PARA SAÚDE
ZORAIDE NASCIMENTO DA SILVA
EFEITO DA DIETA DA PROTEÍNA NO METABOLISMO ÓSSEO EM RATAS WISTAR ADULTAS
Orientadora: Profª. Drª. Vilma Blondet de Azeredo Co-Orientador: Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura
Niterói 2013
EFEITO DA DIETA DA PROTEÍNA NO METABOLISMO ÓSSEO EM RATAS WISTAR ADULTAS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação Strictu Sensu da Universidade Federal Fluminense,
como pré- requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde.
Orientadora: Profª. Drª Vilma Blondet de Azeredo
Co-orientador: Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura
Niterói 2013
FICHA CATALOGRÁFICA
S 586 Silva, Zoraide Nascimento da
Efeito da Dieta da Proteína no metabolismo ósseo em ratas Wistar Adultas / Zoraide Nascimento da Silva; orientador : Vilma Blondet de Azeredo. – Niterói, 2013.
92 f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Fluminense, 2013.
1. Dieta 2. Proteína na dieta 3. Densidade óssea 4. Hormônio I. Azeredo, Vilma Blondet de II. Título
CDD 613.25
EFEITO DA DIETA DA PROTEINA NO METABOLISMO ÓSSEO EM RATAS WISTAR ADULTAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação Strictu Sensu, Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense como pré-requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde
COMISSÃO EXAMINADORA
__________________________________________________________________ Profª. Drª. Vilma Blondet de Azeredo (Orientadora e Presidente da banca), UFF
__________________________________________________________________ Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura (Co-orientador – UFF)
__________________________________________________________________ Profª. Drª. Glorimar Rosa ( Titular - UFRJ)
__________________________________________________________________ Profª. Drª. Gabrielle de Souza Rocha (Titular – UFF)
DEDICATÓRIA
Ao meu filho Yuri, por tantos momentos ausente e a minha mãe pela atenção e ajuda
A Deus, sempre presente em minha vida;
À minha amiga querida Solange Augusta pelo apoio e ajuda para realização deste trabalho e também pela amizade, carinho e confiança;
Aos meus amigos do LabNE Fernanda, Arindo e Clésio pela ajuda no preparo da ração, cuidado dos animais, realização de análises e pelos momentos em que ficavam me escutando falar sobre o trabalho;
Às amigas Vânia Matoso e Vanessa Jesuz pela enorme ajuda na realização do experimento e pelos vários momentos em que ficávamos discutindo os resultados, aprendi muito com vocês;
Ao Professor Dr. Carlos Alberto Costa pela participação na construção do artigo científico e pela mega ajuda e atenção;
Ao estudante da Iniciação Científica Eduardo de Salvo Castro pela contribuição no cuidado dos animais e no momento da dissecação;
Às mestrandas do LabNE Sheila, Thaís e ao doutorando André pela ajuda nos vários momentos em que precisei tirar dúvidas;
Aos professores do LANUFF Luiz Antônio dos Anjos e Vivian Wahrlich e a técnica Ana Paula Souza Santos pelo apoio e realização da densitometria óssea;
À secretária do curso de Pós Graduação em Ciências Aplicada a Produtos para Saúde Adelina Iorio, sempre atenciosa e pronta para ajudar;
A todos os professores do curso de PGCAPS, com os quais aprendi muito;
Aos meus orientadores professora Vilma Blondet e professor Gilson Teles, pela orientação, oportunidade, paciência e pelos ensinamentos fornecidos. Minha mais profunda e eterna gratidão;
Aos meus pais e a minha irmã pelo apoio para que eu concluísse mais um projeto em minha vida.
A alegria não chega apenas no encontro do achado, mas faz parte do processo da busca. E ensinar e aprender não pode
dar-se fora da procura, fora da boniteza e da alegria.
Uma das dietas mais procuradas para perda de peso é a dieta Atkins, caracterizada como hiperproteica, hiperlipídica e hipoglicídica. O consumo em excesso de proteínas leva a produção de ácidos provenientes do metabolismo protéico e para manter a homeostase sanguínea são recrutados íons, principalmente o cálcio proveniente do osso, levando ao comprometimento deste tecido. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da dieta hiperproteica no tecido ósseo em ratas Wistar. O estudo teve duração de 60 dias. Animais com 90 dias de idade foram divididas em 4 grupos (n=7); Grupo controle Caseína 1 (C1) e Caseína 2 (C2), Grupo Hiperproteico 1 (HP1) e Hiperproteico 2 (HP 2). O grupo C2 e HP2 foram submetidos a 30% de restrição alimentar. O experimento teve a duração de 60 dias. O peso e a ingestão hídrica eram verificados uma vez por semana. Utilizando absorciometria por dupla emissão de raios X (DXA) foi avaliada a densidade mineral óssea (DMO g/cm2), o conteúdo mineral ósseo (CMO g), a Área (cm2), tecido gordo total e do tronco. A análise densitométrica foi realizada no início e ao final do experimento com o animal anestesiado. Após o sacrifício foram coletadas amostras de sangue e o fêmur direito. No fêmur foi realizado densitometria óssea, biometria e com as cinzas ósseas análises de cálcio, magnésio e fósforo. Do sangue coletado foi obtido o soro e analisados cálcio, magnésio, fósforo, insulina, osteocalcina e paratormônio. Os resultados são apresentados com média e erro padrão. Os animais com alimentação em livre demanda apresentaram maior ganho de massa corporal do que os animais com restrição calórica. Os grupos hiperproteicos apresentaram maior ingestão hídrica, quando comparados com o grupo C1 (P<0,05). Na ingestão alimentar, os grupos experimentais consumiram quantidades similares e menor em comparação com o Controle 1 (P<0,05). As concentrações de cálcio sérico foram menores entre os grupos experimentais e C2 (P<0,05). Os valores da osteocalcina sérica foram menores nos grupos hiperproteicos (P<0,05). A insulina foi significativamente menor no grupo HP2 (P<0,05), e sem diferença significativa entre os grupos controles e HP1, sendo que o grupo C2 apresentou redução de mais de 50% em relação ao grupo C1. Houve redução da largura do ponto médio da diáfise do fêmur nos grupos experimentais quando comparados com seus respectivos grupos controle. As concentrações de cálcio ósseo foram menores nos grupos hiperproteicos (P<0,05). No geral, os resultados densitométricos ósseos total, da pelve e da coluna vertebral
O tecido gordo do tronco nos grupos com consumo em livre demanda foi maior e o tecido magro total desses grupos foram similares. A dieta da proteína não promoveu maior perda de peso que a dieta controle. Os grupos hiperproteicos apresentaram redução da largura do ponto médio da diáfise do fêmur, diminuição do cálcio ósseo e sérico e da osteocalcina, sendo que o grupo HP2 apresentou também diminuição na concentração sérica de insulina.
Palavras chave: Dieta Atkins. Dieta hiperproteica. Densidade mineral óssea. Remodelagem óssea. Hormônios.
One of the most sought diet for weight loss is the Atkins’, characterized as a high protein, lipid and low glycemic diet. The excessive intake of proteins leads to the production of acids from it’s metabolism. In order to maintain homeostasis, blood ions are recruited, mainly calcium from the bone, leading to impairment of the tissue. The objective of the present study was to evaluate the effect of a high protein diet on the bone tissue in Wistar rats. 90-day-old animals were divided into 4 groups (n = 7): Casein 1 group control (C1), Casein 2 (C2), High Protein 1 (HP1) and High Protein 2 (HP 2). Groups C2 and HP2 were subjected to 30% of food restriction ( 60 days). Weight and water intake were checked once a week. Bone mineral density (BMD g/cm2), bone mineral content (BMC g), total fat tissue and area (cm2) of the thorax were determined by Dual Emission X-rays (DXA). Anesthetized animals were subjected to densitometric analysis at the beginning and at the end of the experiment with anesthetized animals. Then the animals were terminated, and the blood and right femur collected. Femur densitometry and biometrics were made. Calcium, magnesium and phosphorus were determined from bone ashes. Serum calcium, magnesium, phosphorus, insulin, PTH and osteocalcin were measured. Results are presented as mean and standard error. Animals fed ad libitum gained more body weight than the animals on restricted diet. High protein groups had higher (P <0.05) water intake when compared with C1. Food intake in experimental groups was similar and lower (P <0.05) when compared with C1. Serum calcium concentration were lower (P <0.05) between the high protein groups and C2. Values of serum osteocalcin were low (P <0.05) in high protein groups. Insulin was significantly low (P <0.05) in group HP2. C2 group insulin was reduced by over 50% compared to C1. Groups HP1 and control were statistically similar. High protein groups showed a width at the midpoint of the diaphysis when compared with their respective control groups. Bone calcium concentrations were low (P <0.05) in high protein groups. Overall, the results of bone, pelvis and spine densitometries were similar between groups ad libitum and with restricted diets. HP2 group femurs exhibited reduced bone mass density (BMD). Trunk fat and lean tissues in ad libitum groups were higher (P<0.05) and similar, respectively. The protein diet did not promote greater weight loss than the restricted diet. High protein groups showed a width reduction at the
Keywords: Atkins Diet. High protein diet. Bone mineral density. Bone remodeling. Hormones.
Quadro 1- Comparação entre a dieta da proteína e as 21
Recomendações da American Heart Association (AHA) e da National Cholesterol
Education Program (NCEP)
Figura 1 - Produção de corpos cetônicos no fígado 24 Figura 2 - Representação esquemática da parte interna de um osso 26 longo
Figura 3 - A: osso cortical, B: osso trabecular 26
Figura 4 - Remodelagem óssea (adaptado) 28 Figura 5 - Gaiolas com os ratos utilizados no experimento 37 Quadro 2 - Formulação das rações Controle e Experimental (g/100g de 38
ração)
Quadro 3 - Composição da dieta controle utilizada no experimento 39 (g/100g de ração)
Quadro 4 - Composição da dieta Experimental utilizada no experimento40 (g/100g de ração)
Figura 6 - Método para realização do lavado vaginal em ratas 42 Figura 7 - Visualização das lâminas a fresco ou coradas e caracterização 42 das fases do ciclo estral
Figura 8 - Fotomicrografia do esfregaço vaginal corado com o início 42 da fase Estro
Figura 9- Fêmur dissecado, ao lado paquímetro utilizado para 43 a medição
Figura 10- A: Equipamento Lunar iDXA GE, utilizado para mensuração 48 da densidade mineral óssea, B: Animal pronto para realização
da análise, C: Imagem do corpo do animal utilizando o aparelho densitométrico
Gráfico 1- Evolução do peso corporal 49
Gráfico 2- Ingestão hídrica 50
Tabela 1- Concentrações séricas de minerais e hormônios estudados 51 Tabela 2- Parâmetros biométricos e conteúdo mineral ósseo 52 do fêmur direito das ratas ao final do experimento
Tabela 3- Composição óssea, avaliada com auxílio do DXA 55 Tabela 4- Quantidade de tecido gordo corporal total e no tronco 58 Tabela 5- Quantidade de tecido magro corporal total e no tronco 59
Acetil-Coa – Acetil coenzima A AG – Ácido graxo
AHA- American Heart Association CCK - colecistoquinina
cm2 - Centímetro quadrado CMO – Conteúdo Mineral Ósseo
DBP – Proteína de Ligação ao DNA ( Binding Protein) DXA - Dual Energy X-Ray Absorptiometry
DMO – Densidade Mineral Ósseo ECM – Matriz extracelular
ELISA – Imunoabsorção Ligado a Enzimas EPM – Erro Padrão da Média
FAO- Food and Agriculture Organization g – Grama
g/cm2 - Grama por centímetro quadrado GH – Growth Hormone
HP - Hiperprotéico
IAA – Anticorpo Anti-Insulina
IGF – Fator de Crescimento Semelhante à Insulina IGFBP – Insulin-like growth factor binding protein IL-6 - Interleucina- 6
Kcal – Quilocalorias mEq – Miliequivalente mg – Miligrama
ml – Mililitro
NCEP – National Cholesterol Education Program
NHANES – National Health and Nutrition Examination Survey ng - Nanograma
nm – Nanômetro
OMS – Organização Mundial da Saúde Pi – Fosfato inorgânico
PTH – Hormônio Paratireóide ou Partormônio Run X2 – Runt-related Transcription factor 2 TNF- - Fator de necrose tumoral alfa VDR – Receptor de Vitamina D
WHO – World Health Organization μl - Microlitro
1 INTRODUÇÃO 17
2 REVISÃO DE LITERATURA 19
2.1 Obesidade - Um problema mundial 19
2.2 Dietas da Moda 20
2.3 A “Dieta da proteína” do doutor Atkins 20
2.3.1 Dieta da proteína e perda de peso 22
2.3.2 Dieta da proteína e cetoacidose 23
2.4 O tecido ósseo 25
2.4.1 Manutenção do tecido ósseo 29
2.5 Efeito da Dieta Atkins no tecido ósseo 31 3 JUSTIFICATIVA 34 4 OBJETIVOS 35 4.1 Objetivo geral 35 4.2 Objetivos específicos 35 5 METODOLOGIA 36 5.1 Animais 36 5.2 Comitê de ética 36
5.3 Formação dos grupos 36
5.4 Preparo da ração 37
5.5 Coleta de dados 40
5.5.1 Peso corporal 40
5.5.2 Consumo de ração 41
5.5.3 Ingestão hídrica 41
5.6 Determinação do ciclo estral das ratas 41 5.7 Sacrifício e coleta de sangue e fêmur 43
5.8 Processamento das amostras 44
5.8.1 Determinação da concentração sérica de cálcio, 44 magnésio e fósforo
5.8.2 Determinação da concentração de insulina, 44 osteocalcina e paratormônio
6 RESULTADOS 49
7 DISCUSSÃO 60
8 CONCLUSÃO 65
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 66
APÊNDICE A – Produção Científica 74
APÊNDICE B – Publicação em Periódico 75
1 INTRODUÇÃO
A obesidade tem sido amplamente reconhecida como um dos principais problemas de saúde pública, que leva a inflamação, que parece estar diretamente envolvida na patogênese do diabetes tipo 2, hipertensão, dislipidemia, aterosclerose, osteoartrite, apneia do sono, problemas respiratórios e algumas formas de câncer (YE & KELLER, 2010).
A restrição da ingestão alimentar e realização de atividade física tem sido sugeridas como a chave para alcançar o objetivo da manutenção de peso corporal adequado (SONG et al., 2010). Entretanto, a indústria do emagrecimento é um próspero e lucrativo negócio em muitos países. Muitas pessoas fazem dieta e se preocupam com a forma física porque são influenciadas pela mídia que impõe certos padrões de beleza, associado a uma sociedade que almeja um corpo magro como o ideal. Entretanto, não se preocupam com a qualidade e o impacto dessas dietas na saúde (DERENE & BERESIN, 2006; TRUBY et al., 2008).
Devido ao crescente aumento epidêmico da obesidade, suportado por um ambiente rico em alimentos gordurosos, muitos pacientes e profissionais de saúde estão interessados em dietas populares como estratégia individualizada para redução de peso e prevenção de doenças (DANSINGER et al., 2005).
Assim, acompanhando a “epidemia da obesidade”, está aumentando o interesse em dietas populares, que variam enormemente na quantidade de proteínas e carboidratos. A dieta do Dr. Atkins é uma das dietas hiperproteicas mais conhecidas e uma das mais extremas em promover a ingestão de elevada quantidade de proteínas e gorduras e pequena quantidade de carboidratos. É uma das mais controvertidas para a saúde por ter alto teor de gordura saturada e colesterol e poucas fibras, antioxidantes e micronutrientes.
Alguns estudos mostram que os efeitos benéficos deste tipo de dieta sobre os níveis lipêmicos e resistência a insulina ocorrem pela diminuição do peso corporal e não devido às mudanças severas na distribuição da energia provenientes dos lipídios, carboidratos e proteínas. Portanto, as dietas hiperproteicas não devem ser recomendadas, pois elas são deficientes em uma variedade de nutrientes essenciais necessários à nutrição adequada, o que pode predispor o organismo ao desenvolvimento de inúmeras doenças crônicas não transmissíveis, inclusive a
osteoporose (ST JEOR et al., 2001; JOHNSTON et al., 2004; CARAPETIS & PHILIPS, 2006).
O problema da obesidade tem resultado em várias estratégias dietéticas para perda de peso. No entanto, o efeito específico destas dietas na saúde cardiovascular e óssea carecem de mais estudos.
Alguns estudos mostraram diminuição do risco de fratura com maior ingestão de proteínas, enquanto outros encontraram tendência oposta, em particular com as proteínas de origem animal (DARGENT-MOLINA et al., 2008). A densidade mineral óssea é muito afetada quando há carência principalmente de cálcio e vitamina D na dieta, carência esta que pode ocorrer não por deficiente ingestão, mas sim devido a fatores deste tipo de dieta, como o excesso de proteína e gordura, que podem reduzir sua absorção e aumentar sua eliminação renal, o que pode predispor os indivíduos ao desenvolvimento da osteoporose. A consequencia futura é a predisposição a fratura devido à fragilidade óssea, que contribuem para aumentar a mortalidade, com a baixa qualidade de vida, bem como um substancial custo direto e indireto para o setor público (MEDEIROS et al., 2002; LANGSETMO et al., 2010).
Os efeitos de dietas hiperproteicas sobre a estrutura óssea e o provável desenvolvimento de osteopenia e/ou osteoporose ainda necessita de mais estudos. Este estudo torna-se relevante à medida que se propõe a investigar os efeitos da “dieta da proteína” sobre o metabolismo ósseo, contribuindo para um melhor entendimento do efeito desta dieta neste tecido.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Obesidade – Um problema mundial
A obesidade é uma desordem metabólica caracterizada por excesso de armazenamento de gordura e reflete o desequilíbrio entre ingestão e gasto de energia (PAULA & ROSEN, 2010).
A obesidade atingiu níveis epidêmicos em todo o mundo (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2012B). Desde 1980, o número de indivíduos obesos no mundo mais que duplicou e estima-se que 2,8 bilhões de pessoas morram anualmente decorrente de estarem obesas ou com sobrepeso (WHO, 2012A). Dados da Pesquisa de Orçamento Familiar (IBGE, 2009) revelaram que 12,4% dos homens brasileiros estão obesos e 16,9% da população feminina encontram-se na mesma condição.
O aumento da população obesa eleva o custo da saúde e a perda de peso é benéfica para manter um corpo saudável (GARDNER et al., 2007). Indivíduos obesos apresentam maior risco de desenvolver doenças crônicas não transmissíveis como hipertensão arterial, doenças cardiovasculares, diabetes mellitus, dislipidemias, osteoartrites, entre outras enfermidades, levando a diminuição da qualidade e expectativa de vida. O desenvolvimento do excesso de peso e obesidade envolve múltiplos fatores observados, principalmente com as mudanças comportamentais do século XX, tais como hábitos de vida, consumo alimentar, características socioambientais, susceptibilidade genética e biológica (LINO et al., 2011; NOAKES et al., 2005).
O problema da obesidade tem resultado em várias estratégias dietéticas para perda de peso, e a adesão a dietas da moda tem se tornado cada vez mais frequentes e controversas. Vários livros sobre dietas estão disponíveis e também são notícias em revistas e debates televisivos. Muitas dietas da moda para perda de peso focam na redução ou exclusão de determinados macronutrientes. Existem poucos dados sobre o conteúdo de micronutrientes e adequação dessas dietas. Autoridades médicas tem demonstrado interesse e preocupação sobre o efeito específico destas dietas na saúde cardiovascular e óssea e na eficácia e segurança
de tais dietas e mais estudos são necessários (DANSINGER et al., 2005; GARDNER et al., 2010).
2.2 Dietas da Moda
Dietas populares tem se tornado cada vez mais prevalentes e controversas. Guias dietéticos para perda de peso (restrição energética, pobre em gordura, rico em carboidrato) têm sido contestados, particularmente por proponentes de dietas com pouco carboidrato. No entanto, há poucos estudos para avaliar efetivamente essas dietas (GARDNER et al., 2007).
Uma variedade de planos dietéticos é conhecida. Alguns planos minimizam a ingestão de carboidratos sem restrição de gordura e proteínas (dieta Atkins) (ATKINS, 1981), muitos modulam o balanço de macronutrientes e carga glicêmica, dieta Zone (CHEUVRONT, 2003) e outras impõem a restrição de gordura (dieta Ornish) (ALMEIDA et al., 2009).
2.3 A “dieta da proteína” do doutor Atkins
Dentre os vários tipos de plano alimentar a mais popular é a dieta do doutor Atkins (dieta da proteína). Provavelmente a popularidade desta dieta se deve a preocupação cada vez maior da sociedade com a imagem de um corpo magro; e a “dieta da proteína” do doutor Atkins promove rápida perda de peso (GARDNER et al., 2010). Pesquisadores justificam sua utilização devido ao fato de que a alta ingestão de carboidrato refinado, especialmente açúcar branco, causa hiperestimulação de insulina e o resultado é uma fome incontrolável, além de favorecer a lipogênese e consequentemente a estocagem de gordura (RILEY & COVENEY, 2004). O Dr. Atkins afirma que a dieta é eficaz na promoção de perda de peso, apesar do livre consumo de carnes com gorduras, manteiga e outros produtos com alto teor de gorduras, restringindo apenas a ingestão de carboidratos para menos de 30 g por dia (ASTRUP et al., 2004).
A dieta do Dr. Atkins ou “dieta da proteína” é uma das dietas hiperproteicas mais conhecidas pela sociedade, promovendo o aumento extremo do consumo de proteínas (25-30%) e lipídeos (55-65%) e minimizando a ingestão de carboidratos (<
5%). Em seu livro “A Revolucionária dieta do Doutor Atkins” (Atkins, 1981), Robert Atkins descreve que o objetivo da dieta é restringir quase que totalmente a ingestão de carboidratos até o ponto em que a gordura corporal seja mobilizada e utilizada como combustível energético. Tal dieta, pobre em micronutrientes e fibras, e com altos teores protéicos e de lipídios está em total desacordo com o preconizado pela FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS AND WORLD HEALTH ORGANIZATION (FAO/OMS, 2002) e pelo estudo do NATIONAL HEALTH AND NUTRITION EXAMINATION SURVEY (NHANES III, CDC, 1988-1994), onde os macronutrientes são distribuídos da seguinte forma: proteínas (10-15%), carboidratos (55-75%) e lipídeos (15-30%), com baixo teor de gorduras trans e saturadas. O quadro 1 mostra as recomendações da American Heart Association (AHA) e da National Cholesterol Education Program (NCEP).
No entanto, alguns estudos observaram melhoras no perfil lipídico, melhor composição corporal, melhor homeostase glicêmica, com melhora na sensibilidade insulínica, ganho de massa magra e melhora na pressão arterial em indivíduos que seguiram dieta com baixo teor de carboidratos (APARICIO et al., 2010; PÉREZ-GUISADO, 2008; NOAKES et al., 2005).
Quadro 1- Comparação entre a dieta da proteína e as recomendações da American Heart Association (AHA) e da National Cholesterol Education Program (NCEP)
Fonte: Kappagoda et al., 2004.
Dieta Atkins
(dieta da proteína)
NCEP III AHA guidelines
Calorias(kcal) 1600 1600 1600 Carboidratos (g) 22 (5%) 220 (55%) 220 (55%) Proteínas (g) 146 (35%) 60 (15%) 28-72(12%) Gordura (g) 104 (59%) 53 (30%) 53 (30%) gordura saturada (g) 47 (26%) < 7 18 (<10%) Colesterol (mg) 924 <200 <300 fibra dietética (g) 4 20-30 > 25
2.3.1 “Dieta da proteína” e perda de peso
As dietas ricas em proteínas são consideradas mais eficazes na redução e manutenção do peso do que outras dietas com maior proporção de carboidratos ou gorduras, não só devido ao maior custo de energia de absorção de nutrientes, processamento e armazenamento, mas também devido ao seu efeito sobre a saciedade (MERO et al., 2010). O efeito das proteínas na saciedade pode estar associado às alterações fisiológicas resultante da ingestão desse macronutriente. O excesso de aminoácidos na corrente sanguínea, observada após a ingestão das proteínas estimula a liberação de hormônios anorexígenos que agem na saciedade. No lúmen intestinal, a presença da proteína e o aumento da concentração de aminoácidos após o processo digestivo, estimulam a secreção da colecistoquinina (CCK), favorecendo a diminuição da ingestão alimentar.
O gasto de energia na digestão e metabolização é maior com o consumo de proteínas de origem animal que contêm grandes quantidades de aminoácidos essenciais do que com as proteínas de origem vegetal, devido ao efeito térmico dos nutrientes (KELLER, 2011; PAIVA et al., 2007).
O aparente paradoxo de que a ingestão em livre demanda de alimentos ricos em proteínas e gordura produz perda de peso, pode ser devido a severa restrição de carboidratos que esgotam os estoques de glicogênio, levando a excreção de água (ASTRUP et al., 2004). Cada grama de glicogênio hepático é mobilizada com 2 a 3g de água, enquanto a degradação de cada grama de glicogênio muscular corresponde a 3 a 4g de água.
A natureza cetogênica da dieta e o alto teor de proteínas saciogênicas, reduz a ingestão de alimentos espontaneamente ou as escolhas alimentares limitadas levam à diminuição da ingestão de energia (SHILS, 2009; OLIVEIRA et al., 2003; ASTRUP et al., 2004). Farnsworth et al. (2003) relatam que os efeitos favoráveis na perda de peso corporal das dietas com maior proporção de proteína e menor de carboidratos foram observados em alguns estudos que adotaram a restrição energética como forma de tratamento para redução de peso.
2.3.2 “Dieta da proteína” e cetoacidose
O baixo teor de carboidratos na dieta leva à cetose (daí o nome da dieta cetogênica). Com a diminuição dos carboidratos da dieta ocorre uma alteração de substrato energético e a gordura passa a ser a principal fonte energética para os processos vitais. Os triacilgliceróis presentes no tecido adiposo são degradados, através da lipólise, gerando ácidos graxos e glicerol. O glicerol será utilizado na gliconeogênese pelo fígado para a produção de glicose e manutenção dos níveis glicêmicos (Marzzoco & TORRES, 2007). Através da circulação, a gordura, sob a forma de ácidos graxos (AGs) associados a lipoproteínas ou a albumina, tanto da dieta como as estocadas no tecido adiposo, chegam até os diferentes tecidos corporais, principalmente o músculo, onde serão oxidados no processo de β-oxidação nas mitocôndrias, formando acetil-CoA que pode seguir dois caminhos: 1) alimentar o ciclo de Krebs para produção de energia e 2) ser direcionado para a via de produção de corpos cetônicos ((PÉREZ-GUISADO et al., 2008; MARZZOCO & TORRES, 2007).
O acúmulo de acetil-coA no citosol das células hepáticas originam os corpos cetônicos (β-hidroxibutirato, acetoacetato e acetona) (Figura 1). Os corpos cetônicos no sangue ocorrem como uma resposta natural ao exercício, ao jejum prolongado e a dietas com alto teor de proteínas e gordura e baixo teor de carboidratos. A principal função dos corpos cetônicos é sevir como principal substrato energético para outros tecidos como o cérebro, os rins, o coração e o músculo esquelético. O uso prolongado de dietas cetogênicas leva à maior produção de cetonas que pode levar a cetonemia, com excreção de cetonas no hálito e na urina. A excreção pelos rins de cetonas é acompanhada pela eliminação de sódio, o que causa um aumento da diurese e diminuição do pH sanguíneo (PÉREZ-GUISADO et al., 2008; JOHNSTON et al., 2006).
2.4 O TECIDO ÓSSEO
O tecido ósseo é altamente organizado e é o constituinte principal do sistema músculo-esquelético. O osso é composto por células mesenquimais inclusas dentro de uma abundante matriz extracelular. Tem por função sustentar partes moles, proteger órgãos, armazenar íons, apoiar músculos, produzir células sanguíneas, revestir superfícies articulares onde absorve choques, facilitar deslizamentos e é essencial para a formação e crescimento dos ossos longos (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2008; STEVENS & LOWE, 2004;) (Figura 2).
É um tipo especializado de tecido conjuntivo formado por células e material extracelular calcificado. Diferencialmente dos outros tecidos, a matriz óssea contém
mineral que confere ao tecido grande resistência e rigidez. Juntamente com o tecido ósseo, o tecido cartilaginoso compõe o esqueleto, sendo
uma forma especializada de tecido conjuntivo de consistência rígida. A cartilagem é composta de células chamadas condrócitos e de uma matriz extracelular altamente especializada; é um tecido avascular, sendo nutrida pelos capilares do conjuntivo envolvente (pericôndrio) ou através do líquido sinovial das cavidades articulares, como no caso da cartilagem articular (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2008; STEVENS & LOWE, 2004).
O osso possui um elaborado suprimento sanguíneo e também contém nervos, vasos sanguíneos e linfáticos. O periósteo é constituindo por duas camadas, uma fibrosa externa e uma interna mais celular e vascular; o periósteo cobre as superfícies ósseas externas e participa na consolidação das fraturas (CROCI et al., 2003; STEVENS & LOWE, 2004).
Os dois principais tipos de tecido ósseo são o trabecular, uma estrutura de aspecto esponjoso, e o cortical, mais sólido e formado por osteons ou sistemas Haversianos, que é uma estrutura em forma de tubo. Além das diferenças estruturais, os dois tipos diferem também quanto a outros aspectos como a distribuição espacial das células, densidade da matriz mineralizada, distribuição dos vasos sanguíneos e área ocupada pela medula óssea. Sobre a sua superfície movem-se as células ósseas. O osso trabecular tem maior superfície em relação ao volume sendo metabolicamente mais ativo que o cortical. As diáfises dos ossos longos possuem praticamente só osso cortical. As metáfises por sua vez e a maioria dos ossos curtos e planos apresentam paredes relativamente finas de osso cortical
com grandes volumes de osso esponjoso. Estas diferenças na distribuição de osso cortical e esponjoso causam diferenças na consolidação óssea (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2008; CROCI et al., 2003; STEVENS & LOWE, 2004).(Figura 3).
Figura 2- Representação esquemática da parte interna de um osso
longo. Fonte: Junqueira & Carneiro, 2008.
Figura 3 - A: osso cortical, B:osso trabecular
Fonte: Marcu et al., 2011; Fatorre et al., 2010; Wehrli, 2007.
A matriz extracelular (ECM) é subdividida em parte inorgânica e orgânica. A matriz orgânica é principalmente constituída pelo colágeno tipo I (cerca de 95%).
Este dá ao osso uma grande resistência às forças tensionais (STEVENS & LOWE, 2004). A parte inorgânica contém predominantemente cálcio e fósforo, que aparecem na forma de cristais de hidroxiapatita depositado na matriz colagenosa. Cálcio e proteínas são os principais componentes do tecido ósseo. Por peso, o tecido ósseo é formado por 70% de minerais, 8% de água e 22% de proteínas. As células importantes no osso são os osteoclastos (responsáveis pela reabsorção) e os osteoblastos (responsáveis pela deposição de tecido ósseo) (SINGH et al., 2012; PRENTICE et al., 2006).
Uma característica notável do osso é que é o único tecido que contém um tipo de célula, o osteoclasto, que tem origem nas células troncos hematopoiéticas conhecidas como monócitos, cuja função é reabsorver (destruir) o tecido hospedeiro. Isto não ocorre de forma aleatória, mas sim num contexto de uma verdadeira função homeostática, que é chamado de modelagem óssea durante a infância e remodelação durante a idade adulta. Esta função caracteriza-se por fases alternadas de destruição pelos osteoclastos e formação de osso por osteoblastos (KARSENTY & FERRON, 2012; KRUGER et al., 2010).
Os osteoblastos são responsáveis pela formação óssea, são originárias do estroma medular das células ósseas (KRUGER et al., 2010). Sintetizam a osteocalcina que é um marcador de diferenciação osteoblástica e é a mais abundante proteína óssea não colágena. É carboxilada em 3 resíduos de ácido glutâmico, que confere à proteína uma elevada afinidade para os minerais tais como os cristais de hidroxiapatita presente na matriz óssea mineralizada (Figura 4). A osteocalcina também induz a secreção de insulina e aumenta a sensibilidade à insulina e gasto de energia, sendo a forma não carboxilada a que está ativa nas células β do pâncreas (KARSENTY & FERRON, 2012). Também age aumentando marcadores ósseos anabolizantes, incluindo a síntese de colágeno, produção de fosfatase alcalina, captação de glicose e aumento da proliferação e diferenciação celular (FULZELE & CLEMENS, 2012; WONGDEE & CHAROENPHANDHU, 2011).
O metabólito ativo da vitamina D 1,25-dihidroxicolecalciferol [1,25(OH)2D]3, é considerado o principal regulador da síntese de osteocalcina. A maior parte da osteocalcina recém-formada continua vinculada ao osso, mas uma pequena fração da proteína é liberada no sangue (NDIAYE et al., 1995; PARHAMI et al., 2001). Os osteoblastos possuem receptores para estrogênios, que age sobre o metabolismo ósseo, promovendo a formação óssea e aumentando o número e
função dos osteoblastos e, por outro lado diminui a reabsorção, por apoptose dos osteoclastos. Atuam também no crescimento, diferenciação e função de muitos tecidos, portanto a diminuição de estrogênios leva a redução da massa óssea (AMADEI et al., 2006) (Figura 4).
O fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I) é um importante regulador do metabolismo ósseo, particularmente da formação óssea osteoblástica (CHEVALLEY et al., 1998). O IGF-I é sintetizado pelo fígado e pelos osteoblastos e são encontrados em concentrações elevadas na matriz óssea. Também aumentam o número e função dos osteoblastos, favorecendo a síntese de colágeno. Circulam ligados a proteínas de ligação (IGFBP), que por sua vez podem ter efeitos inibidores ou estimuladores sobre o osso. Os IGFs são regulados por hormônios e fatores de crescimento locais, assim o GH, estrogênio e progesterona aumentam sua produção, enquanto os glicocorticóides inibem (HERNÁNDEZ-GIL et al., 2006).
Figura 4- Remodelagem óssea (adaptado).
Fonte: Century Center of Excellence (COE) Program
Disponível em <http://www.coe-stemcell.keio.ac.jp/member/img/member_img/zu_matsuo2.jpg>
Pesquisadores mostram que a insulina, também, está envolvida na ação osteogênica por induzir o aumento da proliferação e diferenciação celular, atividade de fosfatase alcalina e expressão do colágeno tipo I e osteocalcina em osteoblastos de humanos (WONDEE & CHAROENPHANDHU, 2011).
A união dos dois processos permite a renovação e remodelação ósseas, e é mantido por toda a vida adulta do indivíduo, sendo responsável pela renovação do
esqueleto e mantendo sua integridade anatômica e estrutural. Este mecanismo é regulado por diversos fatores, como mecanismos regulatórios intracelulares, influência hormonal, fatores locais e externo. Condições como idade, doenças ósteo-metabólicas, mobilidade diminuída e ação de algumas drogas podem alterar este equilíbrio entre formação e reabsorção, levando ao predomínio de um sobre o outro (AMADEI et al., 2006).
2.4.1 Manutenção do tecido ósseo
O osso sofre contínua remodelação óssea e muitos nutrientes são essenciais para o crescimento, desenvolvimento e manutenção do esqueleto. A formação e manutenção óssea requer adequado suprimento de energia, aminoácidos, minerais (cálcio, fósforo, magnésio e zinco) e de outros íons (cobre e manganês), carbonato, citrato e vitaminas (C, D e K) que estão envolvidas no cristal e formação de colágeno, cartilagem e metabolismo ósseo e/ou homeostase do cálcio e fosfato (DAWSON-HUGHES, 2003; PRENTICE et al., 2006).
O cálcio é essencial para a homeostase óssea. O funcionamento correto do esqueleto se baseia em níveis normais de cálcio no soro, mas também o osso desempenha um papel importante na manutenção da homeostase do cálcio sistêmico. Noventa e nove por cento do cálcio corporal é armazenado no osso, onde contribui para suas propriedades mecânicas e estruturais. Por conseguinte, o osso necessita de um fornecimento suficiente de cálcio para manter a integridade do esqueleto. Esta fonte de cálcio depende, principalmente, da absorção de cálcio no intestino e da reabsorção de cálcio nos rins. A falha nesse processo pode ocasionar perda de massa óssea (CASHMAN, 2007).
A manutenção do cálcio é regulada por 3 principais mecanismos: 1) absorção intestinal, 2) reabsorção renal e 3) turnover ósseo. Estes são regulados pelo hormônio da paratireóide (PTH), pela 1,25–dihidroxi vitamina D [1,25 (OH)2D] e pela calcitonina. A maioria do cálcio total do corpo (> 99%) está presente no esqueleto como complexo cálcio-fosfato, primariamente como hidroxiapatita, que é responsável por muitas propriedades materiais do osso (PEACOCK, 2010).
Os hormônios calciotróficos, PTH, calcitriol e a calcitonina agem em seus órgãos efetores, principalmente osso, intestino e rins, alterando o transporte dos íons cálcio para o interior ou para o exterior do fluido extracelular, modulando desta forma a manutenção da homeostase desse íon (MIYASHIRO & HAUACHE, 2002).
O PTH controla a homeostase do cálcio através da ação direta sobre os ossos e rins e indiretamente no intestino. Produzido pelas glândulas paratireóides que respondem à redução dos níveis séricos de cálcio, favorecendo a reabsorção. Age mobilizando o cálcio do tecido ósseo para o espaço extra-celular, atua nos rins, aumentando a atividade da enzima 1α-hidroxilase e, assim, ativando a vitamina D pela inclusão de uma hidroxila do carbono 1 convertendo a vitamina na forma de 1,25-diidroxi-vitamina D. Esta vitamina estimula a síntese de uma proteína nos enterócitos, chamada calbindina que atua facilitando a absorção de cálcio através do trato gastrointestinal; atua também nos túbulos renais otimizando a reabsorção de cálcio (OLIVEIRA & FISBERG, 2003).
Discreta queda dos níveis circulantes de cálcio é suficiente para aumentar a secreção de PTH em 200 a 300%. Diversas evidências sugerem que o efeito anabólico do PTH depende não só de sua ação direta sobre osteoblastos e precursores, como também da participação de fatores de crescimento como o IGF-I O estímulo de formação envolve incremento de diferenciação de precursores de osteoblastos, proliferação e ação antiapoptótica de osteoblastos. Em parte esses efeitos dependem do aumento de expressão do fator de transcrição RunX2, um elemento chave no processo de diferenciação dos osteoblastos (DE-PAULA, 2009).
O hormônio precursor da vitamina D3 ou calcitriol, pode ser obtido pela dieta ou a partir do 7-desidrocolesterol na pele através de uma reação não-enzimática porém dependente da luz ultra violeta (UV). A vitamina D3 é então transportada para o fígado, onde é hidroxilada e origina 25-hidroxivitamina D3 (25D). A forma 25D circula no plasma ligada a proteínas de ligação (DBP), a vários tecidos-alvo para exercer sua ação endócrina que são mediadas pelo receptor de vitamina D (VDR). Grande parte do calcitriol necessário ao metabolismo sistêmico é sintetizado nas células dos túbulos renais proximais. A DBP, junto com seus ligantes, apresenta uma alta taxa de recaptação pelas células dos túbulos proximais, o que evita perda urinária dos metabólitos do grupo da vitamina D e concentra a 25(OH) nos túbulos renais, onde será necessário para a conversão em 1,25(OH)2D. Algumas das funções da 1,25D3 envolve a regulação e metabolismo do cálcio e fosfato, elevando
os níveis destes íons no sangue via absorção intestinal e reabsorção renal para facilitar a mineralização óssea, bem como ativando a reabsorção óssea como parte do ciclo de remodelagem esquelética (HAUSSLER et al., 2012; CASTRO, 2011).
Em contraste, na hipercalcemia ocorre a supressão da secreção de PTH e consequente redução da síntese de 1,25(OH)2D3, com resultante diminuição da reabsorção renal de cálcio, da mobilização do cálcio do osso e da absorção do cálcio pelo intestino. A hipercalcemia também estimula diretamente a secreção de calcitonina através de um mecanismo de feedback positivo. A calcitonina é um hormônio que possui uma atividade hipocalcêmica e exerce sua função reduzindo o fluxo de cálcio do osso para o fluido extracelular e aumentando a excreção de cálcio. É um hormônio produzido nas células C ou parafoliculares da tireóide e é inibidor da reabsorção óssea pela redução do número e da atividade dos osteoclastos (HERNÁNDEZ-GIL et al., 2006; MIYASHIRO & HAUACHE, 2002).
2.5 Efeito da dieta Atkins no tecido ósseo
Na idade adulta, a proteína não pode ser armazenada nos tecidos do corpo por simples aumento da quantidade de proteínas exógena. Os aminoácidos excedentes são utilizados como combustível metabólico e são oxidados, ao contrário da glicose e dos substratos de ácidos graxos, que são armazenados no fígado e músculo esquelético e tecido adiposo, respectivamente (KELLER, 2011).
Evidências sugerem que a proteína dietética possa ter influência importante na saúde do esqueleto, mas a natureza de seu papel permanece controversa. Dietas ricas em proteína aumentam a perda do osso devido ao ácido produzido pelo catabolismo da proteína e pela necessidade consequente para que o cálcio deixe o esqueleto a fim de servir como um agente tampão da acidez elevada no sangue (MORAIS & BURGOS, 2007; RYLANDER et al., 2006).
O consumo excessivo de proteína pode afetar prejudicialmente a saúde renal e óssea. Como as proteínas animais são ricas em aminoácidos sulfurados, íons de amônia produzidos a partir desses aminoácidos levariam, também, à redução do pH sanguíneo, induzindo a uma acidose metabólica de baixo grau, levando a hipercalciúria por vários mecanismos. Estes incluem a diminuição da reabsorção tubular renal de cálcio, aumentando a reabsorção óssea mediada por células e
dissolução direta físico-químicas do osso. Em decorrência, levaria à perda de carbonato e citrato de cálcio ósseo, mobilizados para neutralizar esse excesso de ácidos. Em teoria, o excesso do consumo de proteína é acidogênica, resultando em aumento da reabsorção óssea. Os rins são os principais responsáveis por manter esta compensação (MARDON et al., 2008; MORAIS & BURGOS, 2007; RYLANDER et al., 2006).
Os efeitos da dieta sobre a excreção urinária de ácido e cálcio não depende apenas da quantidade de proteínas, mas também pode ser modificado por outros componentes do alimento, tais como potássio e bicarbonato presente em frutas e legumes. A deficiência dessas bases na dieta aumenta a carga de ácidos sistêmicos produzidos por proteínas. Consequentemente, o resultado da alta ingestão de proteínas e dieta deficiente em frutas e vegetais é a geração de acidose metabólica crônica, que, embora de baixo grau, tem efeitos deletérios sobre o corpo. As consequências metabólicas de tais dietas incluem alterações do balanço ácido-base e eletrolítico, do metabolismo ósseo, da função renal e da função endócrina (LÓPES-LUZARDO, 2009; KERSTETTER et al., 2003).
Noakes et al.(2005) avaliaram o efeito de dietas hiperproteicas e hiperglicídicas em mulheres, não encontrando redução no cálcio urinário e não comprovando efeito deletério na função óssea nesse estudo. Ressalta-se que foram consumidos vegetais durante a dieta e isso provavelmente impediu a perda de cálcio devido ao efeito alcalinizante dos vegetais. No entanto, alguns estudos mostram alterações decorrentes da acidose metabólica crônica no metabolismo ósseo, sugerindo perda de cálcio nos ossos, efeitos celulares em osteoblastos e osteoclastos e desordem na mineralização da matriz óssea (JEHLE & KRAPF, 2010).
Se o osso for mobilizado para transportar apenas 1 mEq de ácido a cada dia, 15% do cálcio total do corpo em uma pessoa média seria perdida em uma década. Evidências sugerem que a proteína dietética possa ter uma influência importante na saúde do esqueleto, mas a natureza do seu papel envolvido na calciúria permanece controverso, e o impacto em longo prazo de dietas ricas em proteínas sobre a saúde óssea ainda é obscuro (PROMISLOW et al., 2002; DARGENT-MOLINA et al., 2008). Por outro lado, a proteína dietética também poderia afetar a integridade do esqueleto através de sua influência sobre a produção do IGF-I, que exerce vários efeitos positivos sobre o esqueleto (PROMISLOW et al., 2002). O aumento do nível
circulante de IGF-I pode ser observado em resposta à ingestão aumentada de proteínas. Essa estimulação do IGF-I tem um efeito favorável sobre a economia mineral óssea por dupla ação renal. O IGF-I aumenta a produção de 1,25D, a forma ativa da vitamina D. A 1,25D por sua vez, estimula a absorção intestinal de cálcio e de fosfato inorgânico (Pi). A segunda ação de IGF-I ao nível renal é aumentar a reabsorção tubular de Pi. Através desta atividade dupla do IGF-I a concentração de cálcio e de Pi aumenta no compartimento sistêmico extracelular e, assim, influencia positivamente o processo de mineralização óssea (CHEVALLEY et al., 1998).
Além disso a dieta rica em gordura, particularmente a gordura saturada como a encontrada na dieta Atkins, pode ter importante efeito na saúde óssea. Estudos em animais indicam que estas dietas podem afetar adversamente o osso. Uma variedade de mecanismos estão envolvidos, como alterações na absorção do cálcio, síntese de prostaglandinas, formação de osteoblastos e oxidação de lipídios. A gordura pode reduzir a absorção intestinal de cálcio e, possivelmente, eleva a excreção renal. Dietas hiperlipídicas aumentam a excreção intestinal e urinária de cálcio e forma sabões insolúveis de cálcio no intestino resultando no aumento da sua excreção fecal (MORAIS & BURGOS, 2007; CORWIN et al., 2006).
3 JUSTIFICATIVA
Com o crescente aumento da população com excesso de peso é cada vez maior o interesse por dietas populares. A “dieta da proteína” é uma das mais procuradas para perda de peso, é rica em proteínas e lipídios, porém o excesso desses macronutrientes e a quantidade reduzida de carboidratos parece afetar a saúde óssea.
A literatura ainda é contraditória quanto ao efeito do excessivo consumo de proteínas e a manutenção e integridade do tecido ósseo. Alguns pesquisadores, ao contrário do pressuposto que dietas ricas em proteínas prejudicam o osso, verificaram em observações epidemiológicas associação da alta ingestão de proteína com anabolismo ósseo.
É bem estabelecido que uma dieta equilibrada é essencial para o bom funcionamento do organismo e para prevenção de doenças, entretanto o efeito de dietas populares, incluindo a dieta do Dr. Atkins sobre o organismo ainda carece de mais estudos.
Assim, esse estudo tem o propósito de avaliar o efeito da Dieta da proteína sobre o metabolismo ósseo de ratas Wistar adultas.
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
Avaliar possíveis alterações no metabolismo ósseo de ratas Wistar alimentadas com a “dieta da proteína”.
4.2 Objetivos específicos
Avaliar a variação de peso corporal dos animais;
Determinar a concentração sérica e óssea de cálcio, fósforo e magnésio; Determinar a concentração sérica de Insulina, Osteocalcina e
Paratormônio;
Observar modificações na densidade mineral óssea e no conteúdo mineral ósseo das ratas;
Avaliar possíveis associações entre os indicadores bioquímicos e a densidade e o conteúdo mineral ósseo.
5 METODOLOGIA
5.1 Animais
Foram utilizados, 28 Rattus novergicus, adultos, com 90 dias de idade, fêmeas, Wistar albino, pesando em torno de 200g, provenientes do Laboratório de Nutrição Experimental (LabNE) do Departamento de Nutrição e Dietética da Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro da Universidade Federal Fluminense (UFF). Os animais foram mantidos em gaiolas individuais, em ambiente com temperatura controlada, em torno de 22°C ± 2°C e ciclo claro/escuro de 12 em 12 horas (Figura 5).
5.2 Comitê de Ética
O presente projeto foi submetido ao Comitê de ética responsável por pesquisas em animais de laboratório da Universidade Federal Fluminense (UFF), tendo sido aprovado com protocolo de pesquisa de número 0027/08. Todos os animais foram manipulados de acordo com os princípios éticos adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), anexo1.
5.3 Formação dos grupos
Os animais foram divididos em quatro grupos (n= 7/grupo):
1- Grupo Hiperproteico 1 (HP1) - recebeu ração pobre em carboidrato (4,73g), rica em proteína (49,77g) e lipídios (11,97g), com livre consumo;
2- Grupo Hiperproteico 2 (HP2) – recebeu ração idêntica ao grupo experimental HP1, entretanto com redução de 30% da ingestão alimentar*. 3- Grupo controle 1 (C1) - recebeu ração à base de caseína, com livre consumo, balanceada atendendo às necessidades nutricionais, segundo a AIN 93M (proteína= 11,26g; carboidrato= 59,17g; lipídio= 4,77g).
4- Grupo controle 2 (C2) - recebeu ração idêntica ao grupo controle 1 (caseína), entretanto com redução de 30% da ingestão alimentar*.
* A restrição foi realizada em função da diminuição da oferta de ração aos animais, totalizando oferta de 70% do consumo diário dos grupos HP1 e C1.
Figura 5- Gaiolas com os ratos utilizados no experimento. Biotério do LabNE.
5.4 Preparo da ração
As rações foram preparadas no LabNE da Faculdade de Nutrição da UFF. Para a ração à base da “dieta da proteína” foi necessário o preparo da carne. Utilizou-se carne bovina moída (acém), adquirida no comércio local, desidratada em estufa e ventilada a temperatura de 65ºC ± 2°C por 24 horas. Após, esta foi retirada das bandejas e triturada em liquidificador industrial até a obtenção do pó, sendo em seguida peneirado.
Os ingredientes utilizados no preparo das respectivas rações foram pesados, separadamente, em balança eletrônica da marca BioPrecisa®, homogeneizados em batedeira industrial até obterem consistência adequada (Quadro 2). Posteriormente, as mesmas foram moldadas em forma cilíndrica e colocadas em estufa ventilada da marca Espectru® a 65ºC ± 2°C por 24 horas para desidratação.
A formulação das rações é apresentada no Quadro 2 e a composição nutricional nos Quadros 3 e 4.
Quadro 2- Formulação das rações Controle e Hiperproteica (g/100g de ração).
DIETA CONTROLE DIETA HIPERPROTEICA
INGREDIENTES Grama Grama
CARNE (PÓ) 0 64,07 LEITE (PÓ) 0 20,0 CASEÍNA 14,0 0 AMIDO 58,2 0 AÇÚCAR 10,0 0 ÓLEO 4,0 4,0 FIBRA 5,0 5,0 MIST MINERAIS 3,5 3,5 MIST VITAMINAS 1,0 1,0 L-CISTINA 1,8 1,8 COLINA 2,5 2,5 ÁGAR 0 1,5 TOTAL 100g 100g
Quadro 3 – Composição da ração controle utilizada no experimento (g/100g de ração).
Ingredientes Quantidade Glicídio Proteína Lipídio Fibras
Caseína 14,0% - 11,2 - - Amido 59,07% 47,43 0,06 0,77 - Óleo 4,0% - - 4,0 - Celulose 5,0% - - - 5,0 Mix de vitaminas1 1,0% 0,97 - - - Mix de minerais2 Cálcio Fósforo Magnésio 3,5% 38,2 21,2 23,4 0,77 - - - B- Colina 0,25% - - - - L- Cistina 0,18% - - - - Açúcar 10,0% 10,0 - - - Total 100,0% 236,68 45,04 42,93 5,0 VET (kcal) 324,65 236,68 45,04 42,93
*%de proteína da caseína = 92,5% proteína/100 gramas de caseína
1
Mix de vitaminas (mg/Kg dieta): palmitato de retinol 2,4, colecalciferol 0,025, bissulfito sódico de
benadiona 0,8, biotina 0,22, cianocobalamina 0,01, riboflavina 6,6, hidrocloreto de tiamina 6,6 e acetato de tocoferol 100.
2
Mix de minerais (g/Kg dieta): sulfato de cobre 0,1, molibdato de amônio 0,026, iodato de sódio 0,0003, cromato de potássio 0,028, sulfato de zinco 0,091, hidrogenofosfato de cálcio 0,145, sulfato de ferro amoniacado 2,338, sulfato de magnésio 3,37, sulfato de manganês 1,125, cloreto de sódio 4, carbonato de cálcio 9,89 e diidrogenofosfato de potássio 14,75.
Quadro 4– Composição da ração hiperproteica utilizada no experimento (g/100g de ração).
Ingredientes Quantidade Glicídio Proteína Lipídio Fibras
Carne (pó) 64,07% - 47,54 7,94 - Leite desnatado (pó) 20,0% 2,99 2,23 0,03 - Óleo 4,0% - - 4,0 - Celulose 5,0% - - - 5,0 Mix de vitaminas1 1,0% 0,97 - - - Mix de minerais2 Cálcio Fósforo Magnésio 3,5% 44,8 15,3 17,4 0,77 - - - - - - - - - - - - - - - B- Colina 0,25% - - - - L- Cistina 0,18% - - - - Ágar 1,5% - - - 1,5 Total 100,0% 18,92 199,08 107,73 6,5 VET (kcal) 325,73 18,92 199,08 107,73 1
Mix de vitaminas (mg/Kg dieta): palmitato de retinol 2,4, colecalciferol 0,025, bissulfito sódico de
benadiona 0,8, biotina 0,22, cianocobalamina 0,01, riboflavina 6,6, hidrocloreto de tiamina 6,6 e acetato de tocoferol 100.
2
Mix de minerais (g/Kg dieta): sulfato de cobre 0,1, molibdato de amônio 0,026, iodato de sódio 0,0003, cromato de potássio 0,028, sulfato de zinco 0,091, hidrogenofosfato de cálcio 0,145, sulfato de ferro amoníacado 2,338, sulfato de magnésio 3,37, sulfato de manganês 1,125, cloreto de sódio 4, carbonato de cálcio 9,89 e diidrogenofosfato de potássio 14,75.
5.5 Coleta de dados
5.5.1 Peso corporal
O ensaio biológico teve a duração de 60 dias. Durante a experimentação os animais foram pesados em balança eletrônica da marca BioPrecisa®, uma vez por semana, para obtenção da variação do peso corporal, em gramas.
5.5.2 Consumo de ração
O controle da ração foi realizado da seguinte forma: para os grupos C1 e HP1 a ração foi ofertada em livre demanda, ou seja, consumiam à vontade. A partir do consumo destes grupos foi estipulado a quantidade de ração a ser ofertada para os grupos C2 e HP2 que receberam 70% do consumo, totalizando restrição alimentar
de 30%, sendo que a oferta de ração para estes grupos era realizada diariamente.
5.5.3 Ingestão hídrica
O controle da oferta de água foi realizado uma vez por semana para todos os grupos. Tanto a oferta quanto a sobra de ração (g) e água (mL) foram controladas para serem determinadas as quantidades ingeridas. Para pesagem da sobra de ração foi utilizada balança eletrônica da marca BioPrecisa® e para mensuração da sobra de água foi utilizada proveta graduada da marca LaborGlas® (expressa em ml).
5.6 Determinação do ciclo estral das ratas
Devido à atuação dos hormônios sexuais femininos sobre a fisiologia e metabolismo do organismo, determinou-se realizar o sacrifício dos animais que estivessem em uma fase específica (estro). Assim, foi verificado antes do sacrifício, o ciclo estral das ratas. Para tal foi realizado um lavado vaginal com soro fisiológico, usando pipeta automática de volume fixo (100 μL) (Figura 6). A secreção coletada foi colocada em lâminas de vidro para observação das células predominantes. As células da secreção vaginal foram observadas a fresco, em microscópio óptico em objetiva com aumento de 40X (Figuras 7 e 8). Somente os animais na fase estro eram sacrificados (AZEREDO, 2012).
Figura 6 - Método para realização do lavado vaginal em ratas. Manipulação do animal e coleta
da secreção vaginal. Técnica realizada no LabNE da Faculdade de Nutrição da UFF.
Figura 7- Visualização das lâminas a fresco ou coradas e caracterização das fases do ciclo
estral.
Figura 8 - Fotomicrografia do esfregaço vaginal corado com o início da fase Estro.
Representado pelo aumento do número e predominância de células
queratinizadas. Técnica realizada no LabNE da Faculdade de Nutrição da UFF.
5.7 Sacrifício e coleta de sangue e fêmur
Após 60 dias de experimento, os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal de cloridrato de xilazina associado a ketamina na proporção de 1:1, na dosagem de 0,1 ml/200g de peso corporal. Em seguida foi realizada coleta de sangue por punção cardíaca. Os animais que não vinham a óbito durante esta punção foram sacrificados em câmara de CO2. O sangue foi colocado em tubos
Vaccutainer sem anticoagulante e após a retração do coágulo foi centrifugado a 3000 rpm, durante 20 minutos, para obtenção do soro. E em seguida alíquotas foram separadas e congeladas a
-80ºC ± 2°C para análises posteriores.
O fêmur direito foi retirado logo após o sacrifício do animal e dissecado. Em seguida pesado em balança eletrônica da marca BioPrecisa® com precisão de 0,01g. O peso foi expresso em gramas (g). As medidas da distância entre as epífises e a largura do ponto médio da diáfise foram realizadas com paquímetro modelo LEE TOOLS (precisão 0,05mm) (Figura 9). Após a medição, foi utilizado para análise do conteúdo mineral ósseo e para análise densitométrica.
Figura 9- Fêmur dissecado, ao lado paquímetro utilizado para a medição.
As carcaças dos animais foram embaladas em saco plástico e congeladas até o seu recolhimento pela empresa especializada em retirada de material hospitalar.
5.8 Processamento das amostras
5.8.1 Determinação da concentração sérica de cálcio, magnésio e fósforo
As concentrações de cálcio, magnésio e fósforo sérico foram determinadas por método colorimétrico, utilizando kits comerciais BioClin, específicos para cada mineral. A leitura das reações obtidas foi realizada por absorbância em espectrofotômetro modelo SP Biospectro, utilizando comprimentos de onda específicos para cada analito: cálcio (510nm), fósforo (650nm) e magnésio (500nm). Após a leitura da absorbância foi realizado o cálculo segundo a fórmula contida na bula de cada kit, obtendo assim a quantificação final do analito, sendo expresso em mg/dL.
5.8.2 Determinação da concentração de insulina, osteocalcina e paratormônio
As concentrações séricas de insulina, osteocalcina e paratormônio foram determinadas por Imunoabsorção Ligado a Enzimas, utilizando o kit para rato da marca UScn Life Science Inc.
Na determinação da insulina o ensaio emprega a técnica de inibição competitiva enzimática. Nesta técnica ocorre uma correlação inversa entre a concentração de insulina na amostra e a intensidade do sinal. A placa de microtitulação fornecidas no kit era revestido com um anticorpo monoclonal específico de insulina para rato (IAA). As amostras e os padrões foram adicionados nos poços da placa. Uma reação de inibição era iniciada entre a insulina de rato marcada com biotina e a insulina de rato não marcada (amostra ou padrões) com o anticorpo específico revestido de insulina para rato. Após a incubação o conjugado não ligado é lavado. Em seguida, avidina conjugada com peroxidase de rábano silvestre foi adicionado em cada placa e incubada. A quantidade de conjugado ligado com a peroxidase de rábano era inversamente proporcional a concentração de insulina na amostra. A mudança de cor foi medida espectrofotometricamente no leitor de ELISA Thermo plate Read, em comprimento de onda de 450 nm. A
concentração de IAA na amostra foi determinada comparando a densidade ótica das amostras com a curva padrão e os resultados expressos em pg/mL.
Para a concentração sérica de osteocalcina foram utilizadas placas de microtitulação fornecidos no kit e pré-revestido com um anticorpo específico para osteocalcina. As amostras, os padrões e a preparação de anticorpo específico para osteocalcina conjugada com biotina foram adicionadas na microplaca. Após, avidina conjugada com peroxidase de rábano silvestre foi adicionada em cada poço e incubado. Em seguida foi adicionada solução de substrato. Somente os poços que continham osteocalcina, anticorpo conjugado com biotina e avidina conjugada com enzima exibiam uma mudança na cor. A reação enzima-substrato era terminada pela adição da solução de ácido sulfúrico e a mudança na cor medida espectrofotometricamente no leitor de ELISA Thermo plate Read, em comprimento de onda de 450 nm. A concentração de osteocalcina nas amostras foi então determinada através da comparação da densidade ótica das amostras com a curva padrão. A curva foi constituída por análise de regressão e os resultados expressos em ng/mL.
Para a concentração sérica de paratormônio (PTH) empregou-se a técnica da inibição competitiva enzimática. Um anticorpo monoclonal específico para PTH de rato foi pré-revestido na microplaca. Uma reação de inibição competitiva foi iniciada entre o PTH de rato marcado com biotina e PTH de rato não marcado (padrões e amostras) com o anticorpo específico para PTH de rato pré-revestido. Após incubação o conjugado não-ligado foi lavado, em seguida avidina conjugada com peroxidase de rábano foi adicionada em cada poço da microplaca e incubada. A quantidade de peroxidase de rábano ligado é inversamente proporcional a concentração de PTH na amostra. Após adição da solução de substrato, a intensidade da cor desenvolvida é reversamente proporcional a concentração de PTH na amostra. A mudança de cor foi medida espectrofotometricamente no leitor de ELISA Thermo plate Read, em comprimento de onda de 450 nm. A concentração de PTH na amostra foi determinada através da comparação da densidade ótica das amostras com a curva padrão. Os resultados foram expressos pg/mL.
5.8.3 Conteúdo mineral ósseo do fêmur
Antes da análise, todo o material utilizado foi previamente lavado por imersão em ácido nítrico diluído (1:4), posteriormente, cuidadosamente enxaguado com água deionizada e, por fim, colocado em estufa à 105º C para a secagem. Os materiais foram resfriados no dessecador e depois colocados por 3 horas na mufla para posterior resfriamento e pesagem em balança analítica.
Primeiramente foi determinada a umidade, realizada por meio da técnica gravimétrica com emprego de calor (105º C) (CECCHI,1999).
Para obtenção das cinzas, o fêmur direito de cada animal foi colocado no cadinho, identificados individualmente, aquecidos em mufla (Quimis) a 550º C por 3 horas (até a queima total de matéria orgânica) e resfriados em dessecador até a temperatura ambiente, para posterior pesagem em balança analítica. Novas pesagens foram realizadas até as amostras adquirirem peso constante (CECCHI, 1999). Os resultados foram expressos em gramas. Com os resultados de umidade e cinzas foi possível determinar o resíduo mineral fixo de cada amostra.
Após produzidas as cinzas, estas em seus respectivos cadinhos foram acidificadas com 3 ml de ácido nítrico (65%), colocadas em placa aquecida à 80º C por 30 minutos. Depois de resfriados, os cadinhos foram lavados com 10 ml de água deionizada e foram recuperados 5 ml de amostra com uma seringa. A solução foi filtrada com filtro Jet BioFil (Innovative unique) acoplado a seringa. Essa solução foi transferida para tubos lavados em ácidos para que assim pudessem ser realizadas as análises de minerais.
As análises de minerais foram realizadas a partir dos kits comerciais (Bioclin). A leitura das reações obtidas foi realizada em espectrofotômetro modelo SP Biospectro, utilizando comprimentos de onda específicos para cada analito: cálcio (510nm), magnésio (500nm) e fósforo (650nm). Após a leitura da absorbância foi realizado o cálculo segundo a fórmula contida na bula de cada kit, considerando a diluição da amostra, obtendo assim a quantificação final do analito, sendo o resultado expresso em mg/dL.
