Quantidade de alimento estocado nas colônias e variação sazonal de pluviosidade

Foram utilizadas nove colônias de abelhas sem ferrão, três colônias (C1, C2 e C3) de T. angustula, três colônias (C4, C5 e C6) de F. varia e três colônias (C7, C8 e C9) de N.

testaceicornis. Os dados foram coletados durante 12 meses consecutivos, de

agosto/2012 a julho/2013.

Realizamos mensalmente a contagem do número de potes de alimento encontrados no interior das colônias. Para isso as caixas de madeira racionais que continham as colônias foram abertas para visualização dos potes de alimento, que foram discriminados entre potes de pólen e potes de mel. Os potes foram encontrados em sua maioria na região superior das caixas (melgueiras), porém em muitas colônias observamos também a presença de potes de alimento no entorno da área de cria.

Os dados de variáveis ambientais (médias mensais de pluviosidade e temperatura) para período de agosto/2012 a julho/2013 na localidade de Ribeirão Preto - SP foram

obtidos pela base de dados do CIIAGRO (Centro Integrado de Informações Agrometeorológicas) por meio do site http://www.ciiagro.sp.gov.br/.

3.2 Quantidade de alimento larval depositado nas células de cria

Para este estudo foram escolhidas três colônias diferentes das utilizadas na etapa anterior, sendo uma colônia (C10) de T. angustula, uma colônia (C11) de F. varia e uma colônia (C12) de N. testaceicornis. Mensalmente foi coletado de cada colônia um favo de cria (T. angustula e N. testaceicornis) e uma porção (F. varia) com células recém-operculadas, na fase embrionária (contendo ovos) de cada colônia. As coletas foram realizadas durante 12 meses consecutivos, de agosto/2012 a julho/2013.

De cada favo/porção foram escolhidas ao acaso 20 células de cria para serem analisadas. As células de cria, incluindo as células reais foram levadas ao laboratório e desoperculadas individualmente com um estilete de ponta fina. Os ovos foram removidos para que seu conteúdo proteico não interferisse no experimento. Posteriormente o conteúdo alimentar de cada célula foi quantificado volumetricamente utilizando-se capilares de 20 µL graduados de 5µL em 5µL (para células de cria de operárias/machos) e de 50µL graduados de 10µL em 10µL (para células reais), conectados a um micropipetador manual.

Todo o alimento retirado das células foi estocado em frascos Eppendorf

devidamente identificados e acondicionados em freezer a –21°C para utilização nas etapas posteriores. Após a coleta os favos de cria eram devolvidos às colônias de origem.

3.3 Ocorrência de rainhas, machos e operárias

Utilizamos as mesmas nove colônias, citadas no item 3.1, três colônias (C1, C2 e C3) de T. angustula, três colônias (C4, C5 e C6) de F. varia e três colônias (C7, C8 e C9) de

N. testaceicornis no períodode agosto/2012 a julho/2013.

Para T. angustula e N. testaceicornis foram coletados mensalmente seis favos de cria (um de cada colônia), cujas células de cria continham indivíduos em estágio pupal pré-emergente, incluindo células reais. Para a avaliação do número de sexuados foi utilizada uma técnica não invasiva, descrita por Koedam (2003), a qual não afeta o número demográfico da colônia. Esta técnica consiste em desopercular as células de favos prontos para emergirem com o auxílio de um alfinete número o 3 ou 4. Depois, um

plástico transparente é sobreposto ao favo onde fica registrado o número e a localização dos machos, das rainhas e das operárias encontrados.

Para F. varia que constrói células de cria individualizadas em formato de “cacho”, localizamos regiões contendo indivíduos em estágio pupal pré-emergente, incluindo casulos reais e células acessórias que foram coletados e levados ao laboratório onde as células de cria foram desoperculadas com o auxílio de um estilete de ponta fina. Após a etapa de verificação do sexo, os favos e células de cria foram devolvidos aos seus ninhos de origem.

A distinção entre os sexos e as castas foi feita por características morfológicas como largura máxima da cabeça, distância interorbital (tendo como referência a base da antena) e distância intertegular com auxílio de estereomicroscópio (Leica Wild M3B).

3.4 Efeitos da quantidade de alimento sobre a determinação de castas

Utilizamos as mesmas três colônias citadas no item 3.3, uma colônia (C10) de T. angustula, uma colônia (C11) de F. varia e uma colônia (C12) de N. testaceicornis. Os experimentos foram realizados de agosto/2013 a maio/2014.

Nesta etapa foi utilizada a técnica modificada e aprimorada de produção in vitro

de rainhas, que será brevemente descrita a seguir (para maiores detalhes ver Prato, 2011; Baptistella et al., 2012; Menezes et al., 2013). Os procedimentos descritos a seguir foram realizados separadamente para as três espécies aqui estudadas.

Células de cria de operárias/machos recém-operculados foram coletadas, levadas ao laboratório, desoperculadas com um estilete de ponta fina e seus ovos foram removidos. Posteriormente, com o auxílio de uma bomba de sucção a vácuo, o alimento foi retirado célula por célula de todos os favos, estocado em tubos Falcon identificados para as três espécies e acondicionados em freezer a -21°C até o momento de sua aplicação nas placas de acrílico.

Para reproduzir células de cria utilizamos três placas de acrílico (uma para cada espécie) retangulares com 1,5 cm de espessura e lados com 8,4 cm e 7,6 cm contendo 100 pocinhos cada uma. Cada pocinho possuía 4 mm de diâmetro, 8 mm de profundidade e volume total de 100 µL.

O alimento que estava acondicionado em freezer a -21°C foi mantido em temperatura ambiente por cerca de meia hora para descongelamento, agitado e

posteriormente transferido com micropipetas para os 300 pocinhos das três placas de acrílico separados por espécie e em quantidades graduais. Para as três espécies aplicamos o alimento de 10 em 10 pocinhos com as seguintes quantidades: 15 µL, 20 µL, 25 µL, 30 µL, 35 µL, 40 µL, 45 µL, 50 µL, 55 µL e 60 µL.

Células de cria contendo larvas em estágio primário foram coletadas, levadas ao laboratório, onde suas células de cria foram desoperculadas, em seguida, as larvas foram transferidas com estilete de ponta fina para os pocinhos das placas de acrílico contendo alimento. Após transferência, as placas de acrílico foram acondicionadas em estufa BOD a 28°C e umidade controlada onde foram mantidas até o início da emergência dos indivíduos. Realizamos 300 transferências (100 de cada espécie) de larvas para pocinhos contendo quantidades variáveis de alimento larval.

Após a emergência, os poucos machos obtidos foram desconsiderados e as fêmeas foram analisadas quanto ao peso e medidas morfométricas (largura máxima da cabeça, distância entre os olhos e distância entre as tégulas). Os mesmos parâmetros foram avaliados para rainhas (n= 4, por espécie) e operárias (n= 10, por espécie) e rainhas-miniatura (n= 5, somente para N. testaceicornis) recém-emergidas em condições naturais a título de comparação.

3.5 Análise estatística

Para a análise dos dados relativos à produção de indivíduos pelas colônias e quantidade de alimento depositado nas colônias ao longo do ano, utilizamos os testes de

Kruskal-Wallis (ANOVA) para múltiplas amostras independentes e de Mann-Whitney para comparação para par a par de amostras independentes, considerando significativos os valores de probabilidade menores que 5% (p<0,05). Utilizamos também os coeficientes de correlação de Spearman e Pearson.

Para testar se a quantidade de alimento depositado nas células de cria de operárias/machos em T. angustula foi influenciada pelas diferentes épocas do ano foi realizado o teste One-Way ANOVA. O mesmo foi feito para avaliar se a quantidade de alimento nas células de cria foi diferente em cada colônia amostrada. Para comparar as épocas do ano entre si utilizamos o teste de Friedman para comparações múltiplas par a par.

Para comparação das quantidades de aminoácidos livres e totais presentes nos alimentos provenientes de células reais e células de operárias/machos utilizamos o teste ANOVA e o coeficiente de correlação de Spearman, para duas amostras pareadas e relacionadas.

Para comparação entre os tempos de desenvolvimento e pesos dos diversos grupos de indivíduos naturais e produzidos in vitro, utilizamos o teste de Mann-Whitney

para amostras independentes e a distância de Mahalanobis a fim de comparar as medidas morfométricas. O programa BioEstat 5.0 foi utilizado para realizar tais testes estatísticos.

Resultados