UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
PATRÍCIA PINTO SARAIVA
Ação do estrógeno e hormônio tireóideo sobre
células ósseas de osteossarcoma de rato (ROS
17/2.8) e humano (MG-63 e SaOs-2)
Tese - doutorado
Botucatu - SP
2005
Livros Grátis
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS
Saraiva, Patrícia Pinto.
Ação do estrógeno e hormônio tireóideo sobre células ósseas de osteos- sarcoma de rato (ROS 17/2.8) e humano (MG-63 e SaOs-2) / Patrícia Pinto Saraiva. – 2005.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu, 2005.
Orientador: Célia Regina Nogueira Assunto CAPES: 40102114
1. Ossos - Distúrbios do metabolismo 2. Ossos - Câncer CDD 616.99471
Palavras-chave: Estrógeno; Hormônio tireóideo; MG-63, SaOs-2, Osso
PATRÍCIA PINTO SARAIVA
Ação do estrógeno e hormônio tireóideo sobre células ósseas
de osteossarcoma de rato (ROS 17/2.8) e humano (MG-63 e
SaOs-2)
Ação do estrógeno e hormônio tireóideo sobre células ósseas
de osteossarcoma de rato (ROS 17/2.8) e humano (MG-63 e
SaOs-2)
Tese apresentada ao Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista - UNESP, para obtenção do título de Doutor, em Fisiopatologia em Clínica Médica, área de concentração: Metabolismo e Nutrição.
Orientadora: Profa. Dra. Célia Regina Nogueira
BOTUCATU 2005
DADOS CURRICULARES Patrícia Pinto Saraiva
FILIAÇÃO Roberto Pinto Saraiva Marlene Mesaros Saraiva
1990/1993 Curso de Graduação em Odontologia. Faculdade de Odontologia de Bauru – Universidade de São Paulo.
1994/2005 Professora auxiliar do Departamento de Odontologia - Disciplina de Periodontia da Universidade do Sagrado Coração - USC, Bauru.
2000/2002 Curso de Pós-Graduação em Fisiopatologia em Clínica Médica, nível de Mestrado, na Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista - UNESP.
A Deus, Por esta bênção.
A meu pai e minha avó, duas pessoas queridas que perdi durante este curso.
À minha mãe e meus irmãos, Por nos mantermos sempre juntos.
Agradecimentos
A realização deste trabalho contou com a colaboração de muitas pessoas. Minha eterna gratidão a todas elas:
À Profa. Dra. Célia Regina Nogueira pela orientação. E pela paciência, consideração, estímulo, amizade, e um enorme coração. “Se procuro entre as minhas lembranças as que me deixaram um gosto durável, se faço o balanço das horas que valeram a pena, certamente só encontro aquelas que nenhuma fortuna do mundo poderia ter comprado”.
À Silvania Silva Teixeira. Você sabe que, sem você, nada disto existiria. Não tenho como agradecer. “Não há como substituir um velho companheiro. Nada vale o tesouro de tantas recordações comuns, de tantos momentos vividos juntos, tantas emoções compartilhadas. Não se reconstroem essas amizades”.
À Dra. Cecília H. A. Gouveia, do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, por ter-nos cedido as células com as quais trabalhamos. Muito obrigada.
Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Padovani, por sua paciência, disponibilidade e orientação estatística do trabalho, imprescindível em seu conteúdo.
Aos queridos colegas do Laboratório Experimental de Clínica Médica: Sueli, José Carlos, Denise, Nancy, Silvia, Sandro, Vivian. Nos tornamos uma grande família. Além de toda ajuda no desenvolvimento do trabalho, agradeço pela companhia e amizade. À Universidade do Sagrado Coração. Aos colegas da disciplina de Periodontia: Ester, Gustavo e Lúcia, obrigada pela colaboração.
À Profa. Gesilda Correia de Melo Chiquito, coordenadora da disciplina de Periodontia da USC, por todo apoio para a realização deste curso. E, principalmente, pela amizade. “O amor, tendo germinado, cria raízes que não param de crescer”.
SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS...7 LISTA DE TABELAS...8 LISTA DE ABREVIATURAS...9 1. Introdução...10 I - Capítulo I...17 2. Objetivos...18 3. Materiais e métodos...19 3.1. Materiais...19 3.2. Métodos...19 3.2.1. Cultura de células...19 3.2.2. Grupos de tratamentos...20 3.2.3. Estimulação hormonal...21 3.2.4. Proliferação celular...21
3.2.5. Extração de RNA e RT-PCR semiquantitativo...22
3.2.5.1. Padronização da expressão do RNAKL, em relação à temperatura...23
3.2.5.2. Padronização da expressão do RANKL em relação ao número de ciclos...24
3.2.5.3. Padronização da expressão do RANKL em relação à quantidade de
cDNA...24
3.2.5.4. Padronização da expressão do RANKL e da ciclofilina para RT-PCR semiquantitativo multiplex nas células ROS 17/2.8...25
4. Aspectos éticos...26
5. Análise estatística...26
6. Resultados...27
6.1.Tempo de dobramento celular (ROS 17/2.8)...27
6.2. Resultado do RT-PCR semiquantitativo para RANKL e ciclofilina...31
6.3. Expressão do marcador de reabsorção óssea RANKL...31
7. Discussão...35
8. Conclusões...40
9. Resumo...41
10. Abstract...42
11. Artigo para publicação...43
II - Capítulo II...44 12. Objetivos...45 13. Materiais e métodos...46 13.1. Materiais...46 13.2. Métodos...46 13.2.1. Cultura de células...46 13.2.2. Grupos de tratamentos...47 13.2.3. Proliferação celular...48 14. Aspectos éticos...49 15. Análise estatística...49 16. Resultados...50
16.1. Tempo de dobramento celular (MG-63)...50
16.2. Tempo de dobramento celular (SaOs-2)...53
17. Discussão...56
18. Conclusões...60
20. Abstract...63 21. Referências Bibliográficas...65 22. Anexos...72
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Padronização da expressão do RANKL em relação à temperatura, nas células ROS 17/2.8.
Figura 2 - Padronização da expressão do RANKL em relação ao número de ciclos, nas células ROS 17/2.
Figura 3 - Padronização da expressão do RANKL em relação à quantidade de cDNA, nas células ROS 17/2.8.
Figura 4 - Padronização da expressão do RANKL e da ciclofilina para RT-PCR multiplex, nas células ROS 17/2.8.
Figura 5 - Células ROS 17/2.8 em cultura.
Figura 6 - Expressão do RANKL e ciclofilina para os grupos de tratamentos com estrógeno fisiológico e infrafisiológico, nas células ROS 17/2.8.
Figura 7 - Células MG-63 em cultura. Figura 8 - Células SaOs-2 em cultura.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Mediana e semiamplitude total do tempo de dobramento para ROS 17/2.8, segundo E2 e T3.
Tabela 2 - Mediana e semiamplitude total da expressão do marcador RANKL, nas células ROS 17/2.8, segundo E2 e T3.
Tabela 3 -Mediana e semiamplitude total do tempo de dobramento (TD), em horas, para MG-63, submetidas a diferentes dosagens hormonais com estrógeno e triiodotironina.
Tabela 4 -Mediana e semiamplitude total do tempo de dobramento (TD), em horas, para SaOs-2 submetidas a diferentes dosagens hormonais com estrógeno e triiodotironina.
LISTA DE ABREVIATURAS
cDNA - ácido desoxiribonucleico complementar E2 - 17β estradiol
ER - receptor de estrógeno
EDTA - ácido etilenodiaminotetraacético GR - receptor de glicocorticóides
HT - hormônio tireóide IL-6 - interleucina 6 IL-1 - interleucina 1
PBS - tampão salino fosfatado PGE-2 - prostaglandina E2
RANKL - ligante do receptor ativador do fator nuclear kappa beta RANK - receptor ativador do fator nuclear kappa beta
RAR - receptor do ácido retinóide RNA - ácido ribonucleico
mRNA - ácido ribonucléico mensageiro RXR - receptor retinóide X
RT-PCR - reação de cadeia em polimerase em tempo real TD - tempo de dobramento
TR - receptor do hormônio tireóide
TER - elemento responsivo ao hormônio tireóide TGFβ - fator de crescimento transformador β TNFα - fator de necrose tumoral α
VDR - receptor da vitamina D
1. Introdução
O remodelamento ósseo envolve a remoção continuada de osso (reabsorção óssea), seguida pela síntese de nova matriz óssea e subseqüente mineralização (formação óssea) (Masi & Brandi, 2001). Dois tipos principais de células são encontrados no osso: o osteoclasto e o osteoblasto, principais agentes na modificação da matriz óssea. O osteoblasto produz a matriz, que se mineraliza. Esta matriz mineralizada pode ser removida pela atividade do osteoclasto, quando ativado (Hill, 1998).
Para a identificação de processos de reabsorção e formação óssea podemos nos basear em marcadores da atividade de remodelação do osso, como o RANKL, o qual é expresso em progenitores de osteoclastos ou osteoclastos maduros (Mizukami et al., 2002). O princípio da função do RANKL, in vivo, é regular a osteoclastogênese, e seu padrão de sinalização é a emissão de sinais humorais, que regulam a reabsorção óssea e o metabolismo do cálcio (Li et al., 2000). Portanto, a expressão do RANKL está relacionada à ocorrência de atividade osteoclástica.
Devido às suas múltiplas funções, os osteoblastos e osteoclastos estão sob controle rigoroso de hormônios, como o hormônio tireóideo (HT), 1,25-dihidroxivitamina
D3 e 24-25-dihidroxivitamina D3, estrogênio (E2) e hormônio de crescimento (Wilson &
Kornman, 2001).
Os hormônios esteróides e o HT podem agir diretamente nos osteoblastos e osteoclastos para alterar a reabsorção e formação óssea. Todavia, é importante lembrar que, in vivo, a estrutura óssea normal é mantida por complexas interações entre osteoblastos e osteoclastos, e é difícil considerar os efeitos em um único tipo de célula (Bland, 2000).
O HT exerce seus efeitos nos osteoblastos, via receptores nucleares, para aumentar a expressão do RANKL e estimular a reabsorção óssea osteoclástica (Kisakol et al., 2003; Lakatos, 2003). A expressão do ligante do receptor ativador do fator nuclear kappa B (RANKL) é induzida nos osteoblastos, e o RANKL subseqüentemente une-se ao receptor ativador do fator nuclear kappa B (RANK), localizado na membrana celular de osteoclastos, ativando uma cascata que promove a diferenciação osteoclástica (Ferrer Cañabate, et al., 2002). Além disto, o HT suprime a diferenciação de células osteoprogenitoras em osteoblastos, mas aumenta a atividade funcional de osteoblastos maduros (Gouveia, 2004).
O aumento na expressão de vários genes osteoblásticos, relacionados com a formação da matriz óssea in vivo e in vitro, provocado pelo HT, evidencia esse hormônio como uma molécula reguladora da formação óssea. Da mesma forma, a indução da reabsorção pelo T3 mostra seu importante papel na regulação deste processo, ativando a osteoclastogênese (Gouveia, 2004).
No hipertireoidismo há um grande aumento na reabsorção osteoclástica, com balanço negativo de cálcio. O aumento nas concentrações séricas de fosfatase alcalina (EC3.1.3.1) e osteocalcina, provenientes de níveis elevados de HT, pode resultar também na estimulação da atividade osteoblástica (Lakatos, 2003). Em condições de excesso de HT,
a atividade dos osteoblastos e dos osteoclastos está aumentada, havendo predomínio da osteoclástica (Gouveia, 2004). O hipotireoidismo está associado a um aumento na densidade óssea, atribuído à diminuição no seu turnover (Kisakol et al., 2003).
O E2 tanto pode estimular como inibir a proliferação de osteoblastos, e também exerce uma importante influência nos osteoclastos. A diminuição do E2 estimula a osteoclastogênese, embora existam evidências as quais sugerem que a indução estrogênica da diferenciação osteoclástica é mediada via osteoblastos, e dependente da presença de receptores de IL-6 (interleucina-6) nas células osteoblásticas (Bland, 2000). O estrogênio se liga aos osteoblastos induzindo-os a aumentar a produção de osteoprotegerina e suprimir a produção de RANKL – uma combinação de sinais que impede a formação de osteoclastos, mantendo o controle sobre a perda óssea (Silha et al., 2003).
Tanto o HT como o E2 inibem a proliferação de condrócitos, mas promovem diferenciações hipertróficas, dados que sugerem que estes hormônios interagem na regulação do crescimento. As ações opostas do HT e do E2 no osso podem ser ilustradas pela regulação de citocinas e fatores de crescimento. Nos osteoblastos o HT aumenta a síntese de citocinas pró-reabsortivas como IL-6, PGE2 (prostaglandina E2) e RANKL, enquanto o E2 diminui as citocinas pró-reabsortivas e fatores de crescimento (IL-1, TNFα (fator de necrose tumoral α), IL-6 e PGE2), e aumenta as citocinas anti-reabsortivas TGFβ (Fator Beta de Crescimento Transformador) e osteoprotegerina (Bassett & Williams, 2003). Visto a relevância do E2 e do HT no osso, é importante determinar a expressão de seus receptores nucleares (ER e TR, respectivamente) neste tecido. As três principais isoformas do TR (α1, α2 e β1) estão presentes em células de linhagem de
osteossarcoma (Williams, 2000), e o estrógeno exerce seus efeitos no osso e outros tecidos alvo pela interação com receptores de estrógeno α e β (Stossi et al., 2004).
TRs podem unir-se ao elemento responsivo ao HT (TER) como monômeros, homodímeros ou heterodímeros, com o receptor retinóide X (RXR), e positiva ou negativamente regular a expressão gênica, dependendo da natureza do TR e da presença ou ausência do hormônio tireóideo (Olson et al., 1998). Embora heterodímeros formados com o RXR sejam complexos ativos funcionalmente predominantes, os receptores esteróides também são capazes de interações com outros membros da superfamília de receptores nucleares. A co-expressão de mais de um receptor esteróide por célula pode fornecer um arranjo variado de possíveis complexos heterodiméricos, os quais podem formar as bases para complexas interações entre seus padrões sinalizantes. A competição entre receptores esteroídicos para a formação de heterodímeros irá regular a responsividade ao hormônio esteróide (Bland, 2000).
Existe grande evidência para a integração de receptores hormonais nucleares na placa de crescimento e no esqueleto adulto. Entretanto, uma ligação cruzada pode ocorrer entre TRs, VDRs (receptores da Vitamina D), e RARs (receptores do ácido retinóico) para correpressores, coativadores e RXR; e entre TRs, ERs e GRs (receptores para glicocorticóides) para coativadores (Bassett & Williams, 2003; Gouveia, 2004)
A ligação cruzada entre ERs e TRs pode também ser mediada pelo relaxamento da especificidade para o elemento ligante responsivo hormonal, resultando em competição entre eles (Bassett & Williamns, 2003). Juntamente com as ações genômicas dos hormônios esteróides, existem evidências sugerindo que os esteróides e o HT são hábeis em provocar ações não genômicas (Bland, 2000).
Células de osteossarcoma são reconhecidas por sua função anormal, que causa um tumor ósseo primário (Pautke et al., 2004). Tumores ósseos malignos respondem por 4 a 6% da ocorrência de câncer durante a infância e adolescência em muitos países europeus, sendo que o osteossarcoma corresponde a 50% de todos os casos (Ruza et al., 2003). Um pico de incidência adicional ocorre após os 50 anos. São caracterizados por mudanças genéticas seqüenciais que incluem a inativação de genes supressores de tumores e a superexpressão de oncogenes (Sandberg & Bridge, 2003).
Apesar dos tratamentos intensivos, incluindo quimioterapia, a ampla excisão dos tumores e a amputação dos órgãos afetados, metade dos pacientes morre dentro de cinco anos (Nikitovic et al., 2003).
Recentemente foi observado que vários pacientes com sarcoma apresentavam também algum tipo de disfunção tireoideana, e mais pacientes com sarcoma mostravam disfunções tireoideanas que o esperado para a população em geral. Merimsky et al., 2002, relataram que é plausível que o hipotireoidismo seja o primeiro evento nos pacientes examinados, enquanto o desenvolvimento do sarcoma seja o segundo.
A ação molecular do E2 sobre células de osteossarcoma tem sido controversa e incompleta (Winding et al., 2003). Um estudo conduzido por Guise, 2000, mostrou que mulheres com tumores primários de mama, positivos para receptores de E2 (ER+), desenvolvem metástases ósseas mais freqüentemente. Bovenkerk et al., 2003, realizaram um estudo em células de osteossarcoma de rato ROS 17/2.8, e mostraram que o tratamento destas células com E2 provoca um aumento direto na expressão e função do gene supressor de tumor p53.
Alterações nos genes RB-1, p53 e outros oncogenes foram detectadas em grandes quantidades de casos de osteosarcomas (Merimsky et al., 2002).
Barrera-Hernandez et al., 1998, mostraram que o subtipo do receptor de HT, TRβ1, interage com o gene supressor p53, o qual tem função na regulação do ciclo celular e tumorigênese.
Outro oncogene envolvido é o v-erbA, o qual contém mutações que causam forte redução na afinidade da oncoproteína para o HT. A oncoproteína v-erbA é uma versão mutada do receptor α1 do HT, que é virtualmente incapaz de ligar o hormônio, mas apesar destas mutações, pode suprimir ou transativar certos promotores (Merimsky et al., 2002).
Dados da literatura mostram a atividade tanto do HT, como do E2, na regulação de oncogenes e genes supressores de tumores em células de osteossarcoma e relatos clínicos sugerindo o envolvimento hormonal (do E2 e do HT) com o desenvolvimento de tumores, mas não há informações do emprego destes hormônios atuando ao mesmo tempo. Desta forma, é importante verificarmos a ação isolada e conjunta do E2 e do T3, em diferentes concentrações, sobre a proliferação de células ósseas tumorais.
CAPÍTULO I
Ação do estrógeno e hormônio tireóideo sobre células de
osteossarcoma de rato (ROS 17/2.8)
2. Objetivos
Verificar a ação isolada e conjunta do estrógeno e do hormônio tireóideo, em diferentes concentrações, sobre a proliferação e expressão do marcador de reabsorção RANKL, em células de osteossarcoma de rato ROS 17/2.8.
3. Materiais e métodos
3.1. Materiais
Meio de cultura HAM F-12, Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline, tripsina e EDTA, foram adquiridos da GIBCO BRL. TRIzol Reagent, SuperScript
First-Strand Synthesis System for RT-PCR, Soro fetal bovino e os Primers, adquiridos da Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA. 17β-estradiol (E2) e 1-3,5,3`triiodotironina (T3) (Sigma Chemicals), Cell Proliferation Reagent WST-1 (Roche).3.2. Métodos
3.2.1. Cultura de células
As células ROS 17/2.8 foram gentilmente cedidas pela Dra. Cecília H.A. Gouveia, do Instituto de Ciências Biomédicas da USP, e mantidas em meio HAM F-12 contendo antibiótico antimicótico (penicilina, estreptomicina e anfotericina) (GIBCO BRL), com 10% de soro fetal bovino, em uma atmosfera umidificada de 5% (v/v) de CO2, a
37°C. Para o tratamento hormonal, as células foram mantidas em meio sem soro durante 48 horas. Esta linhagem celular apresenta receptores tanto para HT como para E2.
3.2.2. Grupos de tratamentos
17β-estradiol (E2) foi adicionado ao meio nas concentrações de 10-7 M (suprafisiológico), 10-8 M (fisiológico) (Shevde et al., 2000) e 10-9 M (infrafisiológico) e T3 nas concentrações de 10-8 M (suprafisiológico), 10-9 M (fisiológico) (Siddiqi et al., 1998) e 10-10 M (infrafisiológico). Foram formados os seguintes grupos:
controle (sem adição hormonal) E2 10-7 M E2 10-8 M E2 10-9 M T3 10-8 M T3 10-9 M T3 10-10 M E2 10 -7 M + T3 10 -8 M E2 10 -7 M + T3 10 -9 M E2 10 -7 M + T3 10 -10 M E2 10 -8 M + T3 10 -8 M E2 10 -8 M + T3 10 -9 M E2 10 -8 M + T3 10 -10 M E2 10 -9 M + T3 10 -8 M E2 10 -9 M + T3 10 -9 M e E2 10 -9 M + T3 10 -10 M 3.2.3. Proliferação celular
Células foram plaqueadas em uma densidade de 1x104 células por poço, em 100 µl de meio de cultura, em placa de 96 poços (3 poços para cada grupo de tratamento), para cada momento do tratamento hormonal (1, 3, 5 e 7 dias). As placas foram mantidas em estufa (37°C, 5% CO2). No momento de serem lidas, foi adicionado a cada poço 10µl de
WST-1, e incubadas por 2 horas. Após este período, as placas foram lidas em um espectrofotômetro, e analisadas pelo software SOFTMAX PRO (Molecular Devices Corporation). Através dos dados obtidos, foram construídas curvas de crescimento, e obtidos os respectivos tempos de dobramento celular, expressos em horas.
3.2.4. Estimulação hormonal
As células ROS 17/2.8 foram distribuídas em placas de 100 mm (Nalgen Nunc International, Rochester, NY, USA). Após atingirem um estado de semiconfluência, foram submetidas ao tratamento hormonal. As células foram lavadas com PBS de Dulbecco’s e os hormônios esteróide e triiodotironina adicionados ao meio HAM F-12, sem soro fetal bovino, conforme os grupos de tratamentos. Após 72 horas de incubação, com meio contendo hormônios, os ensaios para atividade funcional realizados como descrito abaixo. Todos os tratamentos foram repetidos cinco vezes para cada grupo estabelecido (n=5).
3.2.5. Extração de RNA e RT-PCR semiquantitativo
As células foram removidas das placas de cultura em 1 ml de TRIzol, e o RNA foi extraído segundo este método. O RNA total foi caracterizado através de eletroforese em gel de agarose, quantificado em espectrofotômetro a 260 nm, e estocado a -70°C. 1µg do RNA foi reversamente transcrito, usando-se random hexamer priming (SuperScript
First-Strand Synthesis System for RT-PCR).Os DNAs complementares (cDNAs) foram amplificados por RT-PCR, utilizando-se primers para RANKL e ciclofilina (controle interno). As seqüências de primers foram específicas e confirmadas através de pesquisa no Gen Bank.
Para a reação do RT-PCR semiquantitativo para os genes RANKL e ciclofilina foram utilizados 30 ciclos e temperatura de 59,5ºC.
Os produtos das reações do PCR foram separados em gel de agarose a 1%, e quantificados através do Labworks Analyses Software (UVP). Os resultados foram expressos através de média obtida entre a densidade óptica do RANKL e da ciclofilina (controle).
RANKL rato sense: 5`-CCAGCATCAAAATCCCAAGT-3`
antisense: 5`-TGAAAGCCCCAAAGTACGTC-3`
produto:200pb
Ciclofilina rato sense: 5`-ACGCCGCTGTCTCTTTTC-3` antisense: 5`-TGCCTTCTTTCACCTTCC-3’
3.2.5.1. Padronização da expressão do RANKL em relação à temperatura, nas células ROS 17/2.8. (Fig. 1)
FIGURA 1 – Determinação da temperatura de anelamento do RT-PCR para expressão do RANKL (1= marcador de peso molecular; 2 = 54.4 °C; 3 = 56.8 °C; 4 = 59.5 °C; 5 = 62.2 °C). Produto do PCR do RANKL com 200 pb.
3.2.5.2. Padronização da expressão do RANKL em relação ao número de ciclos, nas células ROS 17/2.8. (Fig. 2)
FIGURA 2 - Determinação das fases de aumento linear da amplificação do RANKL por RT-PCR (1= marcador de peso molecular; 2 = 25 ciclos; 3 = 30 ciclos; 4 = 35 ciclos; 5 = 40 ciclos). Produto do PCR do RANKL com 200 pb. 2 3 4 5 2 3 4 5 1 2 3 4 5 2 3 4 5 1 200pb 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 200pb
3.2.5.3. Padronização da expressão do RANKL em relação à quantidade de cDNA, nas células ROS 17/2.8. (Fig. 3)
FIGURA 3 - Determinação da quantidade de cDNA para amplificação do RANKL por RT-PCR (1= marcador de peso molecular; 2 = 500 ng; 3 = 1000 ng; 4 = 2000 ng). Produto do PCR do RANKL com 200 pb.
3.2.5.4. Padronização da expressão do RANKL e da ciclofilina para RT-PCR multiplex, nas células ROS 17/2.8. (Fig. 4)
FIGURA 4 - Detecção da expressão da RANKL e da ciclofilina por RT-PCR multiplex (1= marcador de peso molecular; 2 = RANKL; 3 = ciclofilina + RANKL; 3 = ciclofilina), utilizando os dados previamente determinados (59,5ºC, 30 ciclos e 1000 ng de cDNA). Produto do RT-PCR do RANKL e da ciclofilina com 200 pb e 440 pb, respectivamente.
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 200pb 200 pb 440 pb
4. Aspectos éticos
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista - UNESP. (Anexo A).
5. Análise estatística
A análise estatística foi realizada através da técnica da análise de variância não paramétrica, para o modelo com dois fatores, complementada com o respectivo teste de comparações múltiplas, tanto para o tempo de dobramento, como para a expressão do marcador RANKL.
6. Resultados
As células ROS 17/2.8 foram mantidas em cultura até atingirem a confluência e serem removidas das placas para a extração do RNA. (Fig.5)
FIGURA 5 - Células ROS 17/2.8 em cultura
6.1. Tempo de dobramento celular. (Tabela 1)
Quando as células ROS 17/2.8 foram submetidas à diferentes dosagens hormonais (infrafisiológica, fisiológica e suprafisiológica), somente de estrógeno, responderam da seguinte forma: o grupo controle (sem tratamento) apresentou um TD igual à dosagem infrafisiológica. A diminuição deste tempo foi notada na dose suprafisiológica (p<0,05), sendo que o TD obtido pela dose fisiológica foi intermediário às demais.
b) TD para os tratamentos somente com hormônio tireóideo:
O maior TD celular foi observado na concentração infrafisiológica. Este tempo diminuiu no grupo sem tratamento e na dose fisiológica de T3. O menor TD foi aquele encontrado no grupo tratado com T3 suprafisiológico, estatisticamente significante em relação à dose infrafisiológica e ao controle (p<0,05).
c) TD para as associações hormonais:
As associações da dosagem de E2 suprafisiológica com as diferentes dosagens de T3, produziram um aumento no TD, quando comparadas com E2 suprafisiológica isolada (estatisticamente significante, p<0,05). A maior significância foi notada quando o E2 suprafisiológico estava associado ao T3 supra, seguido pela associação com T3 infra e T3 fisiológico. A acentuada diminuição no TD provocada pelo estrógeno suprafisiológico é revertida, quando a associação com T3 é realizada.
Ao associarmos o E2 fisiológico com as diferentes dosagens de T3 verificamos que não existe diferença significativa no TD (p>0,05).
A combinação do E2 infrafisiológico, com as diferentes dosagens de T3, provoca diminuição no TD em relação ao E2 infra isolado. Isto ocorre principalmente nas doses supra e infra de T3 (estatisticamente significante, p<0,05).
O T3 suprafisiológico, associado à dosagem supra de E2, aumenta significativamente o TD (p<0,05), quando comparado às dosagens suprafisiológicas de T3 isolado e associado com E2 fisio e infra.
A análise da dose fisiológica de T3, associada a diferentes concentrações de E2, mostrou que o maior TD dá-se com o T3 fisiológico isolado, seguido pela associação com E2 infrafisiológico. Os menores TDs, (estatisticamente significantes, p<0,05), são encontrados nas associações com E2 supra e fisiológico.
O TD com a dosagem isolada de T3 infrafisiológico é significativamente maior (p<0,05), em relação à sua associação com as diferentes dosagens de E2.
Tabela 1 - Mediana e semiamplitude total do tempo de dobramento (TD) para as células ROS 17/2.8, submetidas à diferentes dosagens hormonais com estrógeno e triiodotironina
A leitura da tabela na vertical mostra que duas medianas seguidas de, pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem em relação ao TD, quando tratadas com
diferentes concentrações de E2, fixada a concentração de T3. A leitura da tabela na horizontal mostra que duas medianas seguidas de, pelo menos uma mesma letra maiúscula, não diferem em relação ao TD, quando tratadas com diferentes concentrações de T3, fixada a concentração de E2. S = suprafisiológico, F = fisiológico e I = infrafisiológico.
6.2. Resultado do RT-PCR semiquantitativo para RANKL e ciclofilina. (Fig. 6) T3 E2 ausente 10 -8 M S 10–9 M F 10-10 M I ausente 50,0 ± 4,0 bBC 24,0 ± 3,0 a A 41,0 ± 1,0 bAB 75,0 ± 1,5 bC P<0,05 10-7 M S 5,0 ± 1,0 aA 50,0 ± 4,0 bC 23,0 ± 3,5 aB 38,0 ± 3,0 a BC P<0,05 10-8 M F 24,0 ± 7,5 abA 20,0 ± 0,5 aA 23,0 ± 2,5 aA 22,0 ± 3,0 aA P>0,05 10-9 M I 50,0 ± 3,5 bB 23,0 ± 1,5 a A 31,0 ± 1,5 abAB 26,0 ± 2,0 aA P<0,05 P<0,05 P<0,05 P<0,05 P<0,05 ciclofilina
FIGURA 6 – Expressão do RANKL e ciclofilina para os grupos de tratamentos com estrógeno fisiológico (A) e infrafisiológico (B), nas células ROS 17/2.8.
6.3. Expressão do marcador de reabsorção celular RANKL. (Tabela 2)
a) expressão do RANKL para os tratamentos somente com estrógeno:
A expressão do RANKL nas células tratadas com diferentes dosagens de estrógeno ocorreu de forma inversamente proporcional à dose de E2 utilizada. O grupo controle diferiu significativamente (p<0,05) das doses supra e fisiológica de E2.
b) expressão do RANKL para os tratamentos somente com hormônio tireóideo:
Ao analisarmos a expressão do RANKL nas células cultivadas com diferentes dosagens de T3 percebemos que não houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05).
c) expressão do RANKL para as associações hormonais:
A expressão do RANKL, nas células tratadas com as associações de estrógeno suprafisiológico e diferentes dosagens de T3 foi maior para a dosagem supra de estrógeno associada com T3 supra, seguido pelo grupo E2 supra e T3 infra. A diminuição desta expressão é notada na associação com T3 fisio, e na dose supra de estrógeno isolado (estatisticamente significante, p<0,01).
Quando fazemos combinações de estrógeno fisiológico com T3, temos uma maior expressão no grupo de estrógeno fisiológico e T3 infra, seguido pelo grupo E2 fisiológico isolado. A diminuição desta expressão, de forma significativa (p<0,01), ocorreu nos grupos de estrógeno fisiológico e suas associações com T3 supra e T3 fisio.
As associações de E2 infra com diferentes dosagens de T3 mostraram que a maior expressão do RANKL é encontrada na associação de estrógeno infra e T3 fisiológico, seguido pelo grupo de E2 infra e T3 infra. Diferença estatisticamente significante (p<0,05) foi apresentada pela combinação de E2 infra e T3 supra, e E2 infra isolado.
A análise das associações entre o grupo suprafisiológico de T3 com diferentes doses de estrógeno mostrou que a expressão de RANKL foi maior no grupo T3 supra e E2 infra, seguido pelo grupo E2 supra e T3 supra, e dose suprafisiológica de T3 isolado. A menor expressão (estatisticamente significante, p<0,05) foi encontrada no grupo T3 supra e estrógeno fisiológico.
Quando a combinação de T3 fisiológico com diferentes doses de estrógeno são realizadas, as maiores expressões do RANKL foram encontradas nos grupos de T3
fisiológico e estrógeno infra, e estrógeno fisiológico isolado (estatisticamente significante, p<0,01). As demais combinações (T3 fisio associada a E2 supra e a E2 fisio) apresentaram diminuição na expressão.
Nos grupos T3 infra isolado, e T3 infra associado a E2 infra e fisiológico, a expressão do RANKL não diferiu estatisticamente. O grupo T3 infra e E2 supra, mostrou diminuição estatisticamente significante desta expressão (p<0,05).
Tabela 2 - Mediana e semiamplitude total da expressão do marcador RANKL, nas células ROS 17/2.8 submetidas a diferentes dosagens hormonais com estrógeno e triiodotironina
A leitura da tabela na vertical mostra que duas medianas seguidas de, pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem em relação à expressão do RANKL quando tratadas com diferentes concentrações de E2, fixada a concentração de T3. A leitura da tabela na horizontal mostra que duas medianas seguidas de, pelo menos uma mesma letra maiúscula,
T3 E2 ausente 10 -8 M S 10-9 M F 10-10 M I ausente 0,089 ± 0,064 bA 0,049 ± 0,016 abA 0,073 ± 0,022 bA 0,110 ± 0,061 bA P>0,05 10-7 M S 0,015 ± 0,022 a A 0,067 ± 0,032 bB 0,023 ± 0,028 aA 0,041 ± 0,021 a AB P<0,01 10-8 M F 0,031 ± 0,015 a AB 0,022 ± 0,022 aA 0,008 ± 0,008 a A 0,068 ± 0,044 abB P<0,01 10-9 M I 0,078 ± 0,044 abA 0,082 ± 0,031 bA 0,129 ± 0,048 bB 0,094 ± 0,044 bAB P<0,05 P< 0,05 P<0,05 P<0,01 P<0,05
não diferem em relação à expressão do RANKL quando tratadas com diferentes concentrações de T3, fixada a concentração de E2. S = suprafisiológico, F = fisiológico e I = infrafisiológico
7. Discussão
O controle hormonal do remodelamento ósseo envolve vários fatores, num maquinário complicado. O HT é essencial para o desenvolvimento do osso, e tem um importante papel no crescimento linear e na manutenção da massa óssea, enquanto o E2 tem um efeito complexo no esqueleto, incluindo sua regulação e manutenção. A ocorrência de uma alteração neste sistema, que mantém a homeostasia do osso, pode levar a vários tipos de doenças, entre elas o osteossarcoma.
Nossos resultados evidenciaram que o crescimento das células ROS 17/2.8 (que possui receptores hormonais tanto para estrógeno, como para hormônio tireóideo) é afetado pelo tratamento com E2 de maneira dose dependente, portanto, quanto maior a concentração de E2, maior a proliferação e menor o TD. Estes resultados estão em
concordânica com vários estudos (Bland, 2000; Fohr et al., 2000; Rao et al., 2003), os quais mostram que, quanto menor a concentração de E2, maior a osteoclastogênese.
Quando estas células são tratadas com T3, constatamos que uma concentração muito reduzida do hormônio (infrafisiológica) promove um aumento significante no tempo de dobramento celular. Isto poderia mostrar um indício na diminuição do turnover ósseo na presença de doses muito baixas de T3, sugerido por Kisakol et al., 2003, indicando ser o hormônio tireóideo extremamente importante para o metabolismo ósseo.
À medida que a concentração de T3 (quando isolado) vai aumentando, nossos resultados apontam um decréscimo acelerado no tempo de dobramento. A atividade do hormônio tireóideo sobre estas células ósseas mostra, portanto, grande similaridade com a atividade promovida pelo estrógeno, quando estão atuando separadamente. Estes dados estão em concordância com estudos realizados por Gu et al., 2001, e Pepene et al., 2003, os quais documentaram que o T3 estimula a proliferação de células osteoblásticas; e contrários a outros trabalhos (Siddiqi et al., 1998; Kisakol et al., 2003, Lakatos, 2003, Gouveia, 2004), os quais evidenciaram que a atividade predominante do T3 é a de reabsorção do tecido ósseo. Com nossos resultados, poderíamos especular que o hormônio tireóideo, ao ligar-se ao seu receptor, esteja agindo como um fator oncogênico, e que esta ação deva estar ocorrendo via proliferação de osteoblastos.
A interação entre E2 e T3 pode fornecer vários mecanismos para realizar adaptações metabólicas, uma vez que existem respostas provocadas pelo E2 que são dependentes de T3, como o controle do crescimento, massa óssea e triglicérides (Fitts et al., 2001).
Observamos que, na presença de estrógeno em concentração infrafisiológica (semelhante ao que ocorre na menopausa), a associação com o hormônio tireóideo (que isoladamente apresentou função semelhante ao estrógeno, de proteção ao tecido ósseo), nas dosagens supra e infra, provoca diminuição no tempo de dobramento destas células. Isto indica a importância da manutenção do hormônio tireóideo em concentração fisiológica, nesta condição.
O crescimento celular diminuído acarretado por baixos níveis de T3 isolado é revertido quando o estrógeno é adicionado ao meio. Estes dados estão em concordância com Merimsky et al., 2002, os quais observaram que pacientes hipotireoideos foram aqueles que apresentaram o maior número de casos de osteossarcomas. Notamos, em nossos resultados, que o tratamento com T3 infrafisiológico (situação que simula o hipotireoidismo), juntamente com diferentes níveis de estrógeno, provoca diminuição no TD, aumentando a proliferação celular, o que poderia simular uma atividade oncogênica.
Quando os níveis de estrogênio estão na concentração fisiológica, a associação com as diferentes concentrações de hormônio tireóideo (supra, fisio e infrafisiológicas) não provocou diferenças significativas no TD destas células. Já numa dosagem fisiológica de hormônio tireóideo, a associação com níveis supra e fisiológicos de estrógeno, provoca diminuição do TD em relação a doses fisiológicas isoladas de T3. Podemos observar que, quando o hormônio tireóideo está normal, a falta de estrógeno aumenta o TD. Não ocorre a mesma situação quando o estrógeno está normal e há falta de T3, já que não há alteração no TD, em relação à concentração isolada de T3. Presumimos, assim, que exista um controle primário e predominante do metabolismo ósseo promovido pelo estrógeno, quando a associação destes hormônios é realizada.
A presença da concentração suprafisiológica de estrógeno, quando isolada, promove uma diminuição extremamente acentuada no tempo de dobramento. Ao adicionarmos T3 em doses fisiológicas, notamos que o TD aumenta (ficando próximo daquele encontrado nas dosagens fisiológicas dos dois hormônios), o que alerta para a reposição hormonal, visto que a incidência de osteossarcoma, em humanos, mostra um pico de incidência nesta faixa etária (Sandberg & Bridge, 2003).
Nas células de rato ROS 17/2.8 o estrógeno e o T3 têm efeito na diminuição no tempo de dobramento de forma dose-dependente. A associação dos hormônios provoca diminuição ou manutenção no tempo de dobramento, quando comparado às dosagens isoladas, com exceção das combinações da dose supra de E2 com diferentes doses de T3, principalmente nas duas dosagens suprafisiológicas, na qual há um aumento expressivo no TD. Poderíamos especular que o excesso de hormônios possa diminuir o número de receptores hormonais e provocar uma saturação destes receptores, tendo como conseqüência uma diminuição da proliferação celular. Fujimoto et al., 2004, demonstraram que esta resposta à associação dos dois hormônios (T3 e E2) pode ocorrer devido ao T3 induzir a expressão do RNAm do ER alfa, e que o T3 age sinergisticamente nas respostas induzidas pelo estradiol.
A expressão do marcador de reabsorção óssea (RANKL) acompanhou de forma muito próxima os resultados encontrados no crescimento das células. Assim, onde obtivemos maior proliferação celular, a expressão deste marcador esteve fortemente reduzida, mostrando ser um bom indicador do padrão de atividade óssea. Tanto nos tratamentos isolados com estrógeno, como com T3, a expressão do RANKL foi maior nos tratamentos que apresentaram maior tempo de dobramento celular (ou menor proliferação).
O envolvimento do RANKL é demonstrado em casos de metástases ósseas secundárias a carcinomas de mama e próstata, e tumores associados com severa osteólise (Wittrant et al., 2004). Da mesma forma que Kwan et al., 2004, propomos que o RANKL é um índice preditivo forte para a evolução da atividade óssea. Esta importância torna-se ainda maior quando estamos frente ao diagnóstico de uma lesão tumoral.
1. Nas células de rato ROS 17/2.8, o E2 e o T3 isolados têm efeito na diminuição no tempo de dobramento de forma dose-dependente.
2. A associação dos hormônios provoca diminuição ou manutenção no tempo de dobramento, com exceção da combinação das duas dosagens suprafisiológicas, que aumentam este tempo de forma significativa.
3. A expressão do marcador RANKL acompanhou, de forma muito próxima, o crescimento das células de osteossarcoma de rato, submetidas aos diferentes tratamentos hormonais.
9. Resumo
Tumores ósseos malignos respondem por 4 a 6% da ocorrência de câncer durante a infância e adolescência em muitos países europeus, sendo que o osteossarcoma corresponde a 50% de todos os casos, com um pico de incidência adicional após os 50 anos.
Recentemente foi observado que vários pacientes com sarcoma apresentavam também algum tipo de disfunção tireoideana, sendo o hipotireoidismo a alteração mais freqüente. Dados da literatura mostram a atividade do hormônio tireóideo e do estrógeno na regulação de oncogenes e genes supressores de tumores em células de osteossarcoma, e há relatos clínicos sugerindo o envolvimento hormonal com o desenvolvimento de tumores ósseos. Desta forma, verificamos a ação isolada e conjunta destes hormônios, em diferentes concentrações, sobre a proliferação de células ósseas tumorais de rato ROS 17/2.8, através de uma curva de crescimento para obtenção do tempo de dobramento. Observamos também a expressão do marcador de reabsorção RANKL, através de RT-PCR semiquantitativo. Nossos resultados evidenciaram que o crescimento das células ROS 17/2.8 é afetado pelos tratamentos hormonais isolados de maneira dose dependente, e que a associação dos hormônios provoca diminuição ou manutenção no tempo dobramento celular, com exceção da combinação das duas dosagens suprafisiológicas, que aumentam este tempo. A expressão do marcador de reabsorção RANKL acompanhou de forma muito próxima os resultados encontrados no crescimento das células, mostrando ser um índice preditivo forte para a evolução da atividade óssea.
10. Abstract
Malignant bone tumors account for 4 to 6% of all cancer cases occurring during infancy and adolescence in many European countries, with osteosarcoma corresponding to 50% of all cases with another incidence peak in the over 50’s. Recently it has been seen that several patients with sarcoma also had some type of thyroid dysfunction, hypothyroidism being the most common. Literature reports thyroid hormone and estrogen
activity in regulation of oncogenes and tumors suppressor genes in osteosarcoma cells, and also clinical reports suggesting hormonal involvement in bone tumor development. Therefore we verify the isolated and joint action of these hormones at different concentrations on proliferation of ROS 17/2.8 rat bone tumors cells through a growth curve to obtain folding time and semi quantitative RT-PCR for RANKL bone marker. Our results showed that growth of ROS 17/2.8 cells is affected by isolated hormone treatments in a dose-dependant manner and that the association of hormones also causes decreased folding time with exception of the combination of two supraphysiological doses which increase this time. Expression of RANKL resorption marker very closely accompanied the results in cell growth showing that RANKL is a strong predictive index for bone activity evolution.
CAPÍTULO II
Ação do estrógeno e do hormônio tireóideo sobre células de
osteossarcoma de humano (MG-63 e SaOs-2)
12. Objetivos
Verificar a ação isolada e conjunta do estrógeno e do hormônio tireóideo, em diferentes concentrações, sobre a proliferação em células de osteossarcoma humano (MG-63 e SaOs-2).
13. Materiais e Métodos
13.1. Materiais
Meio de cultura HAM F-12, Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline, tripsina e EDTA, foram adquiridos da GIBCO BRL. 17β-estradiol (E2) e 1-3,5,3`triiodotironina (T3) adquiridos da Sigma Chemicals. (Roche). Soro fetal bovino e Cell Proliferation Reagent WST-1 foram adquiridos da Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA., e Roche, respectivamente.
13.2. Métodos
13.2.1. Cultura de células
As células MG-63 e SaOS-2 foram compradas através do Banco de Células Interlab Cell Line Collection (ICLC) da Itália. Foram mantidas em meio DMEM acrescido de 2mM de L-Glutamina e antibiótico-antimicótico (penicilina, estreptomicina e anfotericina) (GIBCO BRL). As duas linhagens foram cultivadas com 10% de soro fetal
bovino em uma atmosfera umidificada de 5% (v/v) de CO2 a 37°C. Para o tratamento
hormonal, as células foram mantidas em meio sem soro durante 48 horas. As células MG-63 possuem receptores para estrógeno (ER) e HT (TR) e a linhagem SaOs-2 possui apenas ER.
13.2.2. Grupos de tratamentos
17β-estradiol (E2) foi adicionado ao meio nas concentrações de 10-7 M (suprafisiológico), 10-8 M (fisiológico) (Shevde et al., 2000) e 10-9 M (infrafisiológico) e T3 nas concentrações de 10-8 M (suprafisiológico), 10-9 M (fisiológico) (Siddiqi et al., 1998) e 10-10 M (infrafisiológico). Foram formados os seguintes grupos:
controle (sem adição hormonal) E2 10-7 M E2 10-8 M E2 10-9 M T3 10-8 M T3 10-9 M T3 10-10 M E2 10 -7 M + T3 10 -8 M E2 10 -7 M + T3 10 -9 M E2 10 -7 M + T3 10 -10 M E2 10 -8 M + T3 10 -8 M E2 10 -8 M + T3 10 -9 M E2 10 -8 M + T3 10 -10 M
E2 10 -9 M + T3 10 -8 M
E2 10 -9 M + T3 10 -9 M e E2 10 -9 M + T3 10 -10 M 13.2.3. Proliferação celular
As duas linhagens celulares (MG-63 e SaOs-2) foram distribuídas em placas de 100 mm (Nalgen Nunc International, Rochester, NY, USA). Após atingirem um estado de confluência, foram removidas e separadas para o experimento. Células foram plaqueadas em uma densidade de 1x104 células por poço, em 100 µl de meio de cultura, em placa de 96 poços (3 poços para cada grupo de tratamento), para cada momento do tratamento hormonal (1, 3, 5 e 7 dias). As placas foram mantidas em estufa (37°C, 5% CO2). No momento de serem lidas foi adicionado a cada poço 10µl de WST-1 e incubadas
por 2 horas e após este período as placas foram lidas em um espectrofotômetro e analisadas pelo software SOFTMAX PRO (Molecular Devices Corporation). Através dos dados obtidos foram construídas curvas de crescimento, e obtidos os respectivos tempos de dobramento celular, expressos em horas.
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista - UNESP (Anexo A).
15. Análise estatística
A análise estatística foi realizada através da técnica da análise de variância não paramétrica para o modelo com dois fatores, complementada com o respectivo teste de comparações múltiplas, para o tempo de dobramento celular.
16. Resultados
As células MG-63 foram mantidas em cultura até atingirem a confluência (Fig.7).
FIGURA 7 – Células MG-63 em cultura
16.1. Tempo de dobramento celular (TD) (Tabela 3)
a) TD para os tratamentos somente com estrógeno:
Quando as células MG-63 são tratadas com diferentes concentrações de E2, os menores TDs são encontrados nos grupos controle (sem tratamento) e dose fisiológica. As dosagens supra e infrafisiológicas apresentam um aumento no TD (semelhantes entre si) estatisticamente significante em relação aos demais grupos (p<0,05).
b) TD para os tratamentos somente com hormônio tireóideo:
No grupo de tratamento realizado com T3, as diferentes concentrações deste hormônio não mostraram diferença estatisticamente significante nos TDs (p>0,05).
c) TD para as associações hormonais:
O E2 suprafisiológico combinado com diferentes doses de T3 mostra o maior TD quando o E2 supra está isolado, seguido pelo estrógeno supra associado ao T3 infra. As combinações de E2 supra e T3 supra e E2 supra e T3 fisiológico apresentaram os menores TDs (estatisticamente significante) (p<0,05).
A dosagem fisiológica de E2 associada a diferentes concentrações de T3 não causa diferença estatisticamente significante nos respectivos TDs (p>0,05).
O E2 infrafisiológico, juntamente com diferentes dosagens de T3, faz com que o maior TD seja observado quando o E2 infra está isolado, enquanto o menor TD foi encontrado no grupo E2 infra e T3 infra (estatisticamente significante) (p<0,05). As combinações de E2 infra com T3 supra e T3 fisiológico mostram um TD intermediário aos demais.
Quando associações são realizadas entre a concentração de T3 supra com as várias concentrações de E2, o TD não mostrou diferença estatisticamente significante entre os grupos (p>0,05).
O TD nas associações entre T3 fisiológico com diferentes doses de estrógeno também não mostra diferença entre os grupos (p>0,05).
A dose infrafisiológica de T3, combinada com diferentes associações de estrógeno, não apresenta diferença estatisticamente significante no TD (p>0,05).
Tabela 3. Mediana e semiamplitude total do tempo de dobramento (TD), em horas, para as células MG-63, submetidas a diferentes dosagens hormonais com estrógeno e triiodotironina T3 E2 ausente 10-8 M S 10-9 M F 10-10 M I ausente 37,0 ± 8,5 aA 42,0 ± 6,0 aA 22,5 ± 8,0 aA 40,0 ± 5,5 aA P>0,05 10-7 M S 64,0 ± 7,5 b B 35,0 ± 5,5 aA 28,5 ± 2,0 aA 43,0 ± 5,5 a AB P<0,05 10-8 M F 39,0 ± 0,0 a A 40,0 ± 7,5 aA 35,0 ± 4,0 aA 37,0 ± 2,5 aA P>0,05 10-9 M I 60,0 ± 4,0 bB 35,0 ± 6,5 aAB 36,0 ± 3,0 aAB 31,0 ± 1,0 aA P<0,05 P< 0,05 P>0,05 P>0,05 P>0,05
A leitura da tabela na vertical mostra que duas medianas seguidas de, pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem em relação ao TD, quando tratadas com diferentes concentrações de E2, fixada a concentração de T3. A leitura da tabela na horizontal mostra que duas medianas seguidas de, pelo menos uma mesma letra maiúscula, não diferem em relação ao TD, quando tratadas com diferentes concentrações de T3, fixada a concentração de E2. S = suprafisiológico, F = fisiológico e I = infrafisiológico
B) Células SaOs-2
As células SaOs-2 foram mantidas em cultura até atingirem a confluência (Fig. 8).
16.2. Tempo de dobramento celular (Tabela 4)
a) TD para os tratamentos somente com E2:
Quando as células SaOs-2 são tratadas com as várias dosagens de E2, não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos (p>0,05).
b) TD para os tratamentos somente com T3:
Os tratamentos realizados com diferentes dosagens de T3 também não mostraram diferença significante (p>0,05).
c) TD para as associações hormonais:
A associação entre E2 suprafisiológico e diferentes doses de T3 mostrou maior TD no grupo E2 supra e T3 fisiológico, e o menor TD no tratamento com E2 supra isolado (estatisticamente significante) (p<0,05). Os grupos E2 supra e T3 supra e E2 supra e T3 infra, tiveram um TD intermediário aos demais.
Quando temos as combinações de E2 fisiológico com diferentes concentrações de T3, não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos (p>0,05).
A dose de E2 infrafisiológico em associação com diferentes doses de T3 produz um maior TD no grupo E2 infra e T3 supra. O TD apresenta diminuição quando associamos E2 infra e T3 fisio. Os menores TDs foram apresentados pelos grupos E2 infra e T3 infra e E2 infra isolado, estatisticamente significante em relação ao grupo E2 infra e T3 supra (p<0,05).
A associação entre T3 supra e diferentes doses de E2 mostram maior TD no grupo T3 supra e E2 infra, e os menores TDs nos grupos T3 supra e E2 supra e T3 supra e E2 fisio, estatisticamente significantes (p<0,05). A concentração de T3 supra isolado
mostrou um TD intermediário aos demais grupos.
Quando o T3 está em dose fisiológica, sua associação com diferentes concentrações de estrógeno não mostra diferença estatisticamente significante entre os grupos (p>0,05).
As combinações da concentração infrafisiológica de T3 com diferentes doses de E2 não provoca alteração no TD (p>0,05).
Tabela 4. Mediana e semiamplitude total do tempo de dobramento (TD), em horas, para as células SaOs-2 submetidas a diferentes dosagens hormonais com estrógeno e triiodotironina A leitura da tabela na vertical mostra que duas medianas seguidas de, pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem em relação ao TD, quando tratadas com diferentes concentrações de E2, fixada a concentração de T3. A leitura da tabela na horizontal mostra que duas medianas seguidas de, pelo menos uma mesma letra maiúscula, não diferem em relação ao TD, quando tratadas com diferentes concentrações T3, fixada a concentração de E2. S = suprafisiológico, F = fisiológico e I = infrafisiológico.
T3 E2 ausente 10 -8 M S 10 –9 M F 10 -10 M I ausente 12,0 ± 7,5 aA 17,0 ± 4,0 ab A 19,0 ± 3,5 aA 10,0 ± 2,5 aA P>0,05 10-7 M S 9,0 ± 0,0 aA 14,0 ± 2,0 a AB 25,0 ± 7,0 aB 10,0 ± 4,5 a AB P<0,05 10-8 M F 14,0 ± 3,0 aA 10,0 ± 3,0 aA 10,0 ± 6,5 aA 9,0 ± 2,0 aA P>0,05 10-9 M I 10,0 ± 3,0 aA 31,0 ± 2,0 b B 19,0 ± 6,5 aAB 11,0 ± 0,0 aA P<0,05 P>0,05 P<0,05 P>0,05 P>0,05
17. Discussão
Nossos resultados mostraram que, apesar das células MG-63 apresentarem receptores de E2 (ER+) e receptores de HT (TR+), quando tratada com T3 isolado não houve diferença significativa em relação ao seu crescimento. Porém, o tratamento com E2 isolado foi o único que causou alteração no TD, sendo maior nas dosagens supra e infrafisiológicas, em relação ao grupo controle (sem tratamento). Embora as células SaOs-2 sejam ER+, o tratamento com estrógeno isolado não alterou o TD de forma significante, e a ausência do TR fez com que o T3 também não alterasse o crescimento celular. Apesar das células MG-63 e SaOs-2 possuírem ERα e -β, e de estudos (Nikitovic et al., 2003) que mostram que a expressão destes receptores é maior nas células MG-63 quando comparadas às SaOs-2, a linhagem MG-63 mostra uma diminuição da proliferação quando tratadas com as doses supra e infrafisiológica isoladas de E2. De alguma forma o estrógeno está provocando uma resposta negativa na ativação da transcrição de genes que regulam a proliferação celular. Fica difícil explicar o mecanismo pelo qual a dose fisiológica de E2 não altera o crescimento celular, em relação ao grupo sem tratamento hormonal. Como a
adição somente de T3 ao meio de cultura não agiu na proliferação das células MG-63, que são positivas para TR, poderíamos questionar se esse receptor é funcional.
Notamos que, nas associações hormonais do estrógeno com diferentes concentrações de T3, passamos a observar diferença no tempo de dobramento. O E2 supra ou infrafisiológico nas células MG-63, juntamente com o T3 (em quaisquer dosagens) provoca diminuição no tempo de dobramento em relação às suas respectivas dosagens isoladas (E2 supra ou E2 infra). Já nas células SaOs-2, essas combinações de tratamentos fazem com que o TD fique maior do que aquele apresentado pelo E2 (supra ou infra) isolado. Estes resultados poderiam ser explicados envolvendo múltiplos padrões regulatórios: funcionalidade do TR, regulação transcricional não clássica pelo ER e atividade não genômica do ER.
Em relação às células MG-63, poderíamos levantar a seguinte hipótese: • Ação do hormônio tireóideo e estrógeno ativando seus receptores: se o TR for funcional, poderíamos explicar estes resultados em função das células MG-63 apresentarem receptores para E2 e T3, fazendo com que estes hormônios atuem de forma sinérgica na diminuição do TD, agindo em seus receptores.
• Ação do hormônio tireóideo ativando o receptor de estrógeno: provavelmente neste momento, a ligação do T3 ao seu receptor estaria ativando o ERα, via fosforilação através da MAPK, uma vez que, quando adicionado ao meio isoladamente não causou diferença estatisticamente significante no TD. Esta mesma via também induz a ativação da transcrição da oncoproteína p53, que é fosforilada várias vezes, aumentando sua expressão (Yun-Lin et al., 2005). O resultado das ativações, tanto do ER como da proteína p53, seria a proliferação celular. Esta mesma proliferação foi encontrada por nós,
quando tratamos as células MG-63 com a combinação de E2 supra ou infrafisiológico associado ao T3.
Em relação às células SaOs-2, poderíamos levantar a seguinte hipótese: • Nos tratamentos isolados com E2 e T3 não há diferença no tempo de dobramento, enquanto as associações dos hormônios mostram diminuição na proliferação celular, evidenciando uma interação que também causa diminuição da transcrição gênica. Tang et al., 2004, mostrou que seria possível que, no contexto de níveis circulantes constantes de E2 endógeno, os estados clínicos de hiper ou hipotireoidismo possam alterar o impacto do E2 em certos órgãos alvo. Portanto, na ausência de estrógeno ou em um ambiente de uma concentração constante de estrógeno, mudanças clinicamente importantes nos níveis de T3 (hipo ou hipertireoidismo) podem resultar em alterações funcionais que são semelhantes ao estrógeno (hipo ou hiperestrogenismo, respectivamente) em seus efeitos. Entretanto, os mecanismos pelos quais estas ações ocorrem não ficam estabelecidos.
Outros pesquisadores relatam que linhagens celulares distintas apresentam diferentes respostas a ações hormonais. Estas respostas são afetadas por variáveis que incluem número da passagem, confluência, densidade, polaridade, substratos, estado nutricional e tensão de oxigênio (Farach-Carson, 2004). Endho et al., 1997, mostrou que as células ósseas podem ser afetadas por diversos parâmetros, como o estado de diferenciação celular.
Permanece difícil a explicação do motivo pelo qual a dose fisiológica de E2 associada às diferentes concentrações de T3 não alteram a proliferação celular.
Há evidências que, no câncer, o ER não age sozinho para estimular o crescimento tumoral, mas uma interação de cadeias opera para assegurar a viabilidade destas células (Osborne & Schiff, 2005).
Desta forma, a análise da presença de receptores hormonais nas células ósseas torna-se importante para a verificação do potencial de crescimento que elas possam apresentar. Cuidados especiais devem ser tomados em relação àquelas que apresentem receptores hormonais tanto para T3 como para E2, o que pode incrementar o crescimento tumoral. Como um pico de incidência do osteossarcoma é encontrado após os 50 anos, onde há predominância de mulheres menopausadas, precauções devem ser tomadas quanto à falta de estrógeno (dose infrafisiológica) ou à administração de doses suprafisiológicas deste hormônio durante terapia de reposição hormonal. Foi justamente nestas duas dosagens que encontramos, nas células MG-63, maior proliferação celular, podendo resultar no desenvolvimento de osteossarcomas.
18. Conclusões
1. Quando tratadas somente com estrógeno, as células MG-63 aumentam o TD quando em doses supra ou infrafisiológicas. Na linhagem SaOS-2 não há diferença no TD quando submetidas a este tratamento.
2. O tratamento somente com hormônio tireóideo não promoveu alteração no TD nas duas linhagens celulares.
3. Nas células SaOs-2, as associações hormonais nos grupos E2 supra e E2 infra com diferentes dosagens de T3, há aumento no TD em relação ao estrógeno isolado.
4. Nas células MG-63, as mesmas associações provocam diminuição do TD.
19. Resumo
Tumores ósseos malignos respondem por 4 a 6% da ocorrência de câncer durante a infância e adolescência em muitos países europeus, sendo que o osteossarcoma corresponde a 50% de todos os casos, com um pico de incidência adicional após os 50 anos. Recentemente foi observado que vários pacientes com sarcoma apresentavam também algum tipo de disfunção tireoideana, sendo o hipotireoidismo a alteração mais freqüente.
Dados da literatura mostram a atividade do hormônio tireóideo e do estrógeno na regulação de oncogenes e genes supressores de tumores em células de osteossarcoma, e também relatos clínicos sugerindo o envolvimento hormonal com o desenvolvimento de tumores ósseos. Desta forma, verificamos a ação isolada e conjunta destes hormônios, em diferentes concentrações, sobre a proliferação de células ósseas tumorais de humano (MG-63 e SaOs-2), através da realização de uma curva de crescimento para obtenção do tempo de dobramento.
Nossos resultados evidenciaram que o tratamento isolado com T3 não afetou a proliferação celular em nenhuma das linhagens utilizadas. Apenas o crescimento das células MG-63 é diminuído pelo tratamento com estrógeno isolado, sendo as doses supra e infrafisiológicas as responsáveis pela diminuição na proliferação celular.
A associação dos hormônios provoca efeitos contrários nas duas linhagens, mas as associações do E2 fisiológico com as diferentes concentrações de T3 não alteram a proliferação celular. As células MG-63 respondem com diminuição do TD nas associações de estrógeno supra e infrafisiológico com as diferentes doses de T3, em comparação ao tratamento isolado com estrógeno, nas mesmas dosagens. Nas células SaOs-2, as associações hormonais nos grupos E2 supra e E2 infra com diferentes dosagens de T3, há aumento no TD em relação ao estrógeno isolado.
Vários mecanismos de ação hormonal podem justificar essas respostas e salientam a necessidade da análise dos receptores hormonais nos tumores ósseos.
20. Abstract
Malignant bone tumors account for 4 to 6% of all cancer cases occurring during infancy and adolescence in many European countries, with osteosarcoma corresponding to 50% of all cases with another incidence peak in the over 50’s. Recently it has been seen that several patients with sarcoma also had some type of thyroid dysfunction, hypothyroidism being the most common.
Literature reports thyroid hormone and estrogen activity in regulation of oncogenes and tumors suppressor genes in osteosarcoma cells, and also clinical reports suggesting hormonal involvement in bone tumor development. Therefore we verify the isolated and joint action of these hormones at different concentrations on proliferation of MG-63 and SaOs-2 human bone tumors cells through a growth curve to obtain doubling time.
Our results had evidenced that the treatment with T3 only did not affect the cellular proliferation in none of the used line cells. Just the growth of the MG-63 cells
is decreased by the treatment with estrogen only, and the doses supra and infraphysiological the responsible ones for the reduction in the cellular proliferation.
The association of hormones provokes contrary effect in the two line cells, but the associations of the physiological E2 with the different concentrations of T3 do not modify the cellular proliferation. The MG-63 cells increased the proliferation in the estrogen associations supra and infraphysiological with the different doses of T3, in comparison to the isolated treatment with estrogen, in the same dosages. In the SaOs-2 cells, the hormonal associations in the E2 groups supra and infraphysiological with different dosages of T3, has increase in the DT in relation to the isolated estrogen.
Some mechanisms of hormonal action can justify these answers and point out the necessity of the analysis of the hormonal receptors in bone tumors.
21. Referências Bibliográficas Normas para publicações da UNESP.
BARRERA-HERNANDEZ, G., ZHAN, Q., WONG, R., CHEN, S.Y. Thyroid hormone receptor is a negative regulator in p53-mediated signaling pathways. DNA Cell Biol, v.17, p.743-50, 1998.
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ENDHO, H., SASAKI, H., MARUYAMA, K., TAKEYAMA, K., WAGA, I., SHIMIZU, T., KATO, S., KAWASHIMA, H. Rapid activation of MAP kinase by estrogen in the bone cell line. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 235, p.99-102, 1997.
FARACH-CARSON, M.C. Challenges in understanding the continuum of action of steroid and thyroid hormones. Curr. Opin. Endocrimol. Diabetes, v. 11, p.226-230, 2004.
