As células ROS 17/2.8 foram mantidas em cultura até atingirem a confluência e serem removidas das placas para a extração do RNA. (Fig.5)
FIGURA 5 - Células ROS 17/2.8 em cultura
6.1. Tempo de dobramento celular. (Tabela 1)
Quando as células ROS 17/2.8 foram submetidas à diferentes dosagens hormonais (infrafisiológica, fisiológica e suprafisiológica), somente de estrógeno, responderam da seguinte forma: o grupo controle (sem tratamento) apresentou um TD igual à dosagem infrafisiológica. A diminuição deste tempo foi notada na dose suprafisiológica (p<0,05), sendo que o TD obtido pela dose fisiológica foi intermediário às demais.
b) TD para os tratamentos somente com hormônio tireóideo:
O maior TD celular foi observado na concentração infrafisiológica. Este tempo diminuiu no grupo sem tratamento e na dose fisiológica de T3. O menor TD foi aquele encontrado no grupo tratado com T3 suprafisiológico, estatisticamente significante em relação à dose infrafisiológica e ao controle (p<0,05).
c) TD para as associações hormonais:
As associações da dosagem de E2 suprafisiológica com as diferentes dosagens de T3, produziram um aumento no TD, quando comparadas com E2 suprafisiológica isolada (estatisticamente significante, p<0,05). A maior significância foi notada quando o E2 suprafisiológico estava associado ao T3 supra, seguido pela associação com T3 infra e T3 fisiológico. A acentuada diminuição no TD provocada pelo estrógeno suprafisiológico é revertida, quando a associação com T3 é realizada.
Ao associarmos o E2 fisiológico com as diferentes dosagens de T3 verificamos que não existe diferença significativa no TD (p>0,05).
A combinação do E2 infrafisiológico, com as diferentes dosagens de T3, provoca diminuição no TD em relação ao E2 infra isolado. Isto ocorre principalmente nas doses supra e infra de T3 (estatisticamente significante, p<0,05).
O T3 suprafisiológico, associado à dosagem supra de E2, aumenta significativamente o TD (p<0,05), quando comparado às dosagens suprafisiológicas de T3 isolado e associado com E2 fisio e infra.
A análise da dose fisiológica de T3, associada a diferentes concentrações de E2, mostrou que o maior TD dá-se com o T3 fisiológico isolado, seguido pela associação com E2 infrafisiológico. Os menores TDs, (estatisticamente significantes, p<0,05), são encontrados nas associações com E2 supra e fisiológico.
O TD com a dosagem isolada de T3 infrafisiológico é significativamente maior (p<0,05), em relação à sua associação com as diferentes dosagens de E2.
Tabela 1 - Mediana e semiamplitude total do tempo de dobramento (TD) para as células ROS 17/2.8, submetidas à diferentes dosagens hormonais com estrógeno e triiodotironina
A leitura da tabela na vertical mostra que duas medianas seguidas de, pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem em relação ao TD, quando tratadas com
diferentes concentrações de E2, fixada a concentração de T3. A leitura da tabela na horizontal mostra que duas medianas seguidas de, pelo menos uma mesma letra maiúscula, não diferem em relação ao TD, quando tratadas com diferentes concentrações de T3, fixada a concentração de E2. S = suprafisiológico, F = fisiológico e I = infrafisiológico.
6.2. Resultado do RT-PCR semiquantitativo para RANKL e ciclofilina. (Fig. 6) T3 E2 ausente 10 -8 M S 10–9 M F 10-10 M I ausente 50,0 ± 4,0 bBC 24,0 ± 3,0 a A 41,0 ± 1,0 bAB 75,0 ± 1,5 bC P<0,05 10-7 M S 5,0 ± 1,0 aA 50,0 ± 4,0 bC 23,0 ± 3,5 aB 38,0 ± 3,0 a BC P<0,05 10-8 M F 24,0 ± 7,5 abA 20,0 ± 0,5 aA 23,0 ± 2,5 aA 22,0 ± 3,0 aA P>0,05 10-9 M I 50,0 ± 3,5 bB 23,0 ± 1,5 a A 31,0 ± 1,5 abAB 26,0 ± 2,0 aA P<0,05 P<0,05 P<0,05 P<0,05 P<0,05 ciclofilina
FIGURA 6 – Expressão do RANKL e ciclofilina para os grupos de tratamentos com estrógeno fisiológico (A) e infrafisiológico (B), nas células ROS 17/2.8.
6.3. Expressão do marcador de reabsorção celular RANKL. (Tabela 2)
a) expressão do RANKL para os tratamentos somente com estrógeno:
A expressão do RANKL nas células tratadas com diferentes dosagens de estrógeno ocorreu de forma inversamente proporcional à dose de E2 utilizada. O grupo controle diferiu significativamente (p<0,05) das doses supra e fisiológica de E2.
b) expressão do RANKL para os tratamentos somente com hormônio tireóideo:
Ao analisarmos a expressão do RANKL nas células cultivadas com diferentes dosagens de T3 percebemos que não houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05).
c) expressão do RANKL para as associações hormonais:
A expressão do RANKL, nas células tratadas com as associações de estrógeno suprafisiológico e diferentes dosagens de T3 foi maior para a dosagem supra de estrógeno associada com T3 supra, seguido pelo grupo E2 supra e T3 infra. A diminuição desta expressão é notada na associação com T3 fisio, e na dose supra de estrógeno isolado (estatisticamente significante, p<0,01).
Quando fazemos combinações de estrógeno fisiológico com T3, temos uma maior expressão no grupo de estrógeno fisiológico e T3 infra, seguido pelo grupo E2 fisiológico isolado. A diminuição desta expressão, de forma significativa (p<0,01), ocorreu nos grupos de estrógeno fisiológico e suas associações com T3 supra e T3 fisio.
As associações de E2 infra com diferentes dosagens de T3 mostraram que a maior expressão do RANKL é encontrada na associação de estrógeno infra e T3 fisiológico, seguido pelo grupo de E2 infra e T3 infra. Diferença estatisticamente significante (p<0,05) foi apresentada pela combinação de E2 infra e T3 supra, e E2 infra isolado.
A análise das associações entre o grupo suprafisiológico de T3 com diferentes doses de estrógeno mostrou que a expressão de RANKL foi maior no grupo T3 supra e E2 infra, seguido pelo grupo E2 supra e T3 supra, e dose suprafisiológica de T3 isolado. A menor expressão (estatisticamente significante, p<0,05) foi encontrada no grupo T3 supra e estrógeno fisiológico.
Quando a combinação de T3 fisiológico com diferentes doses de estrógeno são realizadas, as maiores expressões do RANKL foram encontradas nos grupos de T3
fisiológico e estrógeno infra, e estrógeno fisiológico isolado (estatisticamente significante, p<0,01). As demais combinações (T3 fisio associada a E2 supra e a E2 fisio) apresentaram diminuição na expressão.
Nos grupos T3 infra isolado, e T3 infra associado a E2 infra e fisiológico, a expressão do RANKL não diferiu estatisticamente. O grupo T3 infra e E2 supra, mostrou diminuição estatisticamente significante desta expressão (p<0,05).
Tabela 2 - Mediana e semiamplitude total da expressão do marcador RANKL, nas células ROS 17/2.8 submetidas a diferentes dosagens hormonais com estrógeno e triiodotironina
A leitura da tabela na vertical mostra que duas medianas seguidas de, pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem em relação à expressão do RANKL quando tratadas com diferentes concentrações de E2, fixada a concentração de T3. A leitura da tabela na horizontal mostra que duas medianas seguidas de, pelo menos uma mesma letra maiúscula,
T3 E2 ausente 10 -8 M S 10-9 M F 10-10 M I ausente 0,089 ± 0,064 bA 0,049 ± 0,016 abA 0,073 ± 0,022 bA 0,110 ± 0,061 bA P>0,05 10-7 M S 0,015 ± 0,022 a A 0,067 ± 0,032 bB 0,023 ± 0,028 aA 0,041 ± 0,021 a AB P<0,01 10-8 M F 0,031 ± 0,015 a AB 0,022 ± 0,022 aA 0,008 ± 0,008 a A 0,068 ± 0,044 abB P<0,01 10-9 M I 0,078 ± 0,044 abA 0,082 ± 0,031 bA 0,129 ± 0,048 bB 0,094 ± 0,044 bAB P<0,05 P< 0,05 P<0,05 P<0,01 P<0,05
não diferem em relação à expressão do RANKL quando tratadas com diferentes concentrações de T3, fixada a concentração de E2. S = suprafisiológico, F = fisiológico e I = infrafisiológico