entre o endofítico Epichloë typhi e a toxicidade do hospedeiro, o que confere proteção ao vegetal. O crescimento do vegetal também pode ser afetado pela presença de endofíticos, este se mostrando melhor desenvolvido quando colonizados. Isto se deve em parte a produção de fitormônios e/ou ao fato dos endofíticos serem capazes de aumentar a absorção de nutrientes como nitrogênio e fósforo pela planta (TAN; ZOU, 2001; BANDARA et al., 2006). Uma das propriedades mais importantes dos fungos está associada à sua capacidade metabólica de produzir uma grande diversidade de moléculas bioativas, sendo estes fármacos importantes de uso clínico em várias patologias. Os produtos naturais de microrganismos endofíticos têm mostrado capacidade de inibir ou matar uma ampla variedade de agentes patogênicos incluindo microrganismos fitopatógenos (STROBEL, 2003; STROBEL et al., 2004; GUNATILAKA, 2006) bem como fungos, bactérias (HARRISON et al., 1991; HORN et al., 1995; STROBEL et al., 1999; BRADY; CLARDY. 2000; LI et al., 2000; LU et al., 2000;) e vírus (GUO et al., 2000), além de apresentarem atividade antiumoral (WAGENAAR et al., 2000), atuarem como agentes antidiabéticos e imunossupressivos (STIERLE et al., 1993; ZHANG et al. 1999). Schulz et al. (2002) relataram que os fungos endofíticos são realmente uma boa fonte de metabólitos secundários, visto que a proporção de novas estruturas sintetizadas por estes microrganismos (51%) é maior do que a produzida por microrganismos do solo (38%) e que 80% destes produzem compostos biologicamente ativos contra fungos e bactérias ou apresentam atividade herbicida..

(24) 11. 1.5. Antimicrobianos Produzidos por Fungos Produtos naturais são metabólitos derivados naturalmente de microrganismos, plantas ou animais. Há séculos estes produtos vêem sendo explorados pelo homem, sendo as plantas a principal fonte de compostos utilizados na medicina (STROBEL; DAYSE, 2003). Por conta da sua diversidade e complexidade estrutural, os produtos naturais são de grande importância na farmacologia e biotecnologia, podendo também ser utilizados como modelo para síntese e semi-síntese de moléculas bioativas de amplo espectro e baixa toxicidade (DEMAIN, 2006; GULLO et al., 2006). O exemplo mais conhecido entre os produtos naturais são os antibióticos. Na “Era dourada dos antibióticos” dos anos 40 aos anos 70 do século passado destacou-se a descoberta da Penicilina por Alexander Fleming em 1928 e por sua produção por Chain e Florey em 1940 (DEMAIN, 2000). Os microrganismos, em especial os fungos, são conhecidos pela sua capacidade metabólica de produzir uma grande diversidade de moléculas bioativas. Estas substâncias, por sua vez, podem ser altamente tóxicas, por exemplo, as micotoxinas ou ser bastante úteis por poderem ser utilizadas como fármacos de uso em várias patologias. Esta dicotomia de funções é conseqüência da grande diversidade de compostos químicos que os fungos produzem (PINTO et al.,2002). Em 1994, dos vinte medicamentos mais vendidos, representando um mercado de aproximadamente 6,7 bilhões de dólares, seis deles foram obtidos in natura ou por transformação química de metabólitos provenientes de fungos. Dentre os medicamentos de maior repercussão terapêutica para doenças infecciosas destacam-se os antibióticos penicilinas e cefalosporinas como os exemplos mais conhecidos de produtos de fungos (SINGH & BARRETT, 2006). Recentemente, a pesquisa por produtos naturais tem perdido popularidade na maioria das companhias de medicamentos e, em alguns casos, tem sido substituída pela síntese química (BILLS et al., 2002; PELÁEZ, 2006). Esta dimuição de interesse pode estar atribuída ao enorme esforço e altos custos que são requeridos na obtenção, elucidação das estruturas e no desenvolvimento de medicamentos originados de produtos naturais. O tempo estimado desde o descobrimento até o laçamento de uma nova droga no mercado é de aproximadamente 10 anos, acarretando um gasto de mais de 800 milhões de dólares (REICHERT, 2003; DICKSON; GAGNON, 2004). Como.

(25) 12 solução deste problema, a bioprospecção de metabólitos bioativos deve ser melhorada com a utilização de novas tecnologias e alternativas como engenharia genética e biossíntese mutacional, além da identificação mais rápida das moléculas de uma forma economicamente viável (BUTLER, 2004; WEIST;SUSSMUTH, 2005). Os fungos endofíticos se destacam como grandes produtores de metabólitos secundários (GUNATILAKA, 2006). Schulz et al. (2002) relatam a importância da pesquisa dos metabólitos destes microganismos, pois em comparação com fungos obtidos de outros substratos, relativamente poucos metabólitos têm sido isolados de fungos endofíticos. Além disso, 51% das substâncias já estudadas se tratam de compostos inéditos, enquanto que da microbiota do solo apenas 38% eram novas. A procura por novos habitats e a diversidade fúngica são fatores importantes na busca por produtos naturais e, consequentemente, no desenvolvimento de novas drogas.. 1.5.1 Antibióticos Produzidos por Fungos Endofíticos 1.5.1.1 Cryptocandin A e Cryptocin Cryptocandin A é um antifúngico lipopetitídico isolado do fungo endofítico Cryptosporiopsis quercina endofítico de Tripterigeum wilfordii, planta medicinal pertencente à família Celastracea nativa da Eurásia. Este composto contém um número incomum de aminoácidos hidroxilados e um novo aminoácido 3-hydroxy-4 hydroxymethylproline (Figure 2). Cryptocandin A é ativo contra alguns fungos importantes por causarem patologia ao homem, incluindo Candida albicans e Trichophyton sp. Além de também agir contra fungos fitopatógenos como Sclerotinia sclerotiorum e Botrytis cinerea (STROBEL et al., 1999). Cryptocin (Figura 2), um ácido tetrâmico com atividade antifúngica também foi obtido de C. quercina. Este composto possui uma potente atividade contra Pyricularia oryzae, microrganismo causador de doenças em planta o mundo (LI et al., 2000).. Figura 2. Cryptocandin A e Criptocin (LI et al., 2000).

(26) 13. 1.5.1.2 Acido coletótrico Artemísia, vegetal nativo da China e que tem como característica a sua resistência contra herbívoros, fungos e bactérias que atacam plantas adjacentes com facilidade, fato que levou à caracterização de compostos bioativos de fungos endofíticos que colonizam este hospedeiro. Um novo metabólito denominado de “colletotric acid” (Figura 3), produzido pelo fungo endofítico Colletotrichum gloeosporioides isolado de caule de Artemisia anuua e A. mongolia mostrou forte atividade antimicrobiana contra as bactérias patogênicas ao homem Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis e Sarcina lutea e contra o fungo fiopatógeno Helminthosporium sativum (ZOU et al., 2000).. Figura 3. Ácido coletótrico (ZOU et al., 2000). 1.5.1.3 2,4-diidroxi-5,6-dimetil benzoato de etila e Phomopsilactona Cassia spectabilis é uma planta medicinal tradicionalmente utilizada no Brasil para tratamento de gripes e resfriados e como laxativo. Por conta do seu caráter medicinal, foi desenvolvido um estudo dos metabólitos bioativos de culturas de fungos endofíticos que colonizam este vegetal. O fermentado de Phomopsis cassiae, fungo isolado de folhas de C. spectabilis, foi selecionado para investigações químicas. Dois novos metabólitos, 2,4-diidroxi-5,6-dimetil benzoato de etila e Phomopsilactona (Figura 4) foram elucidados e nos testes de atividade antifúngica mostraram-se fortemente ativos contra os fitopatógenos Cladosporium sphaerospermum e C. cladosporioides (SILVA et al,. 2005).. Figura 4. 2,4-diidroxi-5,6-dimetil benzoato de etila e phomopsilactona (SILVA et al., 2005)..

(27) 14 1.5.1.4 Brefeldin A Dentre os 67 fungos endofíticos isolados de Quercus variabilis, planta medicinal nativa da China usada conta afecções da garganta, 53,7% se mostraram inibidores do crescimento de pelo menos um microrganismo teste, tanto fungos patogênicos ao homem. (Aspergillus. niger,. Candida. albicans,. Epidermophyton. floccosum,. Microsporum canis, Trichophyton rubrum,), como também bactérias (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens). O fungo que se mostrou mais ativo foi Cladosporium sp. que produz uma substancia química identificada como Brefeldin A (Figura 5) ativo contra Aspergillus niger, Candida albicans, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis e Trichophyton rubrum (WANG et al.,. 2006).. Figura 5. Brefeldin A (WANG et al., 2006).

(28) 15. 1.6 Lippia sidoides Cham. O gênero Lippia (Verbenaceae), de grande importância médica e econômica, é constituído de aproximadamente 200 espécies dentre ervas, árvores de pequeno porte e arbustos distribuídos principalmente ao longo da América do Sul, América Central e África Tropical (LEMOS, 1990; LACOSTE, 1996). Lippia sidoides Cham. (Figura 6), popularmente conhecida como alecrim-pimenta, é um arbusto encontrado no sertão nordestino, principalmente nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte. A exemplo de outras espécies do gênero é uma planta aromática, de uso medicinal popular, principalmente como anti-séptico, havendo sido introduzida há pouco tempo nos programas de fitoterapia científica e nas práticas caseiras como fármaco fitoterápico, com base nos elevados teores de timol de seu óleo essencial e dos resultados de vários ensaios farmacológicos que vieram validar cientificamente seu uso como planta medicinal (COSTA et al., 2001). Os principais compostos do óleo essencial de Lippia sidoides são: timol (5070%), carvacrol (5-8%), p-cimeno (12-27%), cis-cariofileno (1–10%), γ-terpineno (6%), mirceleno (2%) e outros terpenos (COSTA et al. 2001). O timol e o carvacrol (Figura 7) são potentes anti-sépticos de atividades bactericida e fungicida (LEMOS et al., 1990; LACOSTE et al., 1996; MATOS; OLIVEIRA, 1998). A atividade antibacteriana e antifúngica do óleo têm espectro de ação contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp, Streptococcus mutans, Salmonella typhii, Corynebacterium xerosis, Candida albicans, Trichophytom rubrum e Trichophytom interdigitale, dentre outros (GIRÃO, 2001; PASCUAL, 2001; KALEMBA; KUNICKA, 2003; KUNLE et al., 2003; DUARTE, 2005). Em virtude destas propriedades, este vegetal é cultivado em hortos de plantas medicinais e faz parte do elenco de plantas selecionadas pelo Governo do Estado de Pernambuco como fitoterápico. Dentre as investigações realizadas quanto a micobiota endofítica de plantas medicinais brasileiras, ainda não há na literatura dados de estudos realizados com Lippia sidoides quanto a este aspecto..

(29) 16. Figura 6. Planta medicinal Lippia sidodies Cham.. A. B. Figura 7. Estrutura Química do Carvacrol (A) e Timol (B) (COSTA et al., 2001).

(30) 17. 2. REFERÊNCIAS.

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(40) 27. 3. PRIMEIRO CAPÍTULO.

(41) 28. Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham.. Artigo submetido em 22/10/2007 a Wourld Journal of Microbiology and Biotechnology.

(42) 29 Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham.. Virginia Medeiros de Siqueiraa*, Raphael Contib, Janete Magali de Araújoc, Cristina Maria Souza-Mottaa. a. Departmento de Micologia, UFPE, 50670-901 Recife - PE, Brazil.. b. Departmento de Ciências Farmacêuticas, UFPE, 50670-901 Recife - PE, Brazil.. c. Departmento de Antibióticos, UFPE, 50670-901 Recife - PE, Brazil.. *e-mails: virginiamedeiros@hotmail.com virginiamedeiros_82@yahoo.com.br. Tel: + 55 81 21268347 Fax: + 55 81 21268346.

(43) 30 Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham.. Resumo Fungos endofíticos foram isolados de tecidos sadios de Lippia sidoides, planta medicinal usada principalmente como anti-séptico no Nordeste Brasileiro. A partir de 240 fragmentos de folhas e 240 de caule foi isolado um total de 207 fungos endofíticos, representando 14 espécies pertencentes aos grupos Ascomycota, Coelomycetes e Hyphomycetes. A colonização endofítica foi maior nas folhas (52%) do que no caule (34,1%). Colletotrichum gloeosporiodes foi a espécie com maior freqüência de colonização (12,3%), seguida de Alternaria alternata (7,08%), Guignardia bidwelli (6,87%) e Phomopsis archeri (5,41%). Algumas espécies se mostraram específicas para determinado tecido do hospedeiro: Corynespora subcylindrica, Curvularia pallescens, Dreschlera dematioidea, G. bidwelli, Microascus desmosporum, Peacilomyces variotti, Periconia byssoides e Ulocladium oudemansii foram isolados apenas de folhas e Fusarium lateritium e Phoma tracheiphila foram isolados apenas de caule.. Palavras chave: Fungos endofíticos, diversidade, folhas, caule, Lippia sidoides..

(44) 31 Introdução O estabelecimento de plantas em seus respectivos habitats envolve sua capacidade de interagir com diferentes espécies de organismos. Os microrganismos interagem de formas distintas em diferentes áreas do vegetal, sendo denominados de endofíticos quando colonizam inter e/ou intracelularmente tecidos sadios da planta hospedeira, tipicamente sem causar sintomas de doença (Petrini, 1991; Azevedo et al. 2000). A relação entre o endofítico e seu hospedeiro é complexa e certamente muda conforme o hospedeiro e o microrganismo (Owen & Hundley 2004), sendo possível se estabelecer uma simbiose que varia desde o mutualismo até a fitopatogenia latente, passando pelo comensalismo e saprofitismo (Clay & Schardl 2002; Strobel & Dayse 2003; Kogel & Franken 2006). Os primeiros estudos mostrando que os endófitos conferiam algumas vantagens ao seu hospedeiro, por exemplo, protegendo-o de insetos, patógenos e até mesmo de herbívoros domésticos, fizeram deles objetivo de pesquisas mais aprofundadas (Azevedo 1999; Azevedo et al. 2002). Recentemente, endofíticos são vistos como uma ótima fonte de novos produtos naturais bioativos úteis na agricultura, indústria e medicina, uma vez que estes microrganismos ocupam literalmente milhões de nichos ecológicos únicos crescendo em muitos ambientes muitas vezes incomuns (Schulz et al. 2002; Strobel & Dayse 2003; Strobel et al. 2004; Bandara et al. 2006). Muitos endofíticos isolados de plantas medicinais têm se mostrado produtores de metabólitos secundários com forte atividade fungicida e bactericida (Tan & Zou 2001; Gunatilaka 2006). Investigações detalhadas da micobiota interna de plantas frequentemente descobrem novos taxa e revela novas distribuições das espécies já conhecidas. Pelo fato dos endofíticos serem incompiscuous, a diversidade de espécies da micobiota interna ser relativamente alta e uma pequena porção de potenciais hospedeiros terem sido até então examinados, endofíticos representam um número substancial de fungos ainda não descobertos (Arnold et al. 2000). Investigações de fungos endofíticos de vegetais bem caracterizados e economicamente importantes frequentemente revela novos taxa. Estudos sobre fungos endofíticos são necessários para fornecer informações fundamentais para a avaliação da diversidade e distribuição fúngica global (Stone et al. 2004)..

(45) 32 O gênero Lippia pertence à família Verbenaceae e é constituído de aproximadamente duzentas espécies nativas da América do Sul, América Central e África (Lemos et al. 1990; Lacoste et al. 1996). Lippia sidoides Cham., popularmente conhecida como alecrim-pimenta, é um arbusto encontrado no nordeste Brasileiro, principalmente nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte. Baseado nas altas concentrações de timol e carvacrol, componentes do seu óleo essencial, e em muitos testes farmacológicos que vieram validar seu uso como planta medicinal, Lippia sidoides é utilizada na medicina tradicional para o tratamento de doenças infecciosas (Costa et al. 2002). O chá de folhas e flores é manuseado topicamente em ferimentos e queimaduras como agente antiséptico e antiinflamatório (Matos & Oliveira 1998; Pascual 2001). Os objetivos do presente estudo foram isolar fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides para determinar sua freqüência de colonização e fazer um levantamento de sua distribuição nos diferentes tecidos do vegetal. Em pesquisas futuras, os resultados deste estudo poderão contribuir para a descoberta de novos compostos bioativos provavelmente derivados de fungos endofíticos desta planta medicinal.. Materiais e métodos Material vegetal A coleta do material vegetal foi realizada na Estação Experimental da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA) em Carpina-PE, Brazil, em julho de 2006. O clima da região é tropical úmido com o período chuvoso de Fevereiro a Setembro. Folhas e caule de cinco indivíduos aparentemente sadios foram aleatoriamente coletados, etiquetados e colocados em sacos plásticos sob refrigeração. As amostras foram enviadas para o Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, Brasil e processadas em até 24h.. Isolamento de fungos endofíticos Para eliminação de microrganismos epifíticos, o material vegetal foi submetido ao processo de esterilização superficial de acordo com Araújo et al. (2002a). Folhas e caules de L. sidoides foram lavados em água corrente, seguido de imersão em etanol 70% por 1 minuto, em hipoclorito de sódio (2 – 2,5% de cloro ativo) por 4 minutos, em etanol 70% por 30 segundos e lavados três vezes em água destilada e esterilizada. Após.