Processamento das amostras

5.8.1 Determinação da concentração sérica de cálcio, magnésio e fósforo

As concentrações de cálcio, magnésio e fósforo sérico foram determinadas por método colorimétrico, utilizando kits comerciais BioClin, específicos para cada mineral. A leitura das reações obtidas foi realizada por absorbância em espectrofotômetro modelo SP Biospectro, utilizando comprimentos de onda específicos para cada analito: cálcio (510nm), fósforo (650nm) e magnésio (500nm). Após a leitura da absorbância foi realizado o cálculo segundo a fórmula contida na bula de cada kit, obtendo assim a quantificação final do analito, sendo expresso em mg/dL.

5.8.2 Determinação da concentração de insulina, osteocalcina e paratormônio

As concentrações séricas de insulina, osteocalcina e paratormônio foram determinadas por Imunoabsorção Ligado a Enzimas, utilizando o kit para rato da marca UScn Life Science Inc.

Na determinação da insulina o ensaio emprega a técnica de inibição competitiva enzimática. Nesta técnica ocorre uma correlação inversa entre a concentração de insulina na amostra e a intensidade do sinal. A placa de microtitulação fornecidas no kit era revestido com um anticorpo monoclonal específico de insulina para rato (IAA). As amostras e os padrões foram adicionados nos poços da placa. Uma reação de inibição era iniciada entre a insulina de rato marcada com biotina e a insulina de rato não marcada (amostra ou padrões) com o anticorpo específico revestido de insulina para rato. Após a incubação o conjugado não ligado é lavado. Em seguida, avidina conjugada com peroxidase de rábano silvestre foi adicionado em cada placa e incubada. A quantidade de conjugado ligado com a peroxidase de rábano era inversamente proporcional a concentração de insulina na amostra. A mudança de cor foi medida espectrofotometricamente no leitor de ELISA Thermo plate Read, em comprimento de onda de 450 nm. A

concentração de IAA na amostra foi determinada comparando a densidade ótica das amostras com a curva padrão e os resultados expressos em pg/mL.

Para a concentração sérica de osteocalcina foram utilizadas placas de microtitulação fornecidos no kit e pré-revestido com um anticorpo específico para osteocalcina. As amostras, os padrões e a preparação de anticorpo específico para osteocalcina conjugada com biotina foram adicionadas na microplaca. Após, avidina conjugada com peroxidase de rábano silvestre foi adicionada em cada poço e incubado. Em seguida foi adicionada solução de substrato. Somente os poços que continham osteocalcina, anticorpo conjugado com biotina e avidina conjugada com enzima exibiam uma mudança na cor. A reação enzima-substrato era terminada pela adição da solução de ácido sulfúrico e a mudança na cor medida espectrofotometricamente no leitor de ELISA Thermo plate Read, em comprimento de onda de 450 nm. A concentração de osteocalcina nas amostras foi então determinada através da comparação da densidade ótica das amostras com a curva padrão. A curva foi constituída por análise de regressão e os resultados expressos em ng/mL.

Para a concentração sérica de paratormônio (PTH) empregou-se a técnica da inibição competitiva enzimática. Um anticorpo monoclonal específico para PTH de rato foi pré-revestido na microplaca. Uma reação de inibição competitiva foi iniciada entre o PTH de rato marcado com biotina e PTH de rato não marcado (padrões e amostras) com o anticorpo específico para PTH de rato pré-revestido. Após incubação o conjugado não-ligado foi lavado, em seguida avidina conjugada com peroxidase de rábano foi adicionada em cada poço da microplaca e incubada. A quantidade de peroxidase de rábano ligado é inversamente proporcional a concentração de PTH na amostra. Após adição da solução de substrato, a intensidade da cor desenvolvida é reversamente proporcional a concentração de PTH na amostra. A mudança de cor foi medida espectrofotometricamente no leitor de ELISA Thermo plate Read, em comprimento de onda de 450 nm. A concentração de PTH na amostra foi determinada através da comparação da densidade ótica das amostras com a curva padrão. Os resultados foram expressos pg/mL.

5.8.3 Conteúdo mineral ósseo do fêmur

Antes da análise, todo o material utilizado foi previamente lavado por imersão em ácido nítrico diluído (1:4), posteriormente, cuidadosamente enxaguado com água deionizada e, por fim, colocado em estufa à 105º C para a secagem. Os materiais foram resfriados no dessecador e depois colocados por 3 horas na mufla para posterior resfriamento e pesagem em balança analítica.

Primeiramente foi determinada a umidade, realizada por meio da técnica gravimétrica com emprego de calor (105º C) (CECCHI,1999).

Para obtenção das cinzas, o fêmur direito de cada animal foi colocado no cadinho, identificados individualmente, aquecidos em mufla (Quimis) a 550º C por 3 horas (até a queima total de matéria orgânica) e resfriados em dessecador até a temperatura ambiente, para posterior pesagem em balança analítica. Novas pesagens foram realizadas até as amostras adquirirem peso constante (CECCHI, 1999). Os resultados foram expressos em gramas. Com os resultados de umidade e cinzas foi possível determinar o resíduo mineral fixo de cada amostra.

Após produzidas as cinzas, estas em seus respectivos cadinhos foram acidificadas com 3 ml de ácido nítrico (65%), colocadas em placa aquecida à 80º C por 30 minutos. Depois de resfriados, os cadinhos foram lavados com 10 ml de água deionizada e foram recuperados 5 ml de amostra com uma seringa. A solução foi filtrada com filtro Jet BioFil (Innovative unique) acoplado a seringa. Essa solução foi transferida para tubos lavados em ácidos para que assim pudessem ser realizadas as análises de minerais.

As análises de minerais foram realizadas a partir dos kits comerciais (Bioclin). A leitura das reações obtidas foi realizada em espectrofotômetro modelo SP Biospectro, utilizando comprimentos de onda específicos para cada analito: cálcio (510nm), magnésio (500nm) e fósforo (650nm). Após a leitura da absorbância foi realizado o cálculo segundo a fórmula contida na bula de cada kit, considerando a diluição da amostra, obtendo assim a quantificação final do analito, sendo o resultado expresso em mg/dL.

5.8.4 Densitometria óssea

A densitometria óssea foi realizada no Laboratório de Avaliação Nutricional e Funcional – (LANUFF) da Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro da UFF. A massa óssea e a composição corporal foram avaliadas por absorciometria com dupla emissão de raios-X, utilizando o densitômetro LUNAR – IDXA (GE-Healthcare, Madison, WI), com software encore versão 13.40 (Figura 10), utilizou-se um programa para análises densitométricas em pequenos animais (TSUJIO et al., 2009; GLICKMAN et al., 2004).

Analisamos parâmetros densitométricos de todos os animais utilizando o sistema Dual Energy X-Ray Absorptiometry (DXA). Este é um método com grande precisão e acurácia para medidas do conteúdo mineral ósseo (CMO), que utiliza baixa quantidade de radiação. É um método preciso também para medir tanto a massa óssea quanto os componentes corporais de gordura e massa magra (HERMSDORFF & MONTEIRO, 2004).

Baseia-se na atenuação sofrida pelos raios X ao atravessarem os diferentes tipos de tecidos de um corpo. Os dois tipos de energia padronizado nesses raios X possibilitam a diferenciação entre os vários tecidos corporais, dividindo o organismo em conteúdo mineral, massa gorda e massa magra (isenta de gordura). No compartimento ósseo, o método é capaz de determinar a quantidade de minerais em gramas (conteúdo mineral ósseo) contida em uma determinada projeção do osso. Dividindo-se esse conteúdo mineral pela área óssea do local, obtém-se o que se convencionou chamar de Densidade Mineral Óssea (DMO), embora se trate de uma medida de g/cm2 (LAZARETTI-CASTRO, 2004).

As análises densitométricas, Densidade Mineral Óssea (DMO,g/cm2), Conteúdo Mineral Ósseo (CMO,g) e a Área óssea (cm2) foram realizadas, individualmente, no início do experimento (com o animal anestesiado) para garantir que todos os animais tinham os mesmos parâmetros densitométricos. Nova análise foi realizada ao final do experimento, momentos antes do sacrifício, com o animal já anestesiado. Embora tenha sido realizado a densitometria óssea do corpo inteiro do animal apenas os seguintes sítios foram analisados: a densitometria óssea total, a pelve, a coluna, o tecido gordo e magro do tronco e tecido gordo e magro total.

O mesmo procedimento foi realizado com o fêmur direito. A densitometria óssea foi realizada nas peças colocadas (uma de cada vez) em recipiente com arroz para simular os tecidos moles (COSTA et al., 2012).

Figura 10 a Figura 10 b Figura 10 c

Figura 10 a – Equipamento Lunar iDXA GE, utilizado para mensuração da densidade mineral óssea.

Figura 10 b - animal pronto para realização da análise. Figura 10 c - imagem do corpo do animal utilizando o aparelho densitométrico.